8.19_lozano ana - Universidad Autónoma de Querétaro

EVALUACIÒN DEL DESARROLLO MICROBIANO Y COMPORTAMIENTO A
DIFERENTES CONDICIONES DE Leuconostoc mesenteroides.
Lozano Rodríguez Ana Gabriela(1); Arvizu Medrano Sofía(2); Padilla Frausto J. J. (2);
Pérez Alma G. (1); Ibarra Vallejo Johana L.(3)
(1) Facultad de Ciencias Químicas
Universidad Autónoma de Querétaro
(2) Posgrado de Química en Ciencia y Tecnología de alimentos
Universidad Autónoma de Querétaro
(3) Escuela de Ciencias Biológicas
Universidad Autónoma de Coahuila
RESUMEN
El deterioro microbiano en productos cárnicos embutidos, es debido principalmente a
Leuconostoc mesenteroides, una bacteria acido láctica, cuyo desarrollo en el producto, tras
condiciones inadecuadas de almacenamiento, genera la aparición de liquido lechoso e
hinchazón del empaque, en el que es comercializado. La adición de conservadores como la
Nisina y ácidos orgánicos, en la formulación de la salchicha, representa una medida de
control, que le provee de estabilidad durante la vida de anaquel del producto empacado al
vacio. En este estudio se evaluó y analizó el desarrollo microbiano bajo diferentes
combinaciones de conservador. Mediante un diseño factorial completamente aleatorizado se
estudio el efecto de tres factores; 1) Cepa: 5 cepas de Lc. mesenteroides recuperadas de
producto deteriorado y empresa empacadora; 2) Conservador: Nisina (10ppm), Acido Láctico
(5%), Acido Cítrico (5%), mezcla Nisina-Acido Láctico y una Mezcla Nisina-Acido Cítrico;
pH: 5, 5.5 y 6, dado el nivel de pH de la salchicha empacada al vacio. Por triplicado, se
inoculo (104 células/mL) caldo MRS con el tratamiento indicado. Los resultados comparados
con estudios previos, permitieron evidenciar que tanto la Nisina como los ácidos orgánicos a
la concentración evaluada, son eficientes para controlar el desarrollo de Lc. mesenteroides en
caldo de cultivo. Fue posible observar la heterogeneidad en comportamiento que suponen las
diferentes cepas evaluadas. El pH supone franco efecto sobre el desarrollo en el medio de
cultivo aun si conservador, siendo el pH 6 el presento menor efecto. La el tratamiento con
Nisina a 10ppm, sugiere una alternativa viable para el control de deteriorador en embutidos,
sin embargo se sugiere evaluar su efecto sobre Lc. mesenteroides, al ser incluido en la
formulación de la salchicha.
INTRODUCCIÒN
Los productos cárnicos cocidos no son productos estériles, sin embargo, es posible elaborarlos
con un mínimo de carga microbiana hasta su empaque, limitando su desarrollo en
comercialización, mediante refrigeración (Fernandez-Escartin, 2009). Típicos ejemplos de
este grupo son las salchichas. La carne de res, cerdo y/o pavo, son sus principales
componentes, entre otros ingredientes, en los que se incluyen tejido adiposo animal, agua,
especias y aditivos como sal común. Desde la obtención de sus materias primas, los productos
cárnicos presentan elevada carga microbiana (Buchanan, et al., 1986). El proceso de cocción
de la salchicha aun cuando se realiza a temperaturas superiores a los 70°C, no representa una
medida efectiva para abatir la incidencia de bacterias acido lácticas (BAL) en el producto
(Von Holy, A., 1992). Su composición química (agua (aw=0.98), carbohidratos, lípidos y
proteínas), la convierte en un excelente sustrato para sostener el desarrollo de BAL, en
refrigeración y atmósfera reducida en oxigeno (Chung King-Thom. (1989). En estudios
previos, se ha encontrado que las BAL son el grupo predominante en productos embutidos
deteriorados. El género Leuconostoc destaca por su potencial deteriorador en productos
empacados al vacio, almacenados en refrigeración. Se ha demostrado que Lc. mesenteroides,
1
Lc. lactis y Lc. fallax, son responsables de la gasificación, agriado y presencia de liquido
viscoso y lechoso en salchicha empacada al vacío. Existen innumerables factores que logran
una inhibición de la flora microbiana, como lo son altas y bajas temperaturas, pH y aw, así
como, alta presión hidrostática y la adición de agentes químicos conservantes, lo que es
indispensable para procurar la estabilidad del producto en el mercado.
