*Proteina_Lowry.pdf

METODO LOWRY PARA DETERMINAR PROTEINA
(antes Rick, 1956)
Preparación de las soluciones
Solución prestock:
Disuelve 4 g de NaOH + 30 g de Na2CO3. Afora con
agua destilada a 1 L (guardar a temperatura ambiente).
Tartrato de Sodio y Potasio 4% (wv):
Disuelve 4g de KNaC4H4O6 . 4H2O y afora con agua
destilada a 100ml (guardar en refrigerador).
Sulfato cúprico 2% (wv):
Disuelve 2g de CuSO2 y afora con agua destilada a
100ml (guardar a temperatura ambiente).
Solución estandar:
Albumina de suero bovino (BSA) 0.2 mg/ml.
Disuelve 20 mg y afora a 100 ml con agua
destilada.Dividir alicuotas y guardar en tubos pequeños
en el congelador.
Reactivo de Folins:
Producto comercial
METODO LOWRY PARA DETERMINAR DE PROTEINA
(antes Rick, 1956) cont.
Solución Lowry A:
Mezcla 1 ml de solución de tartrato de NaK + 1 ml de solución CuSO2 afora con solución
pre-stock a 100 ml. Nota: respeta el orden de adición de las soluciones para evitar
formación de precipitados. La cantidad de nuestra a preparar es de acuerdo al número de
muestras a procesar.
Solución Lowry B:
Diluir Reactivo Folin 1:1 con agua destilada. Calcular la cantidad a preparar según las
muestras procesadas diarias. Esta solución se dura solo un día.
Espectrofotómetro:
Prender el espectrofotómetro 45min con anterioridad. Coloca los datos para lectura:
Task/Quantification/Set-up
WAVELENGTHS
Use wavelength 660 nm
Background correction none
CALIBRATION
Analytic name bsa
Calibration curve type Lineal Off Set
ENTER CONCENTRATION
• Concentration
ug Units
Weigth & Volume
Weigth_/_ Volume Units
_Prompt for standard information
_Prompt for standard information
DATA TYPE
DISPLAY SPECTRUM
Absorbance
From_nm To_nm
Una vez incluido todos los datos presiona OK para que queden registrados.
Preparación de la muestra:
Cuenta y lava las larvas (mínimo 10) con agua destilada (almacenar a -20ºC o procesar
inmediatamente)
Homogeniza la muestra con tris buffer (500ml*2), en baño frío.
Centrifugar a 12000rpm, 4ºC, 3 min
Separar sobrenadante (975µl)
Colocarlo en tubos eppendorf y almacenalos en congelación (-20ºC) o procesarlo. No
almacenar por más de 6 meses. Esta muestra puede ser de la misma que se uso para
determinar Tripsina.
Leer por triplicado
METODO LOWRY PARA DETERMINAR DE PROTEINA
(antes Rick, 1956) cont.
Curva estandar:
Número
tubo
Vol (µl) BSA
0.2 mg/ml
Vol (µl)
agua dest.
Vol (µl)
Lowry A
Vol (µl)
Lowry B
1
0
250
1000
125 *
2
0
250
1000
125 *
3
25
225
1000
125 *
4
25
225
1000
125 *
5
50
200
1000
125 *
6
50
200
1000
125 *
7
75
175
1000
8
75
175
1000
9
100
150
1000
10
100
150
1000
125 *
11
125
125
1000
125 *
12
125
125
1000
125 *
13
150
100
1000
125 *
14
150
100
1000
125 *
15
175
75
1000
125 *
16
175
75
1000
125 *
17
200
50
1000
125 *
18
200
50
1000
125 * *
Agitar y
dejar
reposar
por 10
min
125 *
125 *
125 *
Dejar un
lapso de 30
seg* entre
muestras
µg
proteína
Al
agregarle
al último
tubo se
dejan
reposar a
completar
20 min*
Ejm:
con el
estandar al
agregar
Soln B al
último tubo
el primero
lleva 17
min,
entonces
solo
reposará 3
min para
leer el
primer
tubo.
Leer las
muestras
cada 30
seg
0
0
5
5
10
10
15
15
20
20
25
25
30
30
35
35
40
40
Una vez leidas todas las muestras del estandar se escriben µg proteína en la columna de
bsa (µg) y se presiona Calibrate. Si algun punto sale de la recta se puede eliminar. No se
deben eliminar más de tres puntos. Show Coefficient muestra el comportamiento de la
curva estandar:
Calibration Results Summary
_______________________________________
_______________________________________
Analytical Name
bsa
Coefficient k1
483.36000
Number of Standards
18
Std. Dev of k1
7.86500
Calibration Curve
C=k0+(k1*A)
Std. Dev of Calibrat
4.44680
Coefficient k0
-16.13300 µg
Correl. Coeff. (Rˆ2)
0.99578
_______________________________________
_______________________________________
El valor de Correl. Coeff. (Rˆ2) debe acercarse lo más posible a 1 sin rebasarlo.
Despues de esto se pueden correr las muestras
Leer por triplicado
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Lectura de las muestras:
Diluir 1:0.5 (muestra:buffer) para completar a 300 µl de muestra (sobrenadante). Para
leer por triplicado. El proceso de preparación es igual que el de la curva estandar.
El valor del blanco (buffer [tris base pH 8] con el cual se hizo la dilución arriba
mencinada) se restará de las lecturas de las muestras para corregir los resultados.
Solución
Vol (µl)
muestra
Vol (µl)
agua dest.
Vol (µl)
Lowry A
Muestra
sobrenadante
100
150
1000
Blanco
buffer
100
250
1000
Agitar y
dejar
reposar
por 10
min
Vol (µl)
Lowry B
*
125 *
125
**
* Dejar un lapso de 30 seg* entre muestras.
Al agregarle al último tubo se dejan reposar a completar 20 min*.
Leer las muestras cada 30 seg.
El software da directamente la cantidad de proteína en la alícuota medida. Para obtener
la concentración en mg/ml hay que dividir la lectura entre la alícuota y multiplicar por el
factor de dilución.
Para salvar los valores:
File/Print to file/Current View/nombre.txt
Para imprimir:
File/Print /Current View