REDVET. Revista electrónica de Veterinaria 1695-7504 2010 Volumen 11 Número 03

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REDVET. Revista electrónica de Veterinaria 1695-7504
2010 Volumen 11 Número 03
REDVET Rev. electrón. vet. http://www.veterinaria.org/revistas/redvet -http://revista.veterinaria.org
Vol. 11, Nº 03, Marzo/2010– http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n030310.html
Hallazgo de Ehrlichiosis canina causada por E. canis en
una Comunidad del Municipio de León, Nicaragua
Find of canine Ehrlichiosis caused for E. canis in a
Community of León's Municipality, Nicaragua)
Vanessa Rivas Lara;
Daniel Morales Arancibia; Milton
Saenz; José Luis Bonilla.
Centro Veterinario de Diagnóstico e
Investigación (CEVEDI), Dpto. Sanidad
Animal,
Escuela
de
Veterinaria,
Universidad
Nacional
Autónoma
de
Nicaragua, León (UNAN - LEÓN)
Tutor principal: MSc. José Luis Bonilla, DMV.
Microbiología e Inmunología Veterinaria Director CEVEDI Dpto.
Sanidad Animal Escuela de Veterinaria UNAN-LEON e-mail:
[email protected] , [email protected]
Resumen
La ehrlichiosis es una enfermad producida por bacterias intracelulares
obligadas del género Ehrlichia que en los canes (Canis familiaris) se
caracteriza por pancitopenia. El objetivo del presente trabajo es dar a
conocer la situación de la Ehrlichiosis canina en una comunidad del
municipio de León, mediante una evaluación sanguínea, tinción y
detección serológica a través de un test inmunocromatográfico.
Materiales y Método: Tamaño y toma de muestra; El estudio se
realizó en 27 caninos (Canis familiaris) tomados al azar pertenecientes
a la Comunidad Rubén Darío, Municipio de León. Se realizó la toma de
muestra de sangre entera mediante venopunción cefálica y se depositó
en tubos con y sin EDTA. Las muestras fueron remitidas al Centro
Veterinario de Diagnóstico e Investigación (CEVEDI) de la Escuela de
Veterinaria UNAN-LEON. Análisis de las muestras; A todas las muestras
se les realizó Biometría Hemática Completa (BHC), extendido periférico
y una prueba rápida para la detección de Ehrlichia canis. Resultados:
De un total de 27 muestras se encontró un 70% de los animales con
valores bajos de hematocrito, un 77,7% tenía los niveles de
hemoglobina por debajo del parámetro fisiológico y el 85% de los
casos presentó un conteo eritrocitario bajo de lo normal. En el
extendido periférico no se identificaron cuerpos de inclusión
intracitoplasmático en eritrocitos o leucocitos compatibles con
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León, Nicaragua
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Ehrlichia. A las 27 muestras se les realizó también un ensayo
inmunocromatográfico (SNAP) donde se detectó E. canis en un 63% de
los casos. Conclusiones: La mayoría de los animales presentó valores
de hematocrito, hemoglobina y conteo eritrocitario por debajo de los
parámetros fisiológicos. No se observaron cuerpos de inclusión
intracitoplasmáticos compatibles con erhlichia en trombocitos y
monocitos con la tinción de Giemsa. Se detectaron anticuerpos frente a
Ehrlichia canis, mediante el test inmunocromatográfico.
Palabras claves: Ehrlichia canis, perros (Canis
inmunocromatografía, biometría hemática completa.
familiaris),
Abstract
The ehrlichiosis is a disease produced by intracellular bacteria forced of
the kind Ehrlichia that in the dogs (Canis familiaris) is characterized for
pancytopenia. The aim of the present work is to announce the situation
of the canine Ehrlichiosis in a community of León's municipality, by
means of a blood evaluation, tint and serologic detection across an
immunochromatographic test. Materials and Method: Size and
capture of sample; the study were carried out in 27 dogs (Canis
familiaris) taken at random belonging to the Community Ruben Dario,
León's Municipality. There was realized the capture of sample of entire
blood by means of cephalic venopuntion and settled in pipes with and
without EDTA. The samples were sent to the Veterinary Center of
Diagnosis and Research of the School of Veterinary, UNAN-LEON.