El control de microorganismos patógenos (como L. monocytogenes) es viable
mediante la adición de conservadores comerciales de origen natural, que comúnmente utiliza
la industria, en los que destacan los productos a base de Nisina y ácidos orgánicos. Sin
embargo, estudios previos evidenciaron que a las concentraciones recomendadas por el
productor e incluidos en la formulación de la salchicha, estos presentan escaso efecto sobre
especies de Leuconostoc (Cepeda-Márquez, et al., 2009, datos no publicados).
La NOM-145-SSA-1995, y el Codex Alimentarius (1995) recomiendan una
concentración inferior a 12.5 ppm de Nisina como conservador en productos cárnicos. Otros
autores sugieren la adición de ácidos orgánicos (láctico y cítrico a 5%) para mejores
resultados de conservación. Sin embargo, se desconoce la cantidad de estos componentes en
los conservadores disponibles en el mercado.
En este estudio se evaluó y analizó el desarrollo microbiano bajo diferentes
combinaciones de Nisina y ácidos orgánicos. Con la finalidad de generar información que
permita diseñar medidas de prevención del deterioro prematuro del producto. Lo cual supone
abatir las pérdidas económicas para la industria alimenticia.
OBJETIVO
Evaluar efectividad de conservadores a base de Nisina y ácidos orgánicos, en la inhibición del
desarrollo de 5 cepas de Leuconostoc mesenteroides, a diferentes condiciones de pH.
METODOLOGIA
Se realizo el aislamiento de las cepas Leuconostoc mesenteroides, con 3 ml de caldo MRS
adicionando 40 Ml de muestra se incubaron a 30ªC por 48 hrs, Después se hizo estriado en
placa, que se incuba por 24 hrs y:
a) Después se hizo prueba de catalasa, como identificación de la especie (catalasa(-))
b) Se recupera colonia y se estría en placa de nuevo. Se purificaron por medio de
centrifugación durante 5 min., y se resuspendieron e incubaron las cepas en caldo MRS
por 24 hrs.
Se identificaron cepas por Biolog, se calibra Espectrofotómetro con cloruro de calcio, al un
tubo con fluido de inoculo se le adicionan 2 gotas de Tioglicolato, con un hisopo se barre la
cepa de Leuconostoc hasta alcanzar 20 de transmitancia.
Se llena una placa de Biolog con 3 replicas de cada cepa, estas contenían 150 Ml de fluido
diluyente con inoculo, se incuba 24 hrs a 30 *C, posteriormente se confirmaron los resultados
por el método PCR, el cual se realiza a partir de centrifugar por 15 min a 4500 rpm las cepas
activadas, se lisan las células resuspendiendo estas en solución salina, se incuba hasta
ebullición por 15 mi (ahí tenemos nuestro lisado de células y DNA), el llenado de pozo se
hace con 19Ml una mezcla de primer anti sentido Leu A, primer sentido Leu S, y la mezcla de
dNTP’s, agua y magnesio y 1Ml de muestra y se amplifica durante X hrs en el termociclador.
Posteriormente ponen a correr las muestras con colorante blue juice en Gel agarosa al 1.5% y
se revela el gel.
Después de la confirmación, se hizo el Bioscreen, llenando 2 placas con 5 cepas diferentes de
Leuconostoc mesenteroides y controles sin inoculo, los pozos contienen con 40 Ml de agar
MRS modificado de pH (5, 5.5, 6) y 10 Ml de cepa, se introduce al Biosecreen y se dejo 24 hrs
2
estándar mas 24 hrs extras para ver el comportamiento de las cepas conforme a las horas con
diferentes conservadores.
