1 UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE Facultad de Ciencias Escuela de Bioquímica Cambios en la eficiencia fotoquímica primaria del PS II en “Deschampsia Antarctica Desv.” Bajo condiciones de estrés frío y lumínico Tesis de grado presentada como parte de los requisitos para optar al Grado de Licenciado en Bioquímica y al Título profesional de Bioquímico. Profesor Patrocinante : Sra. Miren Alberdi L. - Instituto De Botánica - Facultad De Ciencias. Rafael Enrique Zúñiga Hormazábal Valdivia Chile 2003 Profesor Co-Patrocinante Sra. Susan Hess - Instituto De Química - Facultad De Ciencias Dedicatoria A mis Padres, hermanos, hijo y familia. 2 Agradecimientos En forma muy especial quiero agradecer a mi profesora patrocinante Dra. Miren Alberdi Lag, quien me permitió desarrollar este trabajo en el laboratorio que ella dirige y de quien siempre recibí constante ayuda tanto teórica como práctica. Quien con su constante apoyo y dedicación contribuyó al desarrollo de esta tesis como también a la formación de un potencial hombre de ciencia. A las profesoras integrantes de mi comisión de tesis Dra. Susan Hess F. que con sus consejos y enseñanzas aportó a este trabajo y con ello permitió que éste llegara a buen término y Dra. Ilona Concha Grabinger por aceptar formar parte de esta comisión. A Nancy Ulloa (Magíster en Ciencias, mención Botánica), quien formaba parte del grupo de trabajo y de quien aprendí mucho, con respecto a la forma de trabajar en el laboratorio y abordar los diferentes problemas. También merecen un reconocimiento importante, los profesores Magdalena Romero del Instituto de Botánica, Juan Carlos Paredes y Joel Pardo del Instituto de Química de esta Universidad, de quienes recibí tanto críticas constructivas como voces de apoyo. Este trabajo fue realizado en el laboratorio de Ecofisiología Vegetal del Instituto de Botánica e Instituto de Química de la Universidad Austral de Chile y fue financiado por los proyectos: DIDUACH S-20002-88 y FONDECYT No 1000610. 3 1. RESUMEN La energía solar es potencialmente dañina para plantas cuando excede su capacidad fotosintética. Las plantas pueden protegerse de este daño, mediante mecanismos de disipación del exceso de energía, en el que participan pigmentos del grupo de las xantofilas (carotenoides oxígenados). Deschampsia antarctica Desv., es la única Gramínea que ha colonizado en forma natural la Antártida Marítima, ambiente de condiciones muy desfavorables (alta luminosidad y bajas temperaturas), para el crecimiento de plantas superiores. Se estudió el efecto de altas intensidades lumínicas (PFDs), y baja temperatura sobre la eficiencia fotoquímica del fotosistema II (PSII) en plantas aclimatadas (A) y no aclimatadas (NA) al frío de D. antarctica, y su relación con el ciclo de las xantofilas, evaluándose si la previa aclimatación a 4ºC, modifica el comportamiento del PSII y pigmentos investigados. La eficiencia fotoquímica máxima (Fv/Fm) y efectiva (ФPSII) del PSII de plantas A y NA, no mostraron diferencias significativas, a una misma PFD, advirtiéndose un descenso más marcado en plantas NA a la mayor PFD y al final del tratamiento, lo que sugiriere un indicio de fotoinhibición. Plantas A sometidas al efecto combinado de frío y alta PFD mostraron un mayor quenching no fotoquímico (qNP) y tasa relativa de transporte de electrones (rETR), menor quenching fotoquímico (qP), concomitante con mayores contenidos de zeaxantina, nivel de de-epoxidación y menores contenidos de violaxantina, lo que indicaría la puesta en marcha de un mecanismo fotoprotector. En conclusión, el análisis de los resultados nos permite inferir que esta especie presenta una eficiente disipación de energía vía ciclo de las xantofilas sólo ante el efecto combinado del frío y alta intensidad lumínica. Además, la aclimatación al frío sería favorable para evitar daños fotoinhibitorios a la mayor intensidad lumínica utilizada. Estos mecanismos, podrían capacitar a esta especie para la colonización y sobrevivencia en el desfavorable ambiente antártico. 4 SUMMARY The sun energy can be potentially harmful when exceeds the photosynthetic capacity of plants. There are photoprotective mechanisms that permit the dissipation of the excess of energy absorbed by plants, being one of this mechanism associated with pigments of the xanthophyll (oxygenated carotenoids) cycle. The effect of cold and high light intensities (PFDs) on the photochemical efficiency of photosystem II (PSII) of cold acclimated (A) and non-acclimated (NA) plants of Deschampsia antarctica Desv., in association with the xanthophyll cycle pigments, were studied. The maximum (Fv/Fm) and effective (ФPSII) photochemical efficiency of the PSII did not significantly changed in cold acclimated (A) and non-acclimated (NA) plants when exposed to the same light level. At the highest light intensity a greater decrease of both parameters were found, being this decrease greater in the NA than in A plants. That suggest an initial photoinhibition in NA plants specially at the end of treatment. Cold A plants subjected to cold at the highest PFD, showed a higher coefficient of non photochemical quenching (qNP) and relative rate electron transport (rETR), lower coefficient of photochemical quenching (qP), higher content of zeaxanthin and levels of de-epoxidation and a decrease of violaxanthin, suggesting a photoprotector role of zeaxanthin. From these results can be concluded that D. antarctica have an efficient mechanism of energy dissipation via the xanthophyll cycle only when a high light level is combined with cold. A previous cold acclimation seems to be favourable to avoid the photoinbitory damage under high light and cold in this plant species. These mechanisms, can permit to this plant species to colonize the harsh Antarctic environment. 5 2. INTRODUCCION La luz, como fuente de energía para la fotosíntesis, es el prerrequisito esencial para la vida de las plantas. Sin embargo, el exceso de luz, puede disminuir la fotosíntesis (fotoinhibición) y llevar a la destrucción fotooxidativa de los aparatos fotosintéticos (Long & Humphries, 1994), además de causar efectos inhibitorios en la asimilación de CO2 (Krause, 1988). La fotoinhibición puede ser definida como la inhibición de la fotosíntesis cuando el flujo de fotones que llega a la planta excede el requerimiento fotónico de ésta (Powles, 1984; Moll & Steinback, 1986; Krause, 1988; Öquist & Huner, 1991; Heber & Walker, 1992; Gray et al., 1994; Long et al., 1994; Adams III et al., 1995a; Huner et al., 1996). La fotoinhibición de la fotosíntesis se presenta como una disminución del rendimiento cuántico para el intercambio de CO2 y O2, un aumento en la fluorescencia de la clorofila a (Chl a), y una disminución de las tasas de fotosíntesis a saturación lumínica, bajo exposición prolongada a luz excesiva (Demmig & Björkman, 1987; Demmig et al., 1987; Krause, 1988; Ögren, 1988; Somersalo & Krause, 1989, 1990a; Gray et al., 1994; Long et al., 1994). El proceso fotoinhibitorio se basa principalmente en una inactivación del sistema transportador de electrones en los tilacoides, cuyo efecto dominante es la alteración de los centros de reacción del fotosistema II (PSII), lo que conduce a un descenso de la eficiencia fotoquímica primaria de la fotosíntesis (Krause, 1988). La energía lumínica, capturada por las clorofilas y carotenoides del complejo antena tilacoidal, es transferida al centro de reacción del PSII, donde la separación de cargas inducida por fotones tiene lugar entre el aceptor y dador primario de electrones. El complejo PSII es uno de las multisubunidades de los tilacoides, y está compuesto por más de 30 proteínas codificadas por genes nucleares y del cloroplasto (Barber, 1998; Yamamoto, 2001). De entre las proteínas intrínsecas codificadas por el cloroplasto, las D1 y D2 con una masa molecular de 32 kDa, son de particular importancia. En ellas se localizan los componentes redox requeridos para la reacción fotoquímica, como ser, el dador primario de electrones P680, el aceptor primario de electrones feofitina (Pheo), el dador secundario de electrones Tyr Z (tirosina con actividad redox de la proteína D1) y los aceptores secundarios de electrones quinona A (QA) y quinona B (QB) (Fig. 1). 6 Bajo iluminación excesiva de luz visible, la proteína D1 se convierte en blanco de fotodaño, el cual inhibe el transporte de electrones en el fotositema II (Yamamoto, 2001). Este daño se traduce en la degradación de esta proteína por acción del oxígeno singlete (1O2), especies oxidativas como P680+ y Tyr Z+, las cuales producen cortes en loops de la proteína (De las Rivas et al., 1992) y cambios conformacionales en el sitio de unión a QB (Nakajima et al., 1996). También se forman aductores covalentes o agregaciones de la proteína con los polipéptidos que la rodean, debido a la oxidación de amino ácidos de la proteína D1. Estas agregaciones son digeridas por putativas proteasas estromales (Yamamoto, 2001). La disfunción y degradación de la proteína D1 (proteína de unión al centro de reacción del PSII), ha sido sugerida como el sitio inicial causante de fotoinhibición (Krause, 1988). Además del exceso de luz, otros factores de estrés ambiental tales como temperaturas bajas y de congelación, calor, sequía y la deficiencia de nitrógeno pueden conducir e intensificar la fotoinhibición aún con luz moderada (Larcher & Neuner, 1989; Somersalo & Krause, 1989, 1990b; Greer et al., 1991; Brestic et al., 1995; Dannehl et al., 1995; Fryer et al., 1995; Giardi et al., 1996; Havaux & Tardy, 1996; Maury et al., 1996). Sin embargo, en algunas plantas, la aclimatación al frío contribuye a disminuir la sensibilidad a la fotoinhibición ante un estrés de enfriamiento (Somersalo & Krause, 1989, 1990a, 1990b). FIGURA 1. Diagrama esquemático de la estructura del fotosistema II. Se muestra la localización relativa de las proteínas D1 y D2 (proteínas de unión al centro de reacción del PSII, de masa molecular 32 kDa), CP43 y CP47 (proteínas de unión a clorofila antena de masa molecular relativa de 43 y 47 kDa) y OEC33, OEC24 y OEC18 (subunidades del complejo liberador de oxígeno de 33, 24 y 18 kDa), QA y QB (plastoquinona aceptora de electrones primaria y secundaria del PSII), TyrZ (tirosina con actividad redox de la proteína D1), Pheo (feofitina), cluster de Mn (4Mn) y P680 (dador primario de electrones), además del complejo captador de luz II (LHCII) y citocromo b559 (Cyt b559). Basado en las referencias de Mori et al., (1995); Yamamoto & Akasaka, (1995); Yamamoto et al., (1998), citadas por Yamamoto, (2001). 7 2.1. Fotosíntesis y fotoinhibición a bajas temperaturas y alta luminosidad La fotosíntesis es uno de los procesos fisiológicos más sensibles a la temperatura (Berry & Björkman, 1980; Huner et al., 1993). La fotosíntesis se inhibiría a baja temperatura, por la reducción en la velocidad de las reacciones catalizadas enzimáticamente, por una disminución en el transporte de electrones del PSII, causada por daños en el centro de reacción del mismo fotosistema y por un incremento de la velocidad de disipación no radiativa (emisión de calor) de la energía de excitación (Demmig et al. 1987; Krause, 1988; Baker, 1991; Brüggemann & Dauborn, 1993; Huner et al., 1993; Rintamäki et al., 1995). El transporte de electrones mediado por el fotosistema I (PSI) no es significativamente fotoinhibido (Moll & Steinback, 1986; Huner et al., 1993; Hurry et al., 1994). La fotoinhibición a bajas temperaturas ha generado un alto interés en los últimos años y ha sido extensivamente investigada bajo condiciones de terreno (Ögren, 1988; Ögren & Sjöstrom, 1990; Somersalo & Krause, 1990b; Groom et al., 1991; Karpinski et al., 1994; Adams III et al., 1995b; 8 Steffen et al., 1995; Lütz, 1996) y de laboratorio (Somersalo & Krause, 1990a; Falk & Palmquist, 1992; Krause et al., 1995). Aunque muchos investigadores han expresado la fotoinhibición de la fotosíntesis como daño del PSII, las investigaciones actuales demuestran que no siempre se produce daño del aparato fotosintético cuando éste se fotoinhibe, y que la caída en el rendimiento cuántico del PSII estaría asociado a fenómenos de fotoprotección (Krause, 1988; Huner et al., 1993; Öquist et al., 1993; Horton et al., 1996). La extensión de la fotoinhibición varía con el estado fisiológico de la planta y las condiciones ambientales, tales como densidad del flujo fotónico (PFD) y duración de la exposición a la luz (Powles, 1984; Krause, 1988; Demmig-Adams & Adams, 1992). A baja temperatura las plantas son más sensibles a la luz, produciéndose fotoinhibición a intensidades de luz menores que a mayor temperatura (Powles, 1984; Moll & Steinback, 1986; Somersalo & Krause, 1989, 1990a; Schöner & Krause, 1990; Mishra et al., 1993). En algunas plantas, el daño producido puede mantenerse aún cuando la temperatura óptima de crecimiento se restablezca (Park et al., 1995). Como se indicó anteriormente, el sitio primario de daño fotoinhibitorio del PSII sería la proteína D1 de 32 kDa, la cual se denatura y separa de la membrana tilacoidal (Krause, 1988; DemmigAdams & Adams, 1992; Horton et al., 1996; Nishida & Murata, 1996). Con ello se inactiva la transferencia electrónica y la proteína se hace susceptible a la acción de proteasas o especies de oxígeno activo (Powles, 1984; Krause, 1988; Somersalo & Krause, 1989; Schöner & Krause, 1990; Wang et al., 1992; McKersie et al., 1993; Long et al., 1994; Zhang et al., 1995; Hakam & Simon, 1996; Hippeli & Elstner, 1996; Kocsy et al., 1997; Yamamoto, 2001). Sin embargo, no existe aún consenso que éste sea el único sitio de daño, ya que se ha encontrado fotoinhibición del transporte de electrones sin pérdida de D1 (Krause, 1988; Long et al., 1994). En hojas aclimatadas al frío la fotoinhibición y su recuperación tampoco involucran a esta proteína (Critchley & Russell, 1994). Plantas sensibles a las bajas temperaturas, fotoinhibidas por estrés frío, muestran una alta reducción del “pool” de plastoquinonas y en especial de la quinona A, con incremento en el cierre de los centros de reacción (CR) y una marcada disminución y degradación en los complejos proteína-pigmentos del PSII (Klosson & Krause, 1981; Wise & Naylor, 1987; Koroleva et al., 1994; Hodges et al., 1996; Fadzillah et al., 1996). 