Analysis of the samples; To all the samples they there was realized
Complete Biometry Blood, extended peripheral and a rapid test for the
detection of Ehrlichia canis. Results: Of 27 samples be found 70 % of
the animals with low values of hematocrite, 77,7 % had the levels of
hemoglobin below the physiological parameter and 85 % of the cases
presented a count red blood low of the normal thing. In the widespread
peripheral bodies of inclusion were not identified intracitoplasmic in red
blood or leukocytes compatible with Ehrlichia. To 27 samples (SNAP)
realized also an immunochromatographic test where it was detected E.
canis in 63 % of the cases. Conclusions: The majority of the animals
presented values of hematocrite, hemoglobin and count red blood
below the physiological parameters. Bodies of inclusion were not
observed intracitoplasmatics compatible with Erhlichia in trombocites
and monocites with Giemsa's tint. Antibodies were detected opposite to
Ehrlichia canis, by means of the immunochromatographic test.
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Keys
Words:
Ehrlichia
canis,
dogs
(Canis
immunochromatographic test, complete biometry blood.
familiaris),
Introducción
La Ehrlichiosis es una enfermedad causada por una bacteria
intracelular obligada, Gram positiva, que requiere de un mamífero
como reservorio y de un artrópodo como vector. Presenta tropismo por
células sanguíneas (leucocitos y plaquetas) de animales y humanos, e
invade su citoplasma, alojándose dentro de vacuolas, donde se
multiplica por fisión binaria, dando origen a un agregado de la bacteria
o microcolonia, que por su apariencia se ha denominado "mórula"
(Pérez et al., 2006).
Actualmente este género comprende cinco especies, de las cuales
Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis y Ehrlichia ewingii
tienen la
capacidad de causar enfermedad en caninos y humanos (Buller et al.,
1999; Pérez et al., 2006). Ehrlichia canis es la especie representante
del género y es el agente clásico causante de la ehrlichiosis monocítica
canina o pancitopenia tropical canina, importante no sólo por su amplia
distribución en el trópico y subtrópico de todo el mundo, sino también,
por el hallazgo de afectación de humanos (Pérez et al., 2006). E
chaffeensis fue inicialmente reportada en infecciones en humanos y
posteriormente en caninos, mientras que E. ewingii se encontró en
granulocitos de perros enfermos y más tarde de forma inesperada en
muestras de humanos, existiendo hasta el momento evidencia
molecular de estos últimos dos agentes únicamente en Estados Unidos,
además de un reporte de E. ewingii en perros de Camerún.
Para el diagnóstico de la ehrlichiosis se emplean diversas técnicas
laboratoriales como la identificación de cuerpos de inclusión en frotis
sanguíneos, el aislamiento primario mediante cultivo celular, la
detección de anticuerpos, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
y la secuenciación.
La evaluación microscópica de cuerpos de inclusión en frotis
sanguíneos resulta una técnica rápida, sencilla y económica, sin
embargo, aproximadamente sólo en un 4% de los casos agudos es
posible demostrar la mórula intracitoplasmática de E. canis (Waner y
Harrus, 2000), mientras que para las demás especies no se reporta la
eficacia de la prueba.