RESULTADOS
 En la grafica se el comportamiento de Leuconostoc mesenteroides en caldo MRS en
presencia de conservadores y pH de la cepa 17
8.8
Nisina pH5
8.6
Nisina pH5.5
Nisina pH6
8.4
Lactico pH5
Lactico pH5.5
8.2
Lactico pH6
Citrico pH5
8
Citrico pH5.5
Citrico pH6
NL pH 5
7.8
NL pH 5.5
NL pH 6
7.6
NC pH 5
NC pH 5.5
7.4
NC pH 6
SC pH 5
7.2
SC pH 5.5
SC pH 6
7
0
5
10
15
20
25
Esta cepa muestra de manera representativa, como se modifica el desarrollo microbiano con la
variación tanto de pH como del conservador; se puede observar que los conservadores usados
inhiben el crecimiento microbiano (concentración conocida y específica), y se ve claramente:
a) La diferencia de desarrollo entre las muestras tratadas y nuestros controles sin
conservador.
b) Como el crecimiento se ve favorecido a un pH más cercano al pH optimo para el género
Leuconostoc tiene un crecimiento optimo que es a pH 6.5
 En esta siguiente grafica tenemos el comportamiento de Leuconostoc mesenteroides
(Cepa 17) en caldo MRS, según conservador, a pH 6.
Aquí se evaluó la diferencia en cuanto al desarrollo microbiano, comparando un conservador
comercial (que tiene una mezcla a concentraciones desconocidas de varios conservadores)
contra nuestras mezclas bajo el efecto de las concentraciones de nuestros conservadores. Lo
que se observa es:
a) Que la concentración de nuestros conservadores inhibe el crecimiento microbiano.
b) A concentración de 0.3% y 0.45% del conservador comercial, tenía un efecto, pero
aun así existía desarrollo.* con base a experimento previo (Cepeda et al., 2009, datos
no publicados).
3
c) Solo a la concentración 0.6% del conservador comercial se observa efecto
inhibitorio.* con Base a experimento previo (Cepeda et al., 2009) DATOS NO
PUBLICADOS.
2,6
2,4
2,2
2
1,8
Nisina pH 6 (10 ppm)
1,6
NL pH 6
1,4
NC pH 6
1,2
Inbac 0.3%
1
0,8
Inbac 0.45%
0,6
Inbac 0.6%
0,4
Sin Inbac pH X
0,2
0
-0,2 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
-0,4
CONCLUSION
En base a los resultados podemos concluir que la razón por la cual se observa crecimiento
microbiano de la bacteria Láctica Leuconostoc mesenteroides en el producto embutido,
salchicha, dentro de la planta, es por la baja concentración del conservador que usan, debido a
que es tan bajo no controla el desarrollo microbiano.
Como Propuesta para la planta, seria duplicar la concentración de su conservador, que de
acuerdo a nuestros resultados, nos inhibe el crecimiento.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Buchanan, R. L., Whiting, R. C., (1996), Risk assessment and predictive microbiology. J, food Prot.
Suppl.:31-36
NOM-145-SSA-1995. Productos cárnicos troceados y curados. Productos cárnicos curados y
madurados. Disposiciones y especificaciones sanitarias.
Codex Alimentarius 1995. Codex-Stand 192-1995. Norma general para aditivos alimentarios.
Fernandez-Escartin, (2009). Microbiología e Inocuidad de los Alimentos. Segunda edición.
Universidad Autónoma de Querétaro.
Von Holy, A., W. H. Holzapfel., G. A. Dykes, 1992, Bacterial populations associated with Vienna
sausage Packaging, Int J Food Microbiology, 9, 45-53
Chung King-Thom. (1989). “Effects of nisin on growtn of bacteria attached to meat” vol 55 No.6
Martin-Juárez, B. “Estudio de las comunidades microbianas de embutidos fermentados ligeramente
acidificados mediante técnicas moleculares. Estandarización, seguridad y mejora tecnológica” Tesis
de Doctorado en Ciencias, itinerario de Biotecnología del departamento de Enginyeria Quìmica
agraria i tecnología agroalimentaria (EQATA) universitat de Girona. 2005
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