9 Se ha reportado que, mientras la respuesta fotoinhibitoria es muy marcada en plantas susceptibles al frío, plantas resistentes a este factor, poseen mecanismos que las capacitan para evitar o reducir el bloqueo fotosintético, y por ende, mantener la integridad funcional de los cloroplastos (Steffen et al., 1989). Somersalo y Krause (1989, 1990) fueron los primeros en informar que hojas de espinaca (Spinacia oleracea) aclimatadas al frío exhiben una alta capacidad de tolerar la fotoinhibición (Huner et al., 1993; Gray et al., 1994). Aunque plantas de espinaca no aclimatadas se fotoinhiben, este fenómeno es potencialmente reversible en el tiempo (Somersalo & Krause, 1989, 1990a; Schöner & Krause, 1990), como también se ha reportado para otros vegetales (Ting et al., 1991). Cereales de primavera, con baja resistencia al frío, no son capaces de resistir la fotoinhibición durante crecimiento prolongado a bajas temperaturas (temperaturas no congelantes), como ocurre en plantas resistentes al frío, como trigo o centeno de invierno (Öquist & Huner, 1991; Huner et al., 1993; Öquist et al., 1993; Huner et al., 1996; Szalai et al., 1996). El incremento en la resistencia a la fotoinhibición en los cereales de invierno es el reflejo de la capacidad de mantener las QA oxidadas, bajo condiciones de alta irradiancia y baja temperatura (Öquist & Huner, 1991; Huner et al., 1996; Savitch et al., 1997). Esta capacidad ha sido relacionada con el aumento en la tolerancia al congelamiento en estas plantas (Öquist et al., 1993). Sin embargo, estos autores también reportan, que la alta resistencia al frío exhibida por plantas de pino aclimatadas a bajas temperaturas, no está relacionada con esta capacidad, ya que estas especies vegetales se fotoinhiben en condiciones de frío y luz moderada. Todo lo anterior, muestra que la respuesta de las plantas a factores ambientales capaces de provocar fotoinhibición es variable. No sólo plantas vasculares, sino plantas no vasculares como musgos y líquenes antárticos expuestos a bajas temperaturas y alta luminosidad, son capaces de mantener su capacidad fotosintética gracias a la mantención de una mayor actividad del PSII ante el efecto de estos factores ambientales (Huner et al., 1993; Davey & Rothery, 1996; Edwards & Smith, 1988; Casanova, 1997). 10 Se considera que la posibilidad de recuperación en el tiempo, de plantas que han sufrido eventos fotoinhibitorios bajo frío y que son devueltas a condiciones óptimas, está íntimamente relacionada con la capacidad del PSII de disipar la energía no radiativa como calor (a través del ciclo de las xantofilas), con o sin intervención de la proteína D1. Esta capacidad de recuperación sería reflejo de que están operando procesos de fotoprotección (Demmig et al., 1987; Greer et al., 1991; Demmig-Adams & Adams, 1992; Heber & Walker, 1992; Long et al., 1994; Brestic et al., 1995; Fryer et al., 1995; Adams et al., 1996; Demmig-Adams & Adams, 1996; Flanigan & Critchley, 1996). Cambios bioquímicos en el contenido y composición de los complejos proteínapigmentos del centro de reacción y/o de las antenas, permiten minimizar el daño fotoinhibitorio, manteniendo la eficiencia de los eventos primarios de la fotosíntesis, proceso conocido como “down-regulation” (Huner et al., 1984; Sicher et al., 1988; Demmig-Adams & Adams, 1992; van Wijk & van Hasselt, 1993; Maxwell et al., 1995; Haldimann, 1996; Horton et al., 1996; Jahns & Miehe, 1996; Park et al., 1996; Gilmore, 1997). Todos estos mecanismos de desexcitación del sistema tilacoidal, pueden afectar la emisión de fluorescencia de la Chl a, cuyos parámetros son utilizados como indicadores del efecto fotoinhibitorio de diversos tipos de estrés sobre plantas. El significado de la emisión de diferentes señales de fluorescencia y su importancia en la predicción de fotoinhibición será tratado más adelante (punto 2.3). 2.2. Carotenoides y su rol fotoprotector Aunque los carotenoides cumplen un importante papel en la captación de energía lumínica, su papel como pigmentos fotoprotectores es crucial en la mantención de la función fotosintética en hábitats expuestos a altas intensidades lumínicas (Rau, 1988). Esta protección se atribuye a la capacidad de los carotenoides de apagar (“quench”) directamente el estado de triplete oxidado de la clorofila (3Chl), previniendo con esto la producción de singletes de oxígeno (1O2) o bien apagándolos (Thayer & Björkman, 1990; Asada, 1999; Niyogi, 1999; Müller et al., 2001) y evitando así que el 1O2 estimule la formación de otras especies reactivas de oxígeno (ROS) tales como peróxido de hidrógeno (H2O2), anión superóxido (O2·-) y los radicales hidroxilo (HO·) y perhidroxilo (O2H·). Estas moléculas reactivas, especialmente OH·, son altamente destructoras de lípidos de membrana, ácidos nucleicos, y proteínas. Sin embargo, las especies de oxígeno reactivas como O2·- y H2O2 son requeridas para algunos procesos vegetales como la lignificación 11 y funcionan como señales en la respuesta defensiva contra la infección de patógenos (Buchanan et al., 2000). Se ha sugerido un rol específico de la zeaxantina, un carotenoide formado en el ciclo de las xantofilas, en la protección de los aparatos fotosintéticos contra los efectos adversos del exceso de luz (Demmig et al., 1987; Demmig-Adams & Adams, 1992; Bugos et al., 1998). Este ciclo (Fig. 2 y 3) convierte las tres xantofilas (carotenoides oxigenados), mediante secuencias de deepoxidación por acción de la enzima violaxantina de-epoxidasa, desde el diepóxido violaxantina vía monoepóxido anteraxantina, a la forma de epóxido libre, zeaxantina, cuando la absorción de luz excede la utilización fotoquímica de ella. Esta interconversión ocurre en presencia de ascorbato y cuando la concentración de protones [H+] en el lumen tilacoidal alcanza un umbral crítico (lumen ácido), determinado por la bomba de protones inducida por luz (Gilmore & Yamamoto, 1992; Bugos et al., 1998; Niyogi et al., 1998; Niyogi, 1999; Müller et al., 2001; Elrad et al., 2002). La zeaxantina actuaría como “varilla de alumbrado” (lightning rod) recibiendo la energía de la misma forma que la clorofila y disipándola como calor, pudiendo esta energía ser medida por la emisión de fluorescencia (Demmig et al., 1987). En la oscuridad o cuando la luz no está en exceso se produce epoxidación (por acción de la enzima zeaxantina epoxidasa) de la zeaxantina a violaxantina vía el intermediario anteraxantina (Long & Humphries, 1994; Bugos et al., 1998; Niyogi et al., 1998; Niyogi, 1999; Müller et al., 2001). La reacción es óptima a un pH cercano a 7,5 y la enzima utiliza oxígeno, ferrodoxina y FAD como co-substratos (Bouvier et al., 1996; Bugos et al., 1998; Müller et al., 2001). Existen evidencias que apoyan la participación de los carotenoides en la mantención de una fotosíntesis adecuada ante condiciones de frío y alta intensidad lumínica, como ocurre en lugares ubicados en altura (Wildi & Lütz, 1996; Lütz, 1996). Especies de Lycopersicum provenientes de mayor altitud, sometidas a un tratamiento de enfriamiento responden con un incremento de carotenoides y un ajuste de su “pool” de xantofilas, conducente a presentar niveles mayores de zeaxantina que las de menor altitud (Venema et al., 1999). Mayores antecedentes sobre la capacidad de apagamiento de los carotenoides y su significado fisiológico se entregan mas adelante (punto 2.5). 12 2.3. Fluorescencia in vivo de la clorofila a en la medición del estado fisiológico del aparato fotosintético Cuando la energía lumínica es absorbida por una molécula de clorofila, se altera temporalmente su configuración electrónica (estado excitado) emitiendo fluorescencia. Este estado es inestable y de corta duración (<10-8 segundos), pues muchos procesos compiten para disipar la energía. Por lo tanto, in vivo, la clorofila presenta cambios en el rendimiento fluorescente durante la exposición a la luz (Kautsky & Hirsch, 1931). Estos cambios se deben a que la clorofila forma parte de complejos proteínas-pigmentos los cuales están embebidos en la membrana tilacoidal, y transmiten la excitación energética a los centros de reacción de los fotosistemas II (P680) y fotosistema I (P700) donde se produce la conversión energética por separación de cargas. FIGURA 2. Vía biosintética de carotenoides en el alga verde Chlamydomonas reinhardtii y plantas. Tomado de Niyogi et al., (1997). 13 FIGURA 3. Vía biosintética del ciclo de las xantofilas a partir de β-caroteno en plantas superiores, con mención de las enzimas principales involucradas en la interconversión de estos pigmentos, extraído de Niyogi et al., (1998). Violaxantina de-epoxidasa es estimulada por un exceso de luz y pH ácido, mientras que zeaxantina epoxidasa se estimula con luz baja y pH neutro. 14 A temperatura ambiente la fluorescencia variable (Fv) se origina casi exclusivamente del PSII, por lo que los cambios en fluorescencia reflejan primariamente el estado del PSII (Krause & Weise 1991). Esto no ocurre a temperaturas de -196ºC (77°K) donde se observa fluorescencia tanto del PSII (max em = 690 nm) como del PSI (max em = 730 nm) (Govindjee, 2002). Además, las variaciones en la distribución de la energía entre los dos fotosistemas también influyen en el rendimiento fluorescente. Como el PSI esencialmente no fluoresce, cualquier incremento en la transferencia de energía del PSII al PSI podría ser considerado como equivalente a la disipación no radiante (Björkman & Demmig, 1987). El estudio de la fluorescencia in vivo de la Chl a aporta información valiosa sobre el efecto que producen los diferentes tipos de estrés en la fotosíntesis. En los últimos años las técnicas de fluorescencia han sido aplicadas a estudios sobre la eficiencia fotoquímica o rendimiento cuántico máximo del PSII (ФPSII) (Demmig & Björkman, 1987; Krause, 1988; Planchon et al., 15 1989; Adams et al., 1990; Horton et al., 1994; Peterson & Aylor, 1995; Strasser et al., 1995, Strasser, 1997; Agati et al., 1996; Fracheboud et al., 1999; Maxwell & Johnson, 2000; Rizza et al., 2001). Estas técnicas se basan en inducir la emisión de fluorescencia de la Chl a en plantas adaptadas a la oscuridad y posteriormente iluminadas. Esta fluorescencia depende del estado de reducción de los aceptores primarios de electrones del PSII. La emisión de fluorescencia presenta una curva característica, denominada curva o efecto de Kautsky en honor a su descubridor (Kautsky, 1931), cuyos parámetros son utilizados en la interpretación del rendimiento cuántico del PSII (Krause & Weis, 1984; Krause, 1988; Strasser et al., 1995; Fracheboud et al., 1999; Maxwell & Johnson, 2000; Rizza et al., 2001). Para mejor comprensión de esta curva ver la (Fig. 4). De acuerdo a Kautsky, cuando una hoja es iluminada con una intensidad de luz