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En el caso del aislamiento in vitro de Ehrlichia, E. canis y E. chaffeensis
han logrado cultivarse en la línea celular macrófago-monocítica canina
DH82, derivada de un caso de histiocitosis maligna canina (Dawson et
al., 1991); sin embargo, E. ewingii no ha sido posible de aislar hasta la
fecha (Dawson et al., 1996; Dumler et al., 2001). Desventajas
importantes del aislamiento en cultivo celular, son la necesidad de
experiencia técnica y períodos prolongados de hasta 34 días para la
obtención de resultados (Waner & Harrus, 2000; Standaert et al.,
2000; Iqbal et al., 1994), lo que convierte a esta técnica en un proceso
costoso, laborioso e impráctico para el diagnóstico oportuno de la
enfermedad. El aislamiento en cultivo celular es considerado, sin
embargo, como la “prueba de oro” para el diagnóstico de ehrlichiosis.
Las técnicas serológicas han sido ampliamente utilizadas en el
diagnóstico de ehrlichiosis debido a que son pruebas altamente
sensibles; sin embargo, presentan la desventaja de que únicamente
evidencian un contacto con el agente sin determinar la existencia de la
enfermedad o incluso la presencia o ausencia actual del agente en el
animal (Iqbal et al., 1994; Dawson et al., 1996; Murphy et al., 1998).
Otra desventaja importante en el diagnóstico serológico, es el alto
grado de reacción cruzada existente entre E. canis, E. chaffeensis y E.
ewingii (Liddell et al., 2003); que dificulta la diferenciación entre
especies (Waner et al., 2001) y para el caso de E. ewingii, no existen
pruebas específicas disponibles, por no haberse logrado aún ningún
aislamiento del agente en cultivo celular.
En relación a las técnicas moleculares, diversos estudios han mostrado
a la técnica de PCR como un método efectivo y extremadamente
sensible para la detección de especies de Ehrlichia, incluyendo a E.
ewingii (Ndip et al., 2005). La técnica de PCR convencional basado en
la amplificación de regiones del gen 16S ARNr de Ehrlichia ha
demostrado efectividad en muestras de sangre de humanos y perros,
con un límite de detección de 20pg para ADN de E. canis extraído de
células DH82 infectadas (Iqbal et al., 1994; Dawson et al., 1996), y se
han obtenido aún mejores resultados, utilizando una técnica de PCR
tipo anidado, que ha incrementado la sensibilidad de la prueba hasta
0.2 pg de ADN (Wen et al., 1997). Además, la técnica de PCR tipo
anidado ofrece la ventaja de poder determinar las especies E. canis, E.
chaffeensis y E. ewingii utilizando el mismo producto de la primera
reacción. Esta técnica de PCR anidado, ha demostrado ser útil para el
diagnóstico de ehrlichiosis en distintas partes del mundo como Israel,
España, Estados Unidos y México (Aguirre et al., 2004; Hori-Oshima et
al., 2006), ya sea para diagnosticar los agentes en muestras de
humanos, venados, perros, garrapatas y coyotes (Kocan et al., 2000).
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Otra ventaja es, la capacidad de la prueba para detectar a los agentes
aún en la fase temprana de la enfermedad y en la fase subclínica,
permitiendo determinar animales portadores, incluso cuando no se ha
logrado establecer aún una respuesta inmune (Standaert et al., 2000),
permitiendo iniciar el tratamiento incluso antes de la manifestación de
signos clínicos.
Estudios sobre ehrlichiosis en caninos de Nicaragua son bastante
escasos. Aspectos epidemiológicos de relevancia, tales como
prevalencia, y especies involucradas son aún poco comprendidos.
Igualmente, se desconoce si la misma especie de ehrlichia que afecta a
los caninos podría estar asociada a procesos febriles en humanos que
han sido negativos por diagnóstico laboratorial a malaria, dengue,
leptospirosis, entre otras. Por lo que el objetivo del presente trabajo es
dar a conocer el hallazgo de Ehrlichia canis en perros de la comunidad
Rubén Darío del municipio de León, mediante una evaluación
sanguínea, tinción y detección serológica a través de un test
inmunocromatográfico.
