TP 5 - Departamento de Biología Molecular

Química Biológica 2110. Microbiología y Técnico de Laboratorio. Año 2008.
Trabajo Práctico N° 5: Separación y visualización de los ácidos nucleicos de
Pseudomonas fluorescens C
Objetivo: Separar los ácidos nucleicos mediante electroforesis en geles de agarosa y
visualizarlos por tinción con bromuro de etidio.
Introducción
Los ácidos nucleicos son macromoléculas cargadas negativamente a pH fisiológico.
Esta carga es aportada por los grupos fosfatos de las uniones fosfodiésteres entre
nucleótidos. Debido a esto, pueden separarse mediante electroforesis, ya que al ser
sometidos a la acción de un campo eléctrico, migrarán hacia el polo positivo o ánodo.
Las electroforesis de ácidos nucleicos se realizan utilizando como soporte geles de
agarosa, aunque algunas veces se utilizan geles de poliacrilamida. A diferencia de esta
ultima, la agarosa es un polímero de D- y L-galactosa unidas mediante enlaces
glucosídico -(13) y  (14). Este polímero forma una malla o red tridimensional
con poros de 50 a 200nm por donde se desplazaran los ácidos nucleicos. (Figura 1).
Figura 1: Estructura química de la agarosa.
Los ácidos nucleicos contenidos en el gel, serán impulsados a atravesar la trama por
acción de un campo eléctrico. Debido a que tienen la misma carga neta, se separaran de
acuerdo a su PM. Así, las moléculas de DNA migraran menos, es decir, son más
retenidas en el gel; mientras que las moléculas de RNA, de menor PM, atraviesan el gel
fácilmente, y recorren una mayor distancia. Se logra así, que ambas moléculas se
separen.
Las electroforesis en geles de agarosa se utilizan para separar ácidos nucleicos desde
50 bp a varias megabases de longitud. Mientras que aquellas realizadas en geles de
poliacrilamida, son efectivas para separar fragmentos pequeños, de 5 a 500 bp.
Los ácidos nucleicos son incoloros, para seguir la corrida electroforética se utiliza un
colorante, azul de bromofenol. El mismo nos permite decidir cuando debemos terminar
la corrida.
Una vez concluida la electroforesis, los ácidos nucleicos se visualizan porque
interaccionan con moléculas fluorescentes tales como el bromuro de etidio y el SYRB
gold. (Figura 2). Estos compuestos son moléculas apolares que se une eficientemente al
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DNA y RNA intercalándose entre sus bases nitrogenadas. Cuando los geles son
irradiados con luz UV de 302 - 366nm, estos compuestos son capaces de absorber luz y
fluorescer, originando un color naranja-rojo observable a simple vista. Estos fluoroforos
son CARCINOGENOS, por lo que deben tratarse con sumo cuidado.
La visualización del color permite poner de manifiesto el DNA y RNA.
Figura 2: Estructura química del Bromuro de Etidio.
En el trabajo practico separaremos los ácidos nucleicos de P. fluorescens, obtenidos
en el TP anterior, mediante electroforesis en gel de agarosa y luego los visualizaremos
por fluorescencia del bromuro de etidio bajo luz UV.
Se deberá usar guantes y manipular el material cuidadosamente, porque
contiene bromuro de etidio.
Técnica.
1.- Armar el soporte que contendrá el gel y colocar el peine para formar las calles de
siembra.
2.- Preparar el gel de agarosa: preparar el gel al 0,8 % de agarosa (p/v) y disolver en
buffer TAE pH 8,0. (TAE 1X: Tris-Acetato 40mM y EDTA 1mM pH 8,0). Una vez
bien disuelta la agarosa, agregar bromuro de etidio a una concentracion final de 0,5
g/ml (5 l de sol. 10 mg/ml). Homogeneizar, verter en el soporte y dejar solidificar.
Colocar en la cuba de electroforesis.
3.- Preparar la cuba de electroforesis: agregar, en la cuba, el buffer de corrida hasta
cubrir el gel. El buffer es TAE 1x pH 8,0.
4.- Preparar las muestras: mezclar 10 l de la solución de ácidos nucleicos con 3l de
buffer de carga 6x. Homogeneizar con micropipeta, cargando y descargando. Evitar que
se forman demasiadas burbujas.
(Buffer de carga 6x: 0,25% de azul de bromofenol (p/v) y 40% de sacarosa (p/v),
disolver en agua destilada).
5.- Siembra del gel: Cargar la muestra preparada y depositarla en las calles del gel.
Evitar perder la muestra durante la siembra.
6.- Electroforesis: tapar la cuba electroforética y conectar a la fuente de poder. Correr a
100 voltios (voltaje constante), hasta que el frente llegue a 0,5 cm del borde inferior del
gel.
7.- Una vez finalizada la electroforesis, sacar el gel y exponer a luz UV.
8.- Visualizar la presencia de ácidos nucleicos e identificar el DNA y RNA.
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