constante, la emisión de fluorescencia también será constante. Sin embargo, si la hoja es mantenida en la oscuridad donde todos los componentes de la cadena transportadora de electrones se encuentran completamente oxidados, y es posteriormente irradiada con luz continua, la fluorescencia aumenta rápidamente a un nivel inicial bajo (Fo) fluorescencia inicial, característico de la apertura de los centros del PSII y la total oxidación del aceptor primario de electrones de este fotosistema QA. Posteriormente, la fluorescencia pasa por un nivel intermedio, a medida que la luz es absorbida y la separación de cargas tiene lugar, produciéndose el cierre de los centros y la reducción de QA, aumentando la fluorescencia hasta un nivel máximo (fluorescencia máxima, Fm), lo cual indica que QA se encuentra totalmente reducida. Al mantenerse la luz, los procesos fotosintéticos se activan, funcionando la cadena transportadora de electrones y la energía es usada en la reducción del CO2. Esto produce que la emisión de fluorescencia disminuya paulatinamente pasando por un segundo máximo (M), asociado con el inicio de la reducción del CO2 en el ciclo de Calvin (Ireland et al., 1984), hasta llegar a un nivel (T) cercano a Fo (Kautsky & Hirsch, 1931). La disminución de la fluorescencia más allá de su valor máximo hasta llegar a T responde a la activación de los procesos, relacionados con la transformación de la energía en el PSII y la cadena transportadora de electrones, coeficiente de “quenching” fotoquímico (qP) y el coeficiente de “quenching” no fotoquímico (qNP). Este último representa los procesos que disipan la energía como calor o como energía de transferencia. La fotoinhibición está relacionada con una disminución del rendimiento de la fluorescencia variable de la Chl a del PSII, lo que se manifiesta en una disminución del cuociente de 16 fluorescencia variable y fluorescencia máxima, Fv/Fm (Ireland et al., 1984; Krause, 1988; Krause & Weis, 1984, 1991; Ögren & Sjöström, 1990; Raggi, 1995; Raveh et al., 1995; Verhoeven et al., 1996, 1999; Fracheboud et al., 1999; Maxwell & Johnson, 2000). En condiciones normales, la mayoría de las plantas superiores poseen un Fv/Fm óptimo cercano a 0,83 típico de plantas sanas, oscilando entre 0,7 a 0,85 (Krause, 1988; Krause & Weis, 1984, 1991; Björkman & Demmig, 1987; Maxwell & Johnson, 2000; Rizza et al., 2001). Un descenso de Fv/Fm ha sido relacionado con una caída en el rendimiento fotónico óptimo de la fotosíntesis, mientras que la recuperación de este estado se asocia con un reestablecimiento de Fv/Fm (Adams et al., 1990). En plantas de cereales y pino sometidas a tratamiento frío, la fotoinhibición ocurre gradualmente alcanzando un estado de equilibrio cerca de las 20 y 60 horas de tratamiento frío, respectivamente, decreciendo Fv/Fm en un 20% en los cereales y un 60% en pino (Öquist & Huner, 1991). En plantas de espinaca no aclimatadas al frío, el Fv/Fm desciende en un 50% (desde 0,8 a 0,4) bajo un tratamiento frío (4°C) y alta luminosidad, mientras que plantas aclimatadas al frío presentaron un valor de 0,7. La caída fotoinhibitoria de Fv/Fm se caracteriza por un incremento en Fo y disminución de Fv (Somersalo & Krause, 1989). En plantas de cebada fotoinhibidas, este proceso puede ser rápidamente revertido y disminuir al cambiar las plantas a temperaturas óptimas de crecimiento, lo que se expresa en un aumento de Fv/Fm (Greer et al., 1991). El descenso de la tasa fotoquímica del PSII, se expresa como un incremento en Fo (probable alteración del centro de reacción) y un aumento de la tasa de disipación no radiativa de la energía de excitación, como un decrecimiento en Fo y Fm (Demmig et al., 1987; Demmig & Adams, 1992). Cabe señalar que ambos procesos son observados como una disminución en Fv/Fm, aún cuando las características en la intensidad de la fluorescencia en los centros de reacción abiertos y cerrados puedan ser diferentes (Long et al., 1994). La función indicadora de la actividad fotosintética que se atribuye a la fluorescencia de la clorofila a proviene del hecho que la emisión de fluorescencia es complementaria al resto de las vías de desexcitación (traslado de la energía fotónica) del PSII, fundamentalmente en la forma fotoquímica y la de disipación de calor. Así, la eficiencia en la emisión de fluorescencia es mayor cuanto menor es la eficiencia de los mecanismos de disipación fotoquímicos y en forma de calor. 17 Teniendo en cuenta que la fluorescencia de la clorofila se origina principalmente en el PSII, y que más del 90% de la emisión de fluorescencia se origina en la clorofila a de este fotosistema, la transferencia de la energía de excitación al PSI debe ser considerada como una vía adicional y competitiva de desexcitación. Por lo tanto, la fluorescencia de la clorofila a del PSII podría funcionar como indicador de todos los niveles funcionales de la fotosíntesis y reacciones fotosintéticas de las plantas verdes. Un gran número de estudios así lo han demostrado desde que Kautsky & Hirsch (1931) descubrieron que esta emisión presenta cambios característicos cuando una planta es sometida a iluminación luego de estar en la oscuridad (Krause & Weis, 1984). 2.4. Mecanismos de desexitación de la clorofila a del PSII Desde el punto de vista de la emisión de fluorescencia existen fundamentalmente dos mecanismos que compiten durante los procesos de desexcitación. Estos son la conversión fotoquímica de energía en los centros de reacción del PSII y los mecanismos no fotoquímicos al nivel de antena y centros de reacción (Horton, et al., 1996) (Fig. 5). Debido a la intervención de ambos mecanismos la eficiencia potencial de emisión de fluorescencia resulta disminuida definiéndose dos mecanismos de amortiguamiento o apagamiento “quenching” fotoquímico (utilización de electrones en la cadena fotosintética) y no fotoquímico (disipación de la energía en forma de calor). La correcta interpretación de los cambios en la emisión de fluorescencia requiere conocer la contribución relativa de estos mecanismos de amortiguamiento. Recientemente se ha desarrollado una técnica no intrusiva (Fig. 5) para determinar in vivo la fluorescencia de la clorofila a del PSII, que utilizando luz actínica modulada de baja intensidad y pulsos de luz de mayor intensidad permite evaluar a través de la obtención de fluorescencias máximas y variables, no sólo los rendimientos cuánticos óptimos (en plantas adaptadas a la oscuridad) sino también las fluorescencias efectivas, Fm’ y Fv’ (Fm’- Fo’) (en plantas adaptadas a la luz), y la distribución de la energía, es decir cuanta energía se transfiere a la cadena transportadora de electrones fotosintética (quenching o apagamiento fotoquímico: qP) y aquella 18 disipada en forma de calor (quenching o apagamiento no fotoquímico: qNP) (Schreiber et al.,1986). 2.5. Bases moleculares de los mecanismos de apagamiento (quenchings) y su asociación con los carotenoides del ciclo de las xantofilas Aunque las bases moleculares de los mecanismos de apagamiento aun se desconocen, se pueden hacer algunas consideraciones (Büchel & Wilhelm, 1993): El qP depende estrictamente del estado de oxidación del primer aceptor del PSII la QA, e indica la eficiencia fotoquímica de los fotones capturados por los centros de reacción. Sin embargo, el qP es presumiblemente mayor que el porcentaje de QA oxidados, debido a la migración de energía de centros cerrados a abiertos. Adicionalmente, QA oxidado puede actuar de “apagador” o “quencher”. Por ende, el verdadero valor de Fm se alcanza sólo cuando todo el “pool” de plastoquinonas (PQ) está reducido. FIGURA 4. Efecto Kautsky. Curvas de emisión de fluorescencia de hojas previamente adaptadas a la oscuridad. Estas muestran que la emisión de fluorescencia varía en función del tiempo de manera bastante compleja. En el momento de la iluminación, la fluorescencia aumenta casi instantáneamente hasta un nivel inicial (Fo) luego aumenta rápidamente hasta un nivel máximo (Fm). Finalmente la emisión de fluorescencia disminuye lentamente hasta un estado estacionario (T), después de haber pasado por un segundo máximo (M). Los cambios de la intensidad de la fluorescencia observados durante la transición obscuridad/luz son función de la activación de los procesos fotosintéticos 19 FIGURA 5. Cinética de emisión de fluorescencia obtenida con el fluorímetro de pulso de amplitud modulada FMS 1 (Hansatech, Reino Unido). Las flechas negras indican el encendido de la luz de medida. Las flechas negras quebradas indican los pulsos de saturación. Con las flechas rojas se indica el encendido y apagado de la luz actínica, y la flecha de color lila un pulso de rojo lejano, modificado de Ulloa (2002). 20 El significado de los parámetros de fluorescencia (símbolos) se indican en las páginas 28 y 29. El qNP puede estar compuesto de varios mecanismos de apagamiento independientes, siendo importante el apagamiento o “quenching” energético (qE), que contribuye a la mayor parte del qNP. El qE está determinado por la acumulación de protones en el lumen tilacoidal, movilizados por el flujo fotónico, de modo que el qNP se asocia con el incremento del pH intratilacoidal y con la presencia de zeaxantina, cuando hay un exceso de luz (Bilger & Björkman, 1990; Müller et al., 20001; Elrad et al., 2002). La zeaxantina actúa como apagador. Se asume que esta acción se produciría por: (1) apagamiento directo del singlete excitado de la clorofila, por transferencia de energía desde la clorofila a la zeaxantina, lo que requiere proximidad física entre ambas moléculas (Ruban et al., 1993) y (2) por alteración de las propiedades de la membrana tilacoidal, por parte de este pigmento, al promover la agregación de los principales complejos recolectores de luz o por cambio en la fluidez de la membrana tilacoidal, disminuyendo la fluidez, incrementando la termoestabilidad y reduciendo la susceptibilidad a la peroxidación lipídica, al 21 interaccionar las xantofilas y los lípidos de membrana (Havaux, 1998; Havaux & Niyogi, 1999). En este caso la zeaxantina actuaría como amplificador del apagamiento más que como apagador directo (Thiele & Krause, 1994; Thiele et al., 1998). Deschampsia antarctica y Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl., son las únicas plantas vasculares que han colonizado en forma natural la Antártida (Alberdi et al., 2002). Pueden mantener un 30 a 40% de sus tasas fotosintéticas máximas a 0°C, siendo la temperatura óptima para este proceso de 13 y 19°C, respectivamente (Edwards & Smith, 1988). Estos autores señalan, que en la mayoría de las especies de gramíneas septentrionales o australes (subpolares), una fotosíntesis neta significativa, se produce en un rango de temperaturas entre 0 y -5°C. En ambientes de bajas temperaturas, otro factor que puede también contribuir a limitar la fotosíntesis es la intensidad lumínica, lo que puede conducir a fotoinhibición (Powles, 1984; Moll & Steinback, 1986; Schöner & Krause, 1990; Mishra et al., 1993). La temperatura óptima para la fotosíntesis exhibida por una especie vegetal refleja el rango de temperaturas ambientales en las cuales las especies crecen en su ambiente natural (Berry & Björkman, 1980; Sakai & Larcher, 1987; Larcher, 1995). La mayoría de los estudios en relación con el efecto de las bajas temperaturas sobre la fotosíntesis se refieren a plantas de altura o cultivadas. Pocos estudios referentes a este tema se han realizado en plantas vasculares capaces de colonizar la región Antártica (Edwards & Smith,1988; Xiong et al., 1999). Mayores antecedentes bibliográficos al respecto en Alberdi et al. (2002). En el presente estudio, y mediante el uso de diferentes parámetros de fluorescencia, se pretende evaluar los cambios en la eficiencia fotoquímica primaria del PSII, que pudieran dar cuenta de daños fotoinhibitorios en D. antartica, sometida al efecto simultáneo de frío e intensidad lumínica y su posible asociación con el ciclo de las xantofilas. Adicionalmente, se pretende estudiar el efecto que posee una aclimatación previa al frío sobre los parámetros anteriores. 22 2.6. Hipotesis Teniendo en cuenta las condiciones climáticas (alta luminosidad y bajas temperaturas) bajo las cuales D. antarctica crece y fotosintetiza durante el verano antártico, y a las cuales debería estar adaptada, se formula la hipótesis siguiente: D. antarctica debiera mantener una alta eficiencia fotoquímica (no fotoinhibirse) del PSII, aún cuando interactúen simultáneamente bajas temperaturas y altas intensidades de flujo fotónico. El aumento de carotenoides, disipadores de energía, específicamente zeaxantina, en respuesta a condiciones de alto flujo fotónico y baja temperatura, sería el mecanismo que evita el daño fotoinhibitorio en esta especie. 