Material y Método
Tamaño y toma de muestra. Un total de 27 muestras sanguíneas
fueron tomadas aleatoriamente por venopunción cefálica y periférica
(oreja) en caninos (Canis familiaris). Los perros tenían aptitud de
compañía con un estado nutricional regular (desperdicios de cocina) en
su mayoría, casi todos los canes tenían presencia de ectoparásitos
(garrapatas); pero aparentemente no presentaban ningún estado
patológico, ya que tenían un buen estado de alerta. Es importante
mencionar que se tuvo el consentimiento de los propietarios para
realizar dicho trabajo, tomando en cuenta las buenas prácticas de
asepsia y antisepsia a la hora de la toma de muestra por venopunción,
el cualse realizó en casa de habitación de cada uno de los animales.
Las muestras se depositaron en tubos con y sin EDTA y fueron
remitidas al Centro Veterinario de Diagnóstico e Investigación
(CEVEDI), laboratorio de Biopatología de la Escuela de Veterinaria,
UNAN-LEON.
Análisis de las muestras. A todas las muestras se les realizó
Biometría
Hemática
Completa
(BHC)
tomando
en
cuenta
principalmente los valores de Hematocrito, Hemoglobina y niveles de
eritrocitos; en el extendido periférico se valoró la presencia de cuerpos
de inclusión compatibles con ehrlichia y finalmente a todas las
muestras se les realizó una prueba rápida para la detección de
Ehrlichia canis.
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La BHC se realizó según el Manual Práctico de Análisis Clínico en
Veterinaria (Marca A., 1992). El frotis de sangre periférica se tiñó con
Giemsa. Primeramente el extendido es fijado con metanol (100%)
dejándose 5 minutos a temperatura ambiente, luego se tiñó con
solución Giemsa a razón de 3 ml de solución Giemsa diluido en 8 ml de
agua destilada y se dejó 15 minutos secándose a temperatura
ambiente, finalmente se lavó con agua de grifo y se dejó secar para
posteriormente ser observado al microscopio con un lente de 100X con
aceite de inmersión (Marca A., 1992). Para la prueba serológica se
utilizó un kit
inmuncromatográfico canino para la detección de
anticuerpos contra E. canis de IDEXX Laboratories, se les realizó a las
27 muestras, utilizándose sangre total con anticoagulante o suero y el
procedimiento se llevó a cabo según las indicaciones del kit comercial.
Resultados y Discusión
De un total de 27 muestras de sangre completa con y sin EDTA
recolectadas, se encontró un 70% de los animales con valores bajos de
hematocrito, un 77,7% tenía los niveles de hemoglobina por debajo
del parámetro fisiológico y el 85% de los casos presentó un conteo
eritrocitario bajo de lo normal, tal como se muestra en la tabla 1. En
base a los resultados obtenidos en la BHC se muestra una disminución
marcada de los valores hematológicos (Hematocrito, hemoglobina y
Glóbulos Rojos) lo que significa que los pacientes caninos en su
mayoría presentaban síntomas de anemia.
Tabla 1. Valores Hematológicos
(Hematocrito, Hemoglobina y
Glóbulos Rojos) y serología
encontrados en caninos (Canis
familiaris) muestreados en la
comunidad
Rubén
Darío,
Municipio de León.
Tabla 2. Cantidad y Porcentaje
de caninos (Canis familiaris)
positivos
al
test
Inmunocromatográfico.