2.7. Objetivos generales Estudiar los cambios en la eficiencia fotoquímica del PSII en plantas no aclimatadas y aclimatadas al frío de D. antarctica, sometidas al efecto simultáneo del frío y altas intensidades lumínicas, por tiempo variable y establecer los cambios de concentración de pigmentos fotoprotectores (carotenoides), que pudiesen asociarse a estas condiciones. 2.8. Objetivos especificos En plantas de D. antarctica no aclimatadas y aclimatadas al frío y sometidas al efecto simultáneo del frío y diferentes niveles de intensidad lumínica, por tiempo variable, se determinarán los siguientes objetivos específicos: a) Evidenciar los cambios que experimentan los diversos parámetros de fluorescencia de la clorofila a del PSII. b) Establecer los cambios en contenido hídrico foliar. c) Determinar la concentración de pigmentos (clorofila a, b). d) Determinar los cambios en los contenidos de carotenoides totales y de los pigmentos del ciclo de las xantofilas (zeaxantina, anteraxantina, violaxantina). 23 3. MATERIAL Y METODOS 3.1. Condiciones de crecimiento Se trabajó con plantas de D. antarctica colectadas en la Isla Robert (Antártida Marítima) y cultivadas en el laboratorio de Ecofisiología Vegetal del Instituto de Botánica de la Facultad de Ciencias de la Universidad Austral de Chile. El cultivo se realizó en una cámara climática (Sigma Scientific) a 13±1,5°C (óptimo fotosintético de esta especie Smith, 1994), 65-70% de humedad relativa, fotoperíodo de 21/3 h luz/oscuridad y a una intensidad lumínica o densidad de flujo fotónico (PFD) de aproximadamente 180 µmol m-2s-1. La iluminación fue proporcionada por lámparas de luz fría (cool-white lamps), (Sylvania/GTE, Danvers MA, USA), cuyos PFD se controlaron con fotómetro (Li-Cor modelo LI-189). El sustrato estuvo constituido por una mezcla de suelo orgánico y turba (3:1 p/p). Las plantas se regaron cada tres días a 80% de la capacidad de campo del suelo, alternadamente, con agua y solución nutritiva (Phostrogen®). 3.2. Condiciones de aclimatación al frío Un grupo de plantas (45) crecidas a 13±1,5°C y a las condiciones anteriores fue transferido a otra cámara de crecimiento, para ser aclimatadas a 4±1,5°C por 21 días (plantas aclimatadas = A), mientras que otro grupo con la misma cantidad de plantas permaneció a 13±1,5°C (plantas no aclimatadas = NA). Las otras condiciones de la cámara fueron las mismas que las descritas en el párrafo anterior. Después de los 21 días ambos grupos de plantas se transfirieron a otras cámaras para iniciar el tratamiento fotoinhibitorio. Previo a esto, se determinaron los parámetros de fluorescencia, contenidos hídricos y peso seco, además de los contenidos de pigmentos en las plantas provenientes de cada tratamiento. 24 3.3. Tratamiento fotoinhibitorio Para probar si esta especie se fotoinhibe bajo el efecto combinado del frío y alta intensidad lumínica, plantas NA y A (Fig. 6), provenientes de los tratamientos anteriores fueron trasladadas independientemente a dos cámaras. En una de ellas las plantas fueron sometidas a 4±1,5°C y a diferentes densidades de flujo fotónico (PFDs; 200, 600 y 1000 µmol m-2s-1) a diferentes tiempos (0, 6, 12, 18 y 24 horas de irradiación), mientras que en otra cámara, las plantas fueron sometidas a las mismas PFDs, pero a 13±1,5°C. La determinación de los parámetros de fluorescencia, pigmentos, contenidos hídricos y peso seco, se realizó después de finalizado cada tratamiento. La fuente de luz fue proporcionada por una lámpara de vapor de sodio de alta presión ubicada sobre una capa de circulación de agua fría, para favorecer la mantención de las temperaturas, evitando un sobrecalentamiento. En este trabajo se utilizarán indistintamente los términos de intensidad lumínica y densidad de flujo fotónico (PFD), para referirse a la intensidad de luz aplicada. 3.4. Medición in vivo de la fluorescencia de la clorofila a La emisión de fluorescencia de la clorofila a del PSII, se determinó utilizando un fluorímetro de pulso de amplitud modulada “Fluorescence Monitoring Systems” (FMS 1, Hansatech Instruments Ltd., Reino Unido). Los parámetros cinéticos de inducción de fluorescencia registrados con este equipo se muestran en la (Fig. 5) y se explican más adelante. Para las mediciones de fluorescencia, hojas bien desarrolladas de D. antarctica, unidas a la planta, provenientes de los diferentes tratamientos, se oscurecieron con pinzas (provistas de una abertura cubierta por una placa central móvil, sobre la que se adapta la fibra óptica a aproximadamente 10 mm de distancia), por 30 minutos, para lograr que todos los componentes de la cadena transportadora de electrones (QA) se encuentren completamente oxidados (abiertos). Luego, se aplicó sobre la pinza el cabezal con la fibra óptica, y se deslizó la lámina oscurecedora de la pinza, para permitir el paso de los diferentes pulsos de luz. La clorofila a es excitada por medio de una luz modulada de débil intensidad (<0,1 µmol m-2s-1). Con esta activación la fluorescencia emitida corresponde a Fo, que es definida como la fluorescencia de hojas adaptadas a la oscuridad, cuando todos los centros de reacción del PSII y 25 las moléculas aceptoras de electrones (QA) están totalmente oxidados. Mediante la aplicación de un pulso corto de luz saturante de alta intensidad (9000 µmol m-2s-1) por 0,7 segundos se obtiene la fluorescencia máxima o potencial (Fm), que corresponde al punto en que todos los aceptores de electrones del PSII se reducen. La diferencia entre Fm y Fo es la máxima capacidad de energía fotoquímica de la muestra y es definida como fluorescencia variable (Fv). Cuando las muestras han estado previamente oscurecidas, el parámetro Fv/Fm corresponde al rendimiento cuántico óptimo, máximo o potencial del PSII, el cual es un buen indicador de la eficiencia fotosintética. Luego, las hojas se iluminan continuamente con luz actínica a una intensidad de luz aproximadamente de 180 µmol m-2s-1 (hojas fotosintetizando) y la fluorescencia evoluciona desde un máximo hasta llegar a una condición de equilibrio o “steady state” (Fs). Posteriormente, el equipo emite un nuevo pulso de luz saturante (9000 µmol m-2s-1), con el cual se obtiene la fluorescencia máxima de hojas adaptadas a la luz (Fm’). En seguida, por apagamiento de la luz actínica y encendido de un pulso de rojo lejano de 3 segundos se obtiene la fluorescencia mínima de las hojas adaptadas a la luz (Fo’). Cuando las muestras se encuentran adaptadas a la luz se obtiene el rendimiento cuántico efectivo del PSII (ФPSII), coeficiente de “quenching” fotoquímico (qP), coeficiente de “quenching” no fotoquímico (qNP) y la tasa relativa de transporte de electrones (rETR). FIGURA 6. Aspecto de plantas cultivadas en laboratorio a partir de reproducción vegetativa (clones) de Deschampsia antarctica Desv., provenientes de Isla Robert (Antártida Marítima), en diferentes condiciones. El cultivo se realizó, en cámara climática (Sigma Scientific) con 65-70% de humedad relativa, fotoperíodo de 21/3 h luz/oscuridad, y a una intensidad lumínica ≈180 µmol m-2s-1. Plantas aclimatadas al frío fueron mantenidas a 4±1,5°C, durante 21 días y no aclimatadas a 13±1,5°C por el mismo tiempo. Ambos grupos fueron sometidos a tratamiento fotoinhibitorio. Las plantas aclimatadas presentan menor crecimiento, sus hojas poseen menor superficie, son más densas y plegadas por sus bordes que las no aclimatadas. 26 El equipo registra las señales de los diferentes tipos de fluorescencia y calcula en forma automática los parámetros de fluorescencia. Los parámetros y las fórmulas entregadas por el software FMS 1,05 (Hansatech, Reino Unido) se indican a continuación (Schreiber et al., 1986): Fo = fluorescencia inicial. Fm = fluorescencia máxima o potencial. Fv = fluorescencia variable = Fm – Fo. Fv/Fm = eficiencia fotoquímica máxima o potencial, del PSII de plantas previamente oscurecidas. Indica el rendimiento cuántico máximo del PSII, que se obtiene cuando todos los centros del PSII se encuentran abiertos (oxidados). Fm’ = fluorescencia máxima real. 27 Fv’ = fluorescencia variable efectiva bajo condiciones de iluminación = Fm’ – Fo’. Fs = fluorescencia en el estado estacionario. Fo’ = fluorescencia mínima de hojas adaptadas a la luz. Fv’/Fm’ = eficiencia fotoquímica efectiva del PSII, de plantas iluminadas. Señala la eficiencia en la captura de energía de exitación, por los centros abiertos del PSII. ФPSII = rendimiento cuántico efectivo del PSII de plantas previamente iluminadas, que fue determinado por Genty et al. (1989) de acuerdo a la siguiente fórmula: Este parámetro proporciona información sobre el rendimiento cuántico del transporte de electrones en el PSII. qP = coeficiente de “quenching” fotoquímico o “quenching” fotoquímico = qNP = coeficiente de “quenching” no foquímico o “quenching” no fotoquímico = rETR = tasa relativa de transporte de electrones = 28 3.5. Determinación del contenido hídrico El contenido hídrico de las muestras foliares se determinó por el método gravimétrico, estableciéndose las diferencias entre el peso fresco (PF) y el peso seco (PS) de ellas, siguiendo las indicaciones de Steubing et al. (2002). Para la obtención del peso seco, el material vegetal, previamente pesado, se colocó 10 minutos en una estufa a 105°C (para inactivar enzimas), y posteriormente a 80°C hasta peso constante. La diferencia entre los pesos proporcionó el contenido de agua de los tejidos, el que fue expresado en porcentaje y calculado de la siguiente forma: 3.6. Determinación de clorofilas y carotenoides totales Para extraer y cuantificar clorofilas a, b (Chl a y b) y carotenoides totales (Car) se utilizó el protocolo propuesto por Lichtenthaler y Willburn (1983). Se homogeneizó 0,15 g de material foliar fresco con 20 mL de metanol, en un mortero enfriado sobre hielo. El extracto fue filtrado (papel filtro ADVANTEC MFS Nº1) y recolectado en un matraz aforado de 20 mL. Se trabajó en oscuridad y con los matraces recubiertos con papel aluminio para evitar descomposición de los pigmentos por efecto de la luz. La medición de la absorbancia de los extractos se realizó inmediatamente en un espectrofotómetro (Metertek SP-850) a longitudes de onda de 666, 653 y 470 nm, utilizando metanol como blanco. Para el cálculo de las concentraciones de clorofilas y carotenoides se utilizaron las siguientes fórmulas: 29 3.7. Extracción de pigmentos y separación de xantofilas Los pigmentos fotosintéticos y protectores (carotenoides oxigenados) fueron extraídos a partir de un macerado en baño de hielo de 0,15 g de tejido foliar (material no dañado y fresco) después del tratamiento fotoinhibitorio. Las extracciones se realizaron lo más rápidamente posible después de la obtención del material, para evitar la degradación oxidativa o la rápida destrucción enzimática de carotenoides que ocurre inmediatamente cuando las hojas son cortadas (Law & Rilling, 1985). Cuando los tejidos no pudieron ser extraídos inmediatamente, éstos se almacenaron con nitrógeno líquido en un congelador a -30°C. Por la presencia de agua en los tejidos y la insolubilidad de los carotenoides en ella, éstos fueron extraídos tres veces con 3 mL de metanol 100% grado HPLC, solvente orgánico polar miscible en agua. La primera extracción con 3 mL de metanol, si bien removió muy poco pigmento, secó el tejido y permitió la eficiente remoción durante las siguientes extracciones. Debido a su alto grado de insaturación, los carotenoides son muy inestables al oxígeno, luz, calor, ácidos y álcalis, lo que puede formar artefactos oxidados. Para evitar ésto el macerado del material vegetal se realizó en un baño de hielo, con metanol frío bajo luz roja y usando un flujo suave de N2, para minimizar la oxidación e isomerización (Law & Rilling, 1985). El sobrenadante obtenido de las tres extracciones se recolectó en Eppendorf ámbar de 2,0 mL y fue centrifugado a 5000 x g por 3 minutos. Para la obtención de pigmentos del ciclo de las xantofilas más puros y libres de clorofilas se realizó una separación de fases, que involucró la partición del extracto en metanol 100% centrifugado, entre dos fases de solventes inmiscibles de diferente polaridad, 9 mL de éter de petróleo y 9 mL de metanol acuoso 40%. Los compuestos no polares, carotenos, epóxidos de caroteno, ésteres de xantofilas y clorofilas, quedaron en la epifase con éter de petróleo y las xantofilas polares fueron recuperadas desde la inferior o hipofase (Law & Rilling, 1985). La separación, identificación y determinación de los pigmentos del ciclo de las xantofilas se realizó 30 inmediatamente después de la separación de fases, por HPLC de fase reversa de la hipofase o fracción en metanol. Cuando las muestras de carotenoides o extractos con carotenoides, (≈12 mL) contenidos en viales ámbar (para evitar la isomerización trans-cis por la luz directa o radiación UV), no se alcanzaron a analizar inmediatamente, se almacenaron en un congelador a -30°C, en una atmósfera completamente inerte (las soluciones fueron burbujeadas con N2 a través de un tubo capilar por unos minutos). Trazas de oxígeno son suficientes para causar descomposición aún a temperaturas congelantes. 