Técnica
positivos
Microscopía
0/ 27
Serología
17/ 27
Porcentaje
0%
63%
Hematocrito Hemoglobina Glóbulos Rojos Inmunocromatografía
Nº Caso
Rango fisiológico
37-55 (%)
12
12-18,0 (g/ dl) 5,5-8,5 (10 / l)
1
30
10
2,62
2
44
14,6
0,31
3
32
10,6
2,54
4
36
12
3,12
5
37
12,3
3,61
6
34
11,3
0,91
7
30
10
3,25
8
36
12
3,28
9
26
8,6
1,21
10
38
12,6
5,7
11
35
11,6
3,54
12
31
10,3
5,08
13
39
13
3,15
14
40
13,3
4,86
15
32
10,6
2,19
16
30
10
5,77
17
28
9,3
2,19
18
28
9,3
6,33
19
22
7,3
3,19
20
34
11,3
3,58
21
45
15
3,51
22
29
9,6
1,01
23
22
7,3
3,9
24
30
10
1,02
25
26
8,6
1,75
26
20
6,6
1,48
27
41
13,6
3,07
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De las 27 muestras que se les realizó el frotis del extendido periférico
teñidos con Giemsa, ninguno presentó cuerpos de inclusión dentro de
plaquetas ni monocitos compatibles con Ehrlichia; según trabajos
realizados en otras localidades hacen referencia a la sensibilidad baja
de la técnica de tinción, lo que difulta evidenciar hemoparásitos por
métodos convencionales de parasitología o biopatología, necesitándose
para esto una alta parasitemia en el individuo; así lo confirma también
estudios realizados en Costa Rica donde han utilizado por mucho
tiempo técnicas microscópicas y que a pesar de ser muy útiles
presentan baja sensibilidad (Rímolo, 2006). Cabe mencionar que la
muestra de los caninos fueron tomados aleatoriamente sin tomar en
cuenta la edad, el sexo y la raza; Sin embargo todos presentaban
ectoparásitos (garrapatas) unos en cantidades moderadas y otros en
abundancia, esto pudo ser debido a las condiciones de la localidad, ya
que es una comunidad donde las calles son de tierra, existen muchos
árboles y no hay un buen sistema de alcantarillado (aguas residuales).
Finalmente a las 27 muestras que se les realizó el ensayo
inmunocromatográfico un total de 17 (63%) muestras resultaron
positivas a la prueba. Esto demuestra que el ensayo serológico es
mucho más sensible. Es muy importante tomar en cuenta que ésta
prueba (inmunocromatografica) es de tipo serológica y por ende puede
presentar ciertas limitantes, como la imposibilidad de discernir entre
una infección inicial, aguda, latente, crónica o pasada, ya que detecta
anticuerpos (Iqbal et al., 1994; Dawson et al., 1996; Murphy et al.,
1998).
Estudios similares han demostrado la presencia de E. canis en perros,
como el de Costa Rica, donde se identificó a 8 de 30 perros
seropositivos mediante serología SNAP 3X IDEXX (Luis Romero, 2007).
Conclusiones
La mayoría de los animales presentó valores de hematocrito,
hemoglobina y conteo eritrocitario por debajo de los parámetros
fisiológicos.
No se observaron cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos compatibles
con erhlichia en trombocitos y monocitos con la tinción de Giemsa.
Se detectaron anticuerpos frente a Ehrlichia canis, mediante el test
inmunocromatográfico.
Es importante valorar en estudios posteriores la relación que pueda
tener E. canis detectada en el hombre, ya que por ser animales de
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compañía se mantienen en estrecha relación, así como la presencia de
garrapatas, así lo demuestra un estudio realizado en Venezuela donde
se detectó la presencia en sangre humana del ADN del
microorganismo, diagnosticado morfológicamente como Ehrlichia
trombocítica, utilizando la prueba de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), observándose una migración electroforética igual a
la de Ehrlichia platys, conocido agente de Ehrlichiosis trombocítica
canina en el campo veterinario (Tamí I, Jordán L, 2002).
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REDVET: 2010, Vol. 11 Nº 03
Recibido: 09.11.09 – Ref. prov. NOV0919B – Revisado: 22.12.09 - Aceptado: 28.01.10
Ref. def. 031002_REDVET - Publicado: 01.03.2010
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Hallazgo de Ehrlichiosis canina causada por E. canis en una Comunidad del Municipio de
León, Nicaragua
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