3.7.1. Separación y determinación de pigmentos del ciclo de las xantofilas por la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Las separaciones de carotenoides han sido realizadas por HPLC fase normal y HPLC fase reversa. El HPLC-fase normal incluye fases adsorptivas (como sílice y alúmina) y fases polares enlazadas (alquilamina, alquilnitrilo, y alquilglicol) conjuntamente con fases móviles no polares, donde los sitios polares de las moléculas de carotenoides, compiten con solventes por los sitios adsorptivos en la fase estacionaria. Durante esta forma de cromatografía, los carotenoides menos polares (hidrocarbonos o carotenos) eluyen primero, mientras los carotenoides oxigenados (xantofilas) son retenidos más tiempo (Packer, 1992). El HPLC-fase reversa incorpora fases no polares enlazadas (tal como octyl C8 y octyldecil C18) y fases poliméricas (polistireno-divinil benceno y polimetacrilato), conjuntamente con fases móviles polares. Los carotenoides se reparten entre la fase estacionaria no polar y la fase móvil polar. Durante el HPLC-fase reversa, las xantofilas se reparten más efectivamente en la fase móvil y, por lo tanto, eluyen primero mientras que los carotenos se reparten preferencialmente en la fase estacionaria y eluyen después (Packer, 1992). Ambas, HPLC-fase normal y HPLC-fase reversa, pueden ser corridas con el mismo solvente todo el tiempo (elución isocrática), lo que implica una separación que utiliza un solo disolvente de composición constante, o con composición cambiante de solvente durante la corrida (elución en gradiente), que utiliza dos o más disolventes con una polaridad significativamente distinta, variando la relación de los disolventes en forma programada, ya sea continuamente o mediante una serie de etapas escalonadas. 31 La columna envasada más comúnmente usada para la separación de carotenoides es octildecilsilano (ODS o C18). Las razones para la popularidad de empaques C18 incluye compatibilidad con la mayoría de los solventes, utilidad para el rango total de polaridad de los carotenoides, y amplia disponibilidad comercial. Aunque la gran mayoría de métodos de HPLC-fase reversa usan columnas C18, no todos los empaques C18 son los mismos. Factores tales como tamaño y forma de la partícula, diámetro del poro, superficie protegida (carbón cargado), “end capping”, y síntesis monomérica vs. polimérica influencian la separación resultante (Packer, 1992). Basándonos en lo anteriormente planteado, la separación y determinación de las muestras de carotenoides (zeaxantina, anteraxantina y violaxantina), fueron realizadas por cromatografía HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent) de fase reversa en una columna Phenomenex Luna 5 μ C18 (250 x 4,60 mm, tamaño de partícula 5 µm) provista de precolumna C18 5 μ para eliminar materia en suspensión y contaminantes de los disolventes. 50 µL de las muestras (extractos en metanol) previamente filtradas (filtro de teflón ADVANTEC MFS 0,2 µm), para eliminar partículas sólidas suspendidas, fueron inyectadas a un flujo de 2,5 mL min-1, controlado por una bomba peristáltica cuaternaria, a temperatura ambiente y con una longitud de onda de detección a 446 nm utilizando detector UV-visible. La longitud de onda fue elegida de acuerdo a los espectros de absorción de las muestras y estándares (Fig. 7), medidas en un espectrofotómetro UV-visible de doble haz (UNICAM UV500) y a la comparación de las alturas, separaciones y resoluciones de los picos que permitieran una buena identificación y cuantificación de cada una de las xantofilas en las corridas cromatográficas. Todo esto se realizó teniendo presente las longitudes de onda señaladas por los fabricantes en el caso de los estándares y de los rangos de longitudes de onda citadas en referencias bibliográficas, esto es, entre 440-460 nm. Una separación eficiente, acortando el tiempo de separación, sin sacrificar la resolución de los primeros picos, se logró usando una gradiente modificada de solventes: acetonitrilo-metanolbuffer Tris HCl 0,1 M pH 8,0 (72:8:3) y metanol-acetato de etilo (68:32) (Thayer & Björkman, 1990; Almela et al., 1990; Gilmore & Yamamoto, 1991; Huck et al., 2000; Polle, et al., 2001). La mezcla de solventes acetonitrilo-metanol-buffer Tris HCl 0,1 M pH 8,0, fue corrida isocráticamente de 0 a 6 min, seguidos por 10 min de un gradiente lineal a 100% de la mezcla de 32 solventes metanol-acetato de etilo y 4 min de corrida isocrática con la última mezcla de solventes. Entre cada inyección de muestras la columna fue re-equilibrada, con la primera mezcla de solventes, por un mínimo de 5 min, para eliminar los efectos residuales de la mezcla de solventes metanol-acetato de etilo. 3.7.2. Identificación de carotenoides del ciclo de las xantofilas La identificación de los carotenoides del ciclo de las xantofilas se realizó mediante la comparación de los tiempos de retención de los picos obtenidos para los extractos con los de estándares puros de zeaxantina, anteraxantina y violaxantina (DHI Water & Environment, Hørsholm, Dinamarca) en etanol 100% con coeficientes de extinción de 254 L g-1cm-1 a 450 nm, para zeaxantina, de 235 L g-1cm-1 a 446 nm, para anteraxantina y 255 L g-1cm-1 a 443 nm, en el caso de violaxantina. Los cromatogramas de los estándares y las muestras fueron obtenidos bajo exactamente las mismas condiciones de temperatura, gradiente y flujo (Fig. 8). 3.7.3. Cuantificación de los carotenoides del ciclo de las xantofilas Para cuantificar los picos de los carotenoides identificados se realizó una curva de calibración con cada uno de los estándares a concentraciones conocidas: zeaxantina 0,09, 0,18, 0,27, 0,36 y 0,45 mg L-1; anteraxantina 0,09, 0,19, 0,28, 0,37 y 0,47 mg L-1; violaxantina 0,22, 0,44, 0,66, 0,88 y 1,10 mg L-1 (Fig. 9) y se obtuvieron las siguientes ecuaciones de las rectas para FIGURA 7. Espectro de absorción de muestras (extractos en metanol) de tejido foliar de D. antarctica (A) y estándares etanólicos de xantofilas (violaxantina, anteraxantina y zeaxantina) (B), empleados en la elección de la longitud de onda, para la detección y cuantificación de las xantofilas en las muestras por HPLC. 33 calcular las concentraciones de cada pigmento: Donde A corresponde al área de los picos identificados y C a la concentración. 3.8. Diseño experimental El diseño experimental fue realizado completamente al azar, utilizando grupos de plantas (45 plantas) NA y A al frío, las que se sometieron a diferentes tiempos de tratamiento e intensidades lumínicas. Se realizaron dos o tres experimentos con tres réplicas cada uno. 34 Con los resultados obtenidos se realizaron análisis estadísticos con el programa computacional Sigma Stat 3,0. Con el fin de determinar si las diferencias entre los resultados eran significativas se realizaron análisis de varianza (ANOVA) de tres y dos factores, considerando el tratamiento, tiempo de tratamiento e intensidad de flujo fotónico. Con el Test de Tukey se establecieron si las diferencias entre los promedios eran significativas o no. FIGURA 8. Cromatograma de carotenoides del ciclo de las xantofilas en extractos de D. antarctica resueltos por HPLC (Hewlett Packard serie 1100 Agilent) fase reversa, columna Phenomenex Luna 5 μ C18 (250 x 4,60 mm, tamaño de partícula 5 µm) provista de precolumna C18 5 μ, inyectando 50 µL de muestra a un flujo de 2,5 mL min-1, controlado por bomba peristáltica cuaternaria, longitud de onda 446 nm con detector UV-visible, a temperatura ambiente, con gradiente de CH3OH: CH3CN: buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8,0 y CH3OH: CH3COOC2H5. Tiempos de retención: Violaxantina (11,8 min), Anteraxantina (13,3 min), Zeaxantina (14,3 min). FIGURA 9. Curvas de calibración de estándares puros de zeaxantina, anteraxantina y violaxantina, corridos en HPLC fase reversa, de acuerdo a las indicaciones señaladas en el capitulo de materiales y métodos. 35 36 4. RESULTADOS 4.1. Parámetros de fluorescencia del PSII Salvo algunas excepciones, no se presentaron diferencias significativas (P<0,05) entre las variaciones de fluorescencia inicial (Fo), la fluorescencia máxima (Fm) y fluorescencia variable (Fv) de las plantas NA y A a las diferentes intensidades lumínicas y tiempos (Fig. 10). En las plantas NA se encontraron diferencias entre el Fo del inicio y del final del experimento, sólo a los 200 y 600 µmol m-2s-1, y a las 24 horas entre los Fo medidos a 1000 y 600 µmol m-2s-1. En las plantas A a 200 y 600 µmol m-2s-1, la Fm aumentó significativamente (P<0,05) al final del tratamiento, siendo mayor el aumento a la menor intensidad lumínica. A la mayor intensidad lumínica, se advirtió un curso bastante fluctuante de las Fm, que alcanzó valores mínimos a las 12 y 24 horas de tratamiento. Tendencias similares a Fm presentaron las Fv de las plantas A, siendo por lo general mayores a 200 µmol m-2s-1 y menores a 1000 µmol m-2s-1. Cabe destacar que los valores de Fv fueron más altos en las A que en las NA. La eficiencia fotoquímica máxima (Fv/Fm) (Fig. 11) no presentó diferencias significativas entre plantas NA y A (P>0,05). Los valores se ubicaron entre los rangos de 0,83-0,71 en plantas NA y 0,83-0,75 en plantas A. Plantas A y NA presentaron un mayor descenso de los Fv/Fm a mayor intensidad lumínica a los diferentes tiempos de tratamiento, en comparación con plantas sometidas a las menores intensidades, siendo este descenso más marcado, pero no estadísticamente significativo, en las plantas NA que en las A. El coeficiente de apagamiento fotoquímico (qP), -que da cuenta de la transformación de la energía en el PSII y la cadena transportadora de electrones en el proceso fotoquímico-, de las plantas NA a diferentes PFDs presentaron un curso irregular durante el tratamiento, alcanzándose al término de éste, valores muy similares entre ellos (Fig. 11). Estos valores no fueron estadísticamente significativos con respecto al valor inicial. Plantas A presentaron qP menores que los de las plantas NA al principio (0 y 6 horas) del tratamiento, a las tres intensidades de luz 37 utilizadas (P<0,05), aumentando a partir de las 12 horas, pero sin manifestar diferencias significativas (P>0,05) entre los diferentes rangos lumínicos. En plantas A a la mayor PFD, un ascenso de los qP se correlacionó significativamente con un descenso de los Fv/Fm (r = -0,89; P<0,05). El coeficiente de apagamiento no fotoquímico (qNP), -que indica la disipación de energía como calor o energía de transferencia-, presentó valores considerablemente más altos en las plantas A al frío, con relación a las NA (Fig. 11). El rendimiento cuántico efectivo del PSII (ФPSII), fue más estable y en general más bajo en las plantas A al frío que en las plantas NA (Fig. 12). En ambos grupos de plantas el mayor ФPSII se obtuvo a la menor PFD utilizada. Tanto en plantas A como NA, el ФPSII se correlacionó positivamente con los Fv/Fm, en cada una de las PFDs empleadas. La velocidad relativa de transporte de electrones (rETR) fue generalmente más alta en las plantas A al frío, en comparación con las plantas NA aclimatadas a todos los niveles de luz empleados (Fig. 12), siendo en ambos casos muy fluctuante. 4.2. Contenido hídrico El contenido hídrico de las plantas NA a 200 µmol m-2s-1, sólo presentó diferencias estadísticamente significativas (P<0,05), entre los valores obtenidos a las 6 y 12 horas (valores más altos) del tratamiento con respecto al de 0 horas (Tabla 1). A una PFD de 1000 µmol m -2s-1, los contenidos hídricos mayores se presentaron a las 18 y 12 horas respectivamente, los que se diferenciaron significativamente (P<0,05) de los menores contenidos hídricos obtenidos en los otros tiempos. Plantas A a la menor PFD, presentaron por lo general mayores contenidos hídricos que las plantas A a intensidades mayores, habiéndose encontrado diferencias estadísticamente significativas entre los 200 y 600 µmol m-2s-1, al tiempo de 12 horas y entre los 200 y 1000 µmol m-2s-1 a las 12 horas. Contenidos hídricos de plantas A y NA fueron diferentes entre sí (P<0,05) a las 6, 12 y 24 horas, del tratamiento de iluminación a 200 µmol m-2s-1; a las 6 horas con la intensidad lumínica de 600 µmol m-2s-1; y a las 6, 12, 18 y 24 horas a 1000 µmol m-2s-1 de intensidad de luz (Tabla 1). 38 4.3. Pigmentos foliares Los contenidos en Chl a de las plantas A a una misma PFD fueron muy similares en cada uno de los tiempos, mientras que los contenidos Chl b presentaron diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) sólo entre las 18 horas y las 0, 12 y 24 horas a la mayor intensidad lumínica empleada (1000 µmol m-2s-1). En las plantas NA existieron diferencias entre los contenidos en Chl a medidos en los tiempos (0 y 12 horas) a la intensidad lumínica de 200 µmol m-2s-1. Con respecto a Chl b hubo diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) entre las 12 horas y el control, y entre las 24 horas con el control a 200 y 600 µmol m-2s-1 respectivamente (Tabla 2). No hubo diferencias significativas en las concentraciones de Chl a de plantas NA y A a diferentes PFDs, a excepción de las plantas sometidas a 200 µmol m-2s-1 durante 6-12 horas, y 600 µmol m-2s-1 a las 24 horas de tratamiento (P<0,05) (Tabla 2). Las concentraciones de clorofilas totales de plantas NA con respecto al control, no presentaron por lo general, diferencias estadísticamente significativas (P>0,05) entre las intensidades de luz y tiempos empleados en el tratamiento, salvo a las 12 horas a una intensidad lumínica de 200 µmol m-2s-1 (Fig. 13). FIGURA 10. Parámetros de fluorescencia de la clorofila a del PSII (Fo, Fm y Fv) de plantas de D. antarctica, crecidas durante 21 días a 13±1,5ºC (NA) y a 4±1,5ºC (A) con una intensidad lumínica de ≈180 µmol m-2s-1 y sometidas a la acción simultánea de estrés frío y lumínico (a intensidades de flujo fotónico de 200, 600 y 1000 µmol m-2s-1). 39 FIGURA 11. Parámetros de fluorescencia de la clorofila a del PSII (Fv/Fm, qP y qNP) de plantas de D. antarctica no aclimatadas (NA) y aclimatadas (A) al frío. Sometidas a condiciones de estrés frío e intensidades de flujo fotónico de 200, 600 y 1000 µmol m-2s-1. 40 FIGURA 12. Parámetros de fluorescencia de la clorofila a del PSII (ФPSII, rETR) de plantas de D. antarctica no aclimatadas (NA) y aclimatadas al frío (A). Sometidas a condiciones de estrés frío e intensidades de flujo fotónico de 200, 600 y 1000 µmol m-2s-1. 41 TABLA 1. Contenido hídrico (%) en plantas de D. antarctica no aclimatadas (NA) y aclimatadas (A) al frío. Las letras mayúsculas distintas indican diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) entre las intensidades lumínicas del tratamiento, a un mismo tiempo; las letras minúsculas diferentes señalan diferencias estadísticamente significativas entre los tiempos del tratamiento a una misma intensidad de luz. (*) = Diferencias estadísticamente significativas entre plantas NA y A a un determinado tiempo e intensidad lumínica. Los valores son promedios de dos experimentos individuales con tres réplicas cada uno ± su error medio estándar. Intensidad de luz (µmol m-2s-1) 200 Tiempo (h) 0 6 12 18 Contenido hídrico (%) NA 69,83±0,93 a 73,50±0,50 b* 73,21±0,60 Ab* 71,50±0,50 Aab A 68,94±1,16 a 70,00±1,00 a 71,00±0,00 Aa 70,50±1,50 a 42 600 1000 24 0 6 12 18 24 0 6 12 18 24 70,50±0,50 ab* 69,83±0,93 a 70,50±0,50 a* 68,75±0,00 Ba 69,00±2,00 Ba 70,71±0,71 a 69,83±0,93 a 72,00±0,00 ba* 74,00±0,00 Abc* 74,50±0,50 Cc* 70,50±0,50 a* 68,18±0,65 a 68,94±1,16 a 67,00±0,00 a 67,50±0,50 Ba 68,50±0,50 a 68,50±0,50 a 68,94±1,16 ab 69,50±0,50 bc 67,00±0,00 Bad 71,50±0,50 c 66,28±1,16 d Los contenidos en clorofila total de plantas A al frío y sometidos a la mayor intensidad lumínica, presentaron un curso fluctuante especialmente a los 1000 µmol m-2s-1, sin presentar diferencias significativas (P>0,05) a las 12, 18 y 24 horas respectivamente, evidenciando los valores más bajos al final del tratamiento (Fig. 13). Diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) en los contenidos de clorofilas totales entre las plantas NA y A, fueron observados a las 6 y 12 horas a la intensidad de luz de 600 µmol m-2s-1, y a 24 horas del tratamiento fotoinhibitorio a 600 µmol m-2s-1. En la misma figura se observa, que los contenidos en carotenoides totales de las plantas A y NA fueron prácticamente iguales a las tres intensidades de flujo fotónico utilizadas. El cuociente Chl a/Chl b no presentó diferencias estadísticamente significativas (P>0,05) en las plantas NA, a ninguna intensidad lumínica (Tabla 3). En las plantas A esta razón solamente tuvo diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) entre las 6 y 18 horas; 6 y 24 horas a 600 µmol m-2s-1 de intensidad lumínica. Chl a/Chl b sólo presentó cambios estadísticamente significativos (P<0,05) entre los dos grupos de plantas (A y NA) a las 24 horas a 200 µmol m-2s-1 y transcurridas 12 horas del tratamiento fotoinhibitorio a la máxima intensidad lumínica de 1000 µmol m-2s-1 (Tabla 3). La relación (Chl a+Chl b)/Car de las plantas NA fue significativamente mayor (P<0,05) que la de las A, las tres PFDs utilizadas, exceptuándose las 18 horas a 1000 µmol m -2s-1 (Tabla 3). Plantas NA a las diferentes intensidades lumínicas no mostraron en general, diferencias estadísticamente significativas en los diferentes tiempos empleados, a excepción de la mayor intensidad lumínica utilizada en que hubo diferencias entre las 6 y 24 horas (P<0,05). En cambio, las plantas A 43 mostraron diferencias significativas a 200 µmol m-2s-1 entre las 0 y 12 y entre 12 y 24 h. A la intensidad lumínica intermedia se detectaron diferencias entre 0, 12 y 18 horas y a la máxima intensidad las diferencias significativas (P<0,05) se obtuvieron entre los dos primeros tiempos (0 y 6) y los tiempos restantes. También fueron significativamente diferentes los cuocientes obtenidos a las 12 y 24 horas con respecto a las 18 horas. 4.4. Ciclo de las xantofilas En las plantas NA a la intensidad de luz intermedia (600 µmol m-2s-1), el nivel de zeaxantina aumentó, con respecto al control, desde las 6 hasta las 24 horas, mientras que a la mayor intensidad lumínica (1000 µmol m-2s-1), este aumento se estabilizó a las 12 horas de iluminación (Fig. 14). A 200 µmol m-2s-1 y a las 12 horas de iluminación se detectó un aumento de los niveles de zeaxantina, con respecto al control, el que fue seguido de un posterior descenso. Hubo diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) en los contenidos en zeaxantina obtenidos a las 24 y 12 horas, con respecto al control, a PFDs de 1000 y 600 µmol m-2s-1. Durante el tratamiento fotoinhibitorio, las concentraciones de violaxantina de las plantas NA, fueron en general, las mayores de los tres carotenoides investigados, en especial a las últimas horas de tratamiento. Plantas A presentaron casi siempre niveles más altos de zeaxantina las NA (Fig. 14). Altos valores de zeaxantina, con respecto a los controles, se obtuvieron en la plantas A a la mayor intensidad lumínica, ya en las primeras 6 horas de impuesto el estrés, en que los valores del pigmento prácticamente se duplicaron, manteniéndose hasta las 12 horas, para descender paulatinamente hasta las 24 horas (P<0,05), en que se obtuvieron concentraciones similares al control. También se detectó un aumento significativo (P<0,05) en las concentraciones de zeaxantina en las horas finales del tratamiento (18 y 24 horas) a una intensidad lumínica de 200 µmol m-2s-1, en relación al inicio del tratamiento. TABLA 2. Concentración de clorofila a (Chl a) y clorofila b (Chl b) en muestras no aclimatadas (NA) y aclimatadas (A) al frío de D. antarctica. Las letras minúsculas diferentes señalan 44 diferencias estadísticamente significativas entre los tiempos del tratamiento a una misma intensidad de luz. (*) = Diferencias estadísticamente significativas entre plantas NA y A a un determinado tiempo e intensidad lumínica. Los valores son promedios de dos experimentos individuales con tres réplicas cada uno ± su error medio estándar. Intensidad de luz (µmol m-2s-1) Tiempo (h) 200 0 6 12 18 24 0 6 12 18 24 0 6 12 18 24 600 1000 Chl a (mg g PS) (mg g-1PS) NA A 5,80±0,86 a 5,61±0,47 a 7,86±1,12 ab* 5,74±0,43 a 8,70±0,14 b* 6,64±0,34 a 6,95±0,57 ab 6,12±0,34 a 7,46±0,19 ab 5,97±0,48 a 5,80±0,86 a 5,61±0,47 a 5,99±0,75 a 4,28±0,12 a 5,94±0,97 a 4,87±0,35 a 7,18±1,14 a 5,53±0,47 a 8,31±0,11 a* 5,06±0,67 a 5,80±0,86 a 5,61±0,47 a 6,79±1,77 a 6,39±0,30 a 7,73±1,12 a 4,74±0,24 a 6,99±1,29 a 8,99±0,92 a 7,27±0,48 a 4,31±0,50 a -1 Chl b (mg g PS) (mg g-1PS) NA A 2,24±0,34 a 2,27±0,14 a 3,12±0,41 ab* 2,40±0,12 a 3,49±0,06 b* 2,83±0,13 a 2,83±0,26 ab 2,62±0,13 a 2,96±0,11 ab 2,55±0,17 a 2,24±0,34 a 2,27±0,14 a 2,53±0,29 ab 1,93±0,09 a 2,37±0,42 ab 1,97±0,14 a 2,78±0,42 ab 2,07±0,19 a 3,38±0,05 b* 1,95±0,25 a 2,24±0,34 a 2,27±0,14 a 2,53±0,59 a 2,55±0,17 ba 2,87±0,38 a 1,91±0,06 a 2,79±0,51 a 3,73±0,34 b 2,81±0,18 a* 1,63±0,18 a -1 FIGURA 13. Concentración de clorofilas y carotenoides totales de muestras obtenidas a partir de tejido foliar de plantas no aclimatadas (NA) y aclimatadas (A) al frío de D. antarctica a diferentes PFDs. Los valores son promedios de dos experimentos con tres replicas cada uno ± su error medio estándar. 45 TABLA 3. Relación clorofila a clorofila b Chl a/Chl b y relación clorofilas totales carotenoides totales Chl a+Chl b/Car en muestras no aclimatadas (NA) y aclimatadas (A) al frío de D. antarctica. Las letras mayúsculas distintas indican diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) entre las intensidades lumínicas del tratamiento, a un mismo tiempo; las letras minúsculas diferentes señalan diferencias estadísticamente significativas entre los tiempos del tratamiento a una misma intensidad de luz. (*) = Diferencias estadísticamente significativas entre plantas NA y A a un determinado tiempo e intensidad lumínica. Los valores son promedios de dos experimentos individuales con tres réplicas cada uno ± su error medio estándar. Intensidad de luz (µmol m-2s-1) Tiempo (h) NA Chl a/Chl b A 200 0 6 12 2,60±0,01 a 2,52±0,04 a 2,49±0,02 a 2,45±0,09 a 2,39±0,08 a 2,34±0,04 a Chl a+Chl b/Car NA A 4,92±0,07 a* 5,21±0,06 a* 5,18±0,13 a* 4,43±0,07 a 4,60±0,06 ab 4,79±0,03 Ab 46 600 1000 18 24 0 6 12 18 24 0 6 12 18 24 2,46±0,02 a 2,52±0,08 a* 2,60±0,01 a 2,36±0,10 a 2,53±0,05 a 2,58±0,03 a 2,46±0,01 a 2,60±0,01 a 2,64±0,11 a 2,68±0,05 a* 2,51±0,02 a 2,59±0,02 a 2,33±0,06 a 2,34±0,04 a 2,45±0,09 ab 2,23±0,04 b 2,48±0,16 ab 2,67±0,02 a 2,59±0,05 a 2,45±0,09 a 2,52±0,05 a 2,47±0,05 a 2,41±0,03 a 2,63±0,04 a 4,88±0,14 a* 4,89±0,04 a* 4,92±0,07 a* 4,91±0,08 a* 4,84±0,17 a* 4,74±0,02 a* 4,99±0,04 a* 4,92±0,07 ab* 5,02±0,03 a* 4,94±0,05 ab* 4,88±0,12 ab 4,60±0,04 b* 4,48±0,03 Aab 4,45±0,07 Aa 4,43±0,07 a 4,20±0,22 ab 3,87±0,04 Bb 3,87±0,14 Bb 4,05±0,21 Bab 4,43±0,07 a 4,38±0,08 a 3,98±0,05 Bb 5,05±0,17 Cc 3,83±0,07 Bb Cabe destacar que los mayores contenidos de zeaxantina encontrados en las plantas A a la mayor intensidad lumínica, en casi todos los tiempos de tratamiento, se correspondieron con un descenso significativo en los niveles de violaxantina (r = -0,6; P<0,05) a diferencia de lo ocurrido en las plantas NA en que la correlación entre estos compuestos fue significativamente positiva (r = 0,7; P<0,05). Los niveles del intermediario anteraxantina, en general, fueron muy similares en los grupos de plantas A y NA (Fig. 14). La comparación entre los grupos de plantas experimentales permite establecer que sólo en plantas NA y a 200 µmol m-2s-1, anteraxantina presentó un aumento de sus concentraciones al final del tratamiento (24 horas). En plantas NA, violaxantina presentó un aumento en su concentración a partir de las 6 horas de tratamiento a 200 µmol m-2s-1 hasta las 18 horas, disminuyendo a las 24 horas. A 600 µmol m-2s1 , las plantas NA aumentaron sus concentraciones de violaxantina (P<0,05) desde las 12 horas hasta las 24 horas de irradiación, en que se obtuvieron valores altos con relación al control. La concentración de este carotenoide a la mayor intensidad lumínica del tratamiento, aumentó desde las 12 a 18 horas, con una leve disminución a las 24 horas, en comparación con la concentración obtenida a las 18 horas. Al comparar las concentraciones de violaxantina obtenidas a las tres intensidades lumínicas en las plantas NA, se advierte una mayor concentración a las 18 horas a las tres intensidades utilizadas y a las 24 horas a las intensidades de 600 y 1000 µmol m-2s-1. Durante el tratamiento fotoinhibitorio con la intensidad de luz más alta, se observó un marcado aumento en la concentración de violaxantina a las 18 horas, en que se obtuvo el valor más alto, el que disminuyó posteriormente (24 horas). La concentración de este pigmento fue mayor en las plantas NA que en las A entre las 6 a 24 horas de tratamiento lumínico. Al respecto, debe tenerse 47 en cuenta, lo señalado más arriba, respecto a la disminución significativa de violaxantina concomitante con un aumento de zeaxantina. Las xantofilas totales, zeaxantina + anteraxantina + violaxantina (Z+A+V) de las plantas NA no presentaron diferencias significativas (P>0,05), entre las intensidades lumínicas usadas en el tratamiento fotoinhibitorio a un mismo mismo tiempo, pero sí con respecto a diferentes tiempos. Es así que en comparación al control, se detectaron aumentos a las 12, 18 y 24 horas, a 200 y 1000 µmol m-2s-1 y a las 18 y 24 horas a 600 µmol m-2s-1 (Tabla 4). Las plantas A presentaron diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) entre los 200 µmol m-2s-1 y las otras intensidades lumínicas empleadas a las 24 horas de tratamiento. A la menor intensidad lumínica, las xantofilas totales de plantas A presentaron un leve aumento a las 18 horas, el que se mantuvo estable hasta las 24 horas. A los 1000 µmol m-2s-1, se observó un aumento de este pigmento a las 12 horas, el cual evidenció una brusca caída a las 18 y 24 (Tabla 4). Diferencias significativas entre las xantofilas totales de las plantas NA y A se encontraron sólo en el tiempo 0 a los tres PFD empleados y a las 6 horas de iluminación a la intensidad de luz intermedia. La razón de violaxantina a xantofilas totales V/(Z+A+V) de las plantas NA presentó un transcurso diferente a la menor intensidad de luz con respecto a la intensidad intermedia y mayor. Mientras que a 200 µmol m-2s-1, se presentó un aumento significativo con respecto al control, a las 18 horas (P<0,05), a 600 y 1000 µmol m-2s-1 se detectó un descenso estadísticamente significativo a las 6 horas (P<0,05) de tratamiento y luego un ascenso (Fig. 15). En las plantas A esta razón presentó una disminución con respecto al control, a las tres intensidades de luz empleadas, siendo estadísticamente significativas (P<0,05) a partir de las 12 horas a 200 µmol m2 -1 s ; desde las 6 horas a 600 y 1000 µmol m-2s-1, encontrándose los valores más bajos a la mayor intensidad lumínica del tratamiento fotoinhibitorio. Esto es consistente con el aumento de zeaxantina concomitante a la disminución de violaxantina encontrado a esta intesidad lumínica y al que nos hemos referido anteriormente. Los menores valores V/(V+A+Z) se encontraron en plantas A a la mayor intensidad lumínica utilizada. El nivel o estado de de-epoxidación del ciclo de las xantofilas (Z+A)/(Z+A+V) indica la eficiencia en la formación de zeaxantina, por la acción de la enzima violaxantina de-epoxidasa, a partir de violaxantina, pasando por el intermediario anteraxantina. Presentó un curso fluctuante a 48 las tres intensidades lumínicas empleadas en las plantas NA, encontrándose un aumento estadísticamente significativo (P<0,05) con respecto al control a las 6 horas, el cual disminuye y se mantiene estable desde las 12 a 24 horas, a las intensidades de 600 y 1000 µmol m -2s-1. A 200 µmol m-2s-1 los valores experimentaron aumentos estadísticamente significativos (P<0,05) a las 12 y 24 horas, y una disminución a las 18 horas, con respecto al control (Fig. 15). Los cambios más evidentes del nivel de de-epoxidación se obtuvieron en las plantas A a la máxima intensidad lumínica, en que a partir de las 6 horas y hasta el final del experimento se produjo un aumento significativo de este cuociente. Estos cambios coincidieron con descensos del cuociente V/(V+A+Z) (P<0,05). A las intensidades de 200 y 600 µmol m-2s-1 el nivel de de-epoxidación se mantuvo constante desde las 0 a 18 horas, aumentando a las 24 horas del tratamiento (Fig. 15). Cabe destacar que al final del experimento el estado de de-epoxidación de las plantas NA fue menor que el de las A (P<0,05) a las tres intensidades de luz aplicadas en la cinética de fotoinhibición. Nótese que el alto nivel de de-epoxidación encontrado a partir de las 6 horas a la máxima intensidad lumínica coincide con un incremento en zeaxantina y descenso de violaxantina. FIGURA 14. Concentración de zeaxantina, anteraxantina y violaxantina de plantas no aclimatadas (NA) y aclimatadas (A) al frío de D. antarctica, sometidas a diferentes densidades de flujo fotónico durante 24 horas. Las letras mayúsculas distintas indican diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) entre las intensidades lumínicas del tratamiento, a un mismo tiempo; las letras minúsculas diferentes señalan diferencias estadísticamente significativas entre los tiempos del tratamiento a una misma intensidad de luz. (*) = Diferencias estadísticamente significativas entre plantas NA y A a un determinado tiempo e intensidad lumínica. Los valores son promedios de dos experimentos individuales con tres réplicas cada uno ± su error medio estándar. 49 TABLA 4. Xantofilas totales (Z+A+V) en plantas de D. antarctica no aclimatadas (NA) y aclimatadas (A). Las letras mayúsculas distintas indican diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) entre las intensidades lumínicas del tratamiento, a un mismo tiempo; las letras minúsculas diferentes señalan diferencias estadísticamente significativas entre los tiempos del tratamiento a una misma intensidad de luz. (*) = Diferencias estadísticamente significativas entre plantas NA y A a un determinado tiempo e intensidad lumínica. Los valores son promedios de dos experimentos individuales con tres réplicas cada uno ± su error medio estándar. 50 Intensidad de luz (µmol m-2s-1) Tiempo (h) 200 0 6 12 18 24 0 6 12 18 24 0 6 12 18 24 600 1000 Xantofilas totales (µg g-1PS) NA 70,59±1,76 a 80,61±0,39 ab 100,55±0,73 b 108,80±0,57 b 109,05±1,68 b 70,59±1,76 a 68,74±0,49 a 91,26±0,49 ab 117,49±0,73 b 118,04±0,57 b* 70,59±1,76 a 94,40±1,15 ab 104,75±1,52 b 122,26±0,35 b* 119,27±0,58 b* A 107,34±1,11 ab* 89,17±1,05 b 108,42±1,02 ab 122,22±0,63 a 121,43±4,25 Aa 107,34±1,11 a* 93,77±0,55 a* 103,39±1,91 a 109,92±1,11 a 83,26±3,75 Ba 107,34±1,11 a* 106,25±1,92 a 113,31±0,89 a 94,99±0,11 ab 70,43±2,19 Bb FIGURA 15. Nivel de de-epoxidación (Z+A)/(Z+A+V) y razón de violaxantina a xantófilas totales: V/(Z+A+V) de plantas de D. antarctica no aclimatadas (NA) y aclimatadas (A) al frío, sometidas a condiciones de estrés frío y lumínico durante 24 horas. 51 52 5. DISCUSION Con la presente tesis se pretendía establecer si el efecto combinado de una alta intensidad lumínica y baja temperatura producía efectos fotoinhibitorios del aparato fotosintético, en plantas de la Gramínea D. antarctica, evidenciados por cambios en la emisión de fluorescencia de la clorofila a del PSII. Asimismo, se deseaba establecer si una aclimatación previa al frío mejoraba la respuesta del PSII a estos factores y si había indicios de fotoprotección del PSII que estuviesen mediados por el ciclo de las xantofilas. La eficiencia fotoquímica máxima (Fv/Fm), indicadora del rendimiento cuántico máximo del PSII, de plantas A y NA a los dos menores niveles de intensidad lumínica utilizados, presentó valores indicadores de un óptimo estado fisiológico (≈0,83) (Björkman & Demmig, 1987; Johnson et al., 1993; Maxwell & Johnson, 2000). Estos experimentaron un descenso, (≈0,71) a la mayor intensidad lumínica y al mayor tiempo de exposición a la luz, el que fue más marcado en las plantas NA (12,4% con respecto al control), que en las A (7% con respecto al control). Dependiendo de los rangos de los valores de Fv/Fm que se acepten como normales, la apreciación sobre la presencia o ausencia de fotoinhibición a la mayor intensidad lumínica es variable. Si además del valor de alrededor 0,83, que los autores recién indicados consideran como normal para plantas no fotoinhibidas ante algún estrés, nos remitimos al reporte de Somersalo & Krause (1989), que considera valores de Fv/Fm por debajo de 0,7 como indicadores de fotoinhibición, ninguna de las intensidades lumínicas utilizadas en nuestro estudio, podría ser considerada como fotoinhibitoria. En un intento de compatibilizar estas dos opiniones, hemos optado por considerar que sólo en las plantas NA a la mayor intensidad lumínica y al final del tratamiento se podría asumir un comienzo de fotoinbición, ya que Fv/Fm se sitúo el límite (0,71), a partir del cual se puede asumir este proceso. Este descenso sería más bien sugerente de una desestabilización del fotosistema II, la que fue más marcada en las plantas NA que en las A. Por lo tanto, el tratamiento frío, fue favorable para mantener una mayor estabilidad del PSII ante una alta intensidad de luz. Estos resultados coinciden con los de (Somersalo & Krause, 1989, 1990a, 1990b; Huner et al., 1993; Gray et al., 1994), quienes han encontrado que hojas de espinaca 53 (Spinacia oleracea) aclimatadas al frío y expuestas a una alta luminosidad, exhiben una mayor capacidad de tolerar una alta luminosidad, en relación con las no aclimatadas. La resistencia a la fotoinhibición de D. antarctica ante el efecto combinado de frío y alta luminosidad se corresponde con la capacidad de tolerancia a la congelación que posee esta especie (Bravo et al., 2001). Este comportamiento es comparable al que exhiben los cereales de invierno (trigo y centeno) altamente resistentes a la congelación (Öquist et al., 1993), lo que sería un reflejo de la capacidad de mantener las QA oxidadas bajo alta irradiancia y baja temperatura (Huner et al., 1996). Diferente es lo que ocurre con algunas plantas leñosas, como el pino aclimatado al frío, en que a pesar de la alta resistencia a la congelación se presenta fotoinhibición ante condiciones de alta luminosidad y frío. Coincidente con la mayor disminución de la eficiencia fotosintética máxima a 1000 µmol m-2s-1, en plantas NA y A, de D. antarctica, con respecto a sus controles, se presentaron casi siempre mayores Fo que los obtenidos a las menores intensidades lumínicas, no habiendo diferencias importantes entre los valores de ningún grupo de plantas, lo que indica que con respecto a este factor, no es posible predecir un efecto negativo de la mayor intensidad lumínica sobre el aparato fotosintético. Además, las diferencias de Fo en los distintos niveles lumínicos y tiempos utilizados fueron casi siempre no significativas. Un ascenso de Fo, que refleja reducción de las QA, ha sido relacionado con una disminución de la eficiencia fotosintética en muchas plantas (Krause & Weiss, 1984). Comparativamente, la emisión de Fm fue mayor en plantas A que NA a las tres densidades de flujo fotónico utilizadas, lo que estaría indicando una mayor resistencia a la fotoinhibición de las plantas A, con respecto a las NA, bajo las condiciones de estrés empleadas, lo que es coincidente con lo reportado por Gilmore et al., (1996); Müller et al., (2001). La no existencia de una disminución significativa de Fv, en las plantas NA y A a la mayor intensidad lumínica, durante el transcurso del experimento, con respecto al inicio, hace también pensar que no habría daño del aparato fotosintético, a esta intensidad de radiación. Un decrecimiento drástico de Fv puede estar asociado con daños en el sistema en el que ocurre la fotólisis del agua (Brüggemann & Linger, 1994). Por lo tanto, ambos grupos de plantas bajo estas condiciones no son fotoinhibidas. Sin embargo, la emisión de Fv algo mayor en el grupo de 54 plantas A al frío que en las NA, sugeriría la presencia de un mecanismo fotoprotector más eficiente en el primer grupo de plantas. En cada nivel de luz empleado, la eficiencia fotoquímica máxima (Fv/Fm) de plantas NA y A se asoció positivamente con el rendimiento cuántico efectivo del PSII (ФPSII) (r = 0,57-0,96), lo que estaría también apoyando que esta especie no se fotoinhibiría a ninguna de las intensidades lumínicas utilizadas y que por lo tanto, la vía fotoquímica estaría transcurriendo favorablemente, ya que los electrones serían transportados para favorecer la reducción del CO2 y por ende la fotosíntesis (Maxwell & Johnson, 2000). El aumento del qNP de plantas A con respecto a las NA, podría asociarse a una disipación más eficiente del exceso de energía lumínica absorbida como calor, proceso que se efectúa en el ensamblaje de la antena del PSII (Demmig et al., 1988; Demmig-Adams et al., 1996; Ort, 2001; Govindjee, 2002; Elrad et al., 2002). Debido a que las xantofilas juegan un rol muy importante en el proceso de disipación de la energía térmica a nivel de la antena del PSII, se hicieron mediciones del pool de pigmentos de las xantofilas, para evidenciar su interconversión y su participación en la fotoprotección de la especie en estudio. El análisis global de los resultados, permite establecer que sólo en plantas A al frío y bajo el efecto combinado de baja temperatura y la más alta luminosidad, se pudo advertir un ascenso de zeaxantina a expensas de la disminución de violaxantina (P<0,05), tal como ocurre en plantas que poseen una eficiente capacidad de disipar energía por la vía del ciclo de las xantofilas (Govindjee, 2002). Habría sido esperable que este grupo de plantas tuviesen a la máxima intensidad lumínica, los valores más altos de qNP. Sin embargo, estos fuerom muy similares a los de las plantas sometidas a menores niveles de luz, siendo todos ellos visiblemente mayores que los obtenidos en las plantas NA. En general, se considera que la magnitud del qNP en plantas está estrechamente correlacionada con los niveles de zeaxantina formados en el ciclo de xantofilas (Demmig-Adams & Adams, 1996), aún cuando existen excepciones. Es así, que en mutantes de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (npq1), incapaces de convertir violaxantina en zeaxantina, en presencia de un exceso de luz, por mutación recesiva del gen que codifica para la enzima violaxantina de-epoxidasa, se ha encontrado un qNP residual, que podría ser debido a niveles bajos, pero persistentes de anteraxantina y zeaxantina (Niyogi et al., 1998; Niyogi, 1999). Estudios con tilacoides aislados 55 han sugerido que la zeaxantina amplifica el qNP en un cierto rango de pH, pero que la pH es todo lo que se requiere para producir el qNP (Noctor et al., 1991). Sin embargo, no estamos en condiciones de responder con este estudio esa interrogante. Por otro lado, en mutantes del alga verde unicelular, Chlamydomonas reinhardtii (npq1), incapaces de de-epoxidar violaxantina a zeaxantina, se ha demostrado que el “quenching” no fotoquímico es sólo parcialmente defectivo en esta especie, lo que indicaría que no todo este “quenching” depende de la operatividad del ciclo de las xantofilas, sugiriéndose un posible rol de la luteína, que es la xantofila más abundante del tilacoide, en el qNP (Niyogi et al., 1997). La comparación de los resultados del alga Chlamydomonas con los del mutante de Arabidopsis, (Arabidopsis npq1), y un mutante de esta misma especie (npq2) que acumula zeaxantina constitutivamente, han demostrado que en este último mutante no se altera la magnitud de qNP, mientras que en el mutante npq1 el qNP es bajo. Esto demuestra que en Arabidopsis la de-epoxidación de la violaxantina es requerida para la magnitud alcanzada por el qNP ante una alta intensidad lumínica (Niyogi et al., 1998). Estos resultados junto a otros reportes (Johnson et al., 1994) proporcionan evidencias inequívocas sobre la participación de la enzima violaxantina de-epoxidasa en el “quenching” no fotoquímico, aunque diferentes eucariotes fotosintéticos utilicen el ciclo de las xantofilas en diferente grado, para la disipación del exceso de energía lumínica absorvida. En nuestro estudio, la acumulación de zeaxantina expresada como tal y en altos niveles de deepoxidación, sólo en las plantas A a la mayor intensidad de luz y en presencia de baja temperatura (Figs. 14 y 15), podría interpretarse como una respuesta adaptativa al frío (aclimatación), inducida por el efecto combinado de estos factores de estrés. Aún cuando se conoce que la conversión de violaxantina a anteraxantina y zeaxantina ocurre lentamente a bajas temperaturas en muchas plantas, como por ejemplo espinaca (AdamsIII et al., 1995b), no es menos cierto que la previa aclimatación al frío favorece una rápida formación de zeaxantina a temperaturas de enfriamiento (Demmig-Adams et al., 1989). Si tenemos en cuenta, que la deepoxidación de la violaxatina a zeaxantina ocurre sólo ante un “exceso” de luz, que no es el mismo para cada planta (Fryer et al., 1995; Adams III et al., 1995), la máxima intensidad de luz utilizada en nuestro estudio (1000 µmol m-2s-1), podría constituir el “exceso” de luz necesaria para gatillar la reacción, pero sólo en plantas aclimatadas al frío y sometidas posteriormente al efecto combinado de alta intensidad lumínica y baja temperatura. Las intensidades de luz 56 menores no serían capaces de provocar un aumento de zeaxantina, pues talvez no representan el “exceso” de luz necesario para provocar fotoinhibición y por ende la puesta en marcha del mecanismo de disipación del exceso de energía, via acumulación de zeaxantina. Todo esto parece lógico si se tienen presente las condiciones ambientales (bajas temperaturas y alta intensidad lumínica) a que está sometida esta planta en su ambiente natural (Antártida) durante el período de crecimiento (Alberdi et al., 2002). A este punto nos referiremos más adelante. La estabilidad del aparato fotosintético de D. antarctica ante el efecto combinado de una baja temperatura y alta intensidad lumínica, evidenciada por nuestros resultados, es concordante con mediciones de la fotosíntesis relizadas en esta especie in situ (Xiong et al., 1999; Xiong et al., 2000). Estos investigadores han reportado que la fotosíntesis no es afectada por una alta intensidad lumínica, pero sí por una alta temperatura. Ellos encontraron tasas de fotosíntesis neta altas (2,6 µmol CO2 m-2s-1) en días de temperaturas inferiores a 10ºC en que las intensidades lumínicas, radiación fotosintéticamente activa (PAR) fueron superiores a 500 µmol m-2s-1, superando a veces 1500 µmol m-2s-1, mientras que en días con temperaturas >20ºC y PAR de alrededor 1500 µmol m-2s-1 la fotosíntesis fue de 0,2 µmol CO2 m-2s-1. La mayor vulnerabilidad de la fotosíntesis de plantas de regiones frías, a temperaturas moderadamente altas pareciera no estar aún totalmente dilucidada, aunque se ha sugerido que por lo menos, en líquenes esto cursa con un ascenso de la respiración (Kappen, 2000; Alberdi et al., 2002). También podría asumirse una disminución de actividad de enzimas claves del ciclo de Calvin (Xiong et al., 1999). Sin embargo, la mantención de una adecuada eficiencia fotosintética a temperaturas relativamente bajas y altas intensidades lumínicas, podría residir, por lo menos en parte, en la alta estabilidad del PSII (fase fotoquímica primaria de la fotosíntesis) ante estos factores como se demuestra en este estudio para D. antarctica. Especial interés para explicar la operatividad del proceso fotosintético, de esta especie en el ambiente natural, ante condiciones de temperaturas moderadamente bajas y alta luminosidad, proporcionan nuestros resultados, de acuerdo a los cuales, la posibilidad de poner en marcha el ciclo de las xantofilas a una intensidad lumínica alta (1000 µmol m-2s-1) siempre que se esté en presencia de una temperatura relativamente baja, podría contribuir a favorecer el disipamiento de un exceso de energía vía zeaxantina. A las intensidades lumínicas menores en que se observan 57 qNP similares al observado a la mayor intensidad lumínica, podrían operar otros mecanismos disipadores de energía diferentes del ciclo de xantofilas (Niyogi et al., 1997). Otro mecanismo que podría explicar la no operacionalidad del ciclo de las xantofilas en D. antarctica, a las intensidades de luz menores en presencia de frío o en el grupo de las plantas NA, sería la acumulación constitutiva de algún otro tipo de pigmento fotoprotector, como ser la luteína, como se ha reportado en la parásita Cuscuta reflexa (Bungard et al., 1999). Estos investigadores propusieron, por primera vez, que en esta especie operan dos ciclos distintos de carotenoides, ambos gatillados por la luz: el ciclo de las xantofilas y el ciclo de la luteína-5-epóxido. En C. reflexa no se formaría neoxantina que deriva de la epoxidación de la zeaxantina, la cual a su vez deriva del β-caroteno. Violaxantina está presente en la especie, de modo que sólo faltaría un paso de la síntesis, desde la violaxantina a la neoxantina. Como dijéramos violaxantina es también el sustrato primario de la de-epoxidación a zeaxantina, gatillada por la luz. Bajo exposición de C. reflexa a alta radiación se encontraron bajos niveles de luteína-5-epóxido, los que desaparecieron tan rápidamente como la violaxantina, por efecto de la luz, acumulándose luteína y los productos de de-epoxidación de la violaxantina. Este mecanismo no estuvo presente en espinaca tratada a alta intensidad lumínica. La luteína es un carotenoide que está presente en altas cantidades (hasta un 60% del total de carotenoides) en el sistema captador de energía de la antena cloroplástica y está implicado en la protección del fotodaño en algunas plantas y al que se le ha atribuido un papel importante en la disipación de energía (Pogson et al., 1998 en Bungard et al., 1999). Existen otros mecanismos disipadores de energía y de sus consecuencias nocivas (acumulación de especies tóxicas de oxígeno), diferentes a los mencionados, que podrían sugerirse para D. antarctica, como ser, una disipación de la energía por vía fotosintética (reducción del CO2) o presencia de antioxidantes (Demmig-Adams & Adams, 1992). Efectivamente, como señaláramos más arriba, esta especie presenta una fotosíntesis eficiente, aún a intensidades lumínicas altas, siempre que la temperatura no sea superior a 20ºC. Las depresiones de la fotosíntesis encontradas al mediodía en terreno (verano antártico), se deberían a la temperatura alta y no a la alta radiación (Xiong et al., 1999; Alberdi et al., 2002). Si tenemos en cuenta que en nuestros experimentos los niveles de intensidad lumínica se aplicaron a temperaturas inferiores a 20º (4ºC en las plantas A y 13ºC en la NA), es posible asumir que la fotosíntesis de estas plantas no fue bloqueada por las mayores intensidades de luz utilizadas. Esto habría permitido un eficiente traslado de electrones 58 por la vía de la reducción del CO2, lo que habría evitado la acumulación de energía térmica, que en otro caso debería disiparse por la vía del ciclo de las xantofilas u otra. Los elevados qP encontrados dan cuenta de una eficiente utilización del poder reductor en la vía no fotoquímica. Se sabe además, que hojas con altas tasas de fotosíntesis exhiben menores tasas de-epoxidación y mayor epoxidación (Demmig-Adams & Adams, 1992). Por otro lado, de haber habido acumulación de especies tóxicas (ROS), éstas podrían haber sido combatidas por la presencia de antioxidantes. Efectivamente, recién se ha demostrado que esta especie posee un eficiente “pool” de antioxidantes (Pérez et al., resultados sin publicar). Esta suposición se apoya en postulados de Sommersalo y Krause (1990), quienes señalan, que en espinaca el endurecimiento previo al frío y la exposición a alta intensidad de luz, induce efectivos mecanismos antioxidantes, los que hacen a las hojas menos suceptibles a la fotoinhibición. Existen evidencias de que en Rosmarinus officinalis sometida a sequía y a una alta energía de exitación, se produce una pérdida de clorofila, la que ha sido considerado como una respuesta adaptativa que reduce el daño de la maquinaria fotosintética ante el exceso de luz (Munné-Bosch & Alegre, 2000). Los menores contenidos en clorofila reducen la absorción luz, y el daño posterior por la formación de especies reactivas de oxígeno. Nuestros resultados no demostraron disminución de clorofila ante el estrés frío, sino más bien una mantención de sus contenidos por lo que podría suponerse que la disminución de este pigmento estaría asociada principalmente a un déficit hídrico. Los resultados en relación al buen funcionamiento del ciclo de las xantofilas ante la acción combinada del frío y de la mayor intensidad lumínica en esta especie, representan un desafio para estudiar a futuro la actividad de la enzima violaxantina de-epoxidasa en presencia de estos factores, lo que lamentablemente escapó de nuestro propósito. BIBLIOGRAFIA Adams, W. W. III., Demmig-Adams, B., Barker, D. H., Kiley, S. 1996. Carotenoids and photosystem II characteristics of upper and lower halves of leaves acclimated to high light. Aust. J. Plant Physiol. 23:669-677. 59 Adams, W. W. III., Demmig-Adams, B., Verhoeven, A. S., Barker, D. 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