Clases de RNA

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Capítulo 8
RNA: Transcripción y procesamiento.
Preguntas clave:
¿En qué difiere la estructura del RNA de la del DNA?
¿Cuáles son las distintas clases de RNA que hay en la célula?
¿Cómo se coloca correctamente la RNA polimerasa para comenzar la transcripción?
¿Por qué se considera tan importante el descubrimiento del corte y empalme autónomo
de los intrones?
Esquema:
8.1
RNA
8.2
Transcripción
8.3
Transcripción en eucariotas
8.4
RNAs funcionales
Los científicos han sido capaces de determinar el número de genes en distintos
organismos, tanto simples como complejos, empleando el conocimiento recientemente
adquirido de la secuencia de DNA de genomas completos. A primera vista no hubo
sorpresas; la bacteria Escherichia coli tiene cerca de 3.200 genes, la levadura eucariota
unicelular Sacharomices cerevisiae tiene alrededor de 6.300 genes y la mosca
multicelular Drosophila melanogaster unos 13.600 genes. Bajo el supuesto que una
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mayor complejidad requería un mayor número de genes, las primeras estimas predecían
que en nuestro genoma había alrededor de 100 000 genes. En una conferencia centrada
en la investigación genómica en el 2000, los científicos crearon un fondo común de
apuestas informal llamado GeneSweep, cuyo monto ganaría la persona que predijera con
más exactitud el número real de genes en el genoma humano. Los números propuestos
oscilaban entre 26 000 y 150 000 genes.
Con la publicación del primer borrador de la secuencia, se anunció un ganador.
Sorprendentemente, fue declarado ganador el apostante con la estima más baja, de
25 947 genes.
(Fin de página 295)
(Principio de página 296)
¿Cómo puede ser que Homo sapiens, con su complejo cerebro y su sofisticado sistema
inmunológico, tenga sólo el doble de genes del que tienen los gusanos y el mismo
número de genes que la primera planta secuenciada, la mala hierba Arabidopsis
thaliana? La respuesta a esta pregunta está relacionada al extraordinario descubrimiento
hecho a finales de los años 70, cuando se descubrió que las proteínas de los organismos
superiores están codificadas en piezas discontinuas en el DNA, y no en un tramo
continuo como ocurre en las bacterias. De esta forma, los genes de los eucariotas
superiores suelen están compuestos por piezas llamadas exones (del inglés “expressed
region”, regiones que se expresan) que codifican partes de las proteínas y por piezas
llamadas intrones (del inglés, “intervening region”, regiones intermedias) que separan a
los exones. Como ya se verá en este capítulo, una copia de RNA que contiene tanto
exones como intrones se sintetiza a partir de un gen. La maquinaria biológica llamada
empalmosoma (del inglés, spliceosome), elimina los intrones y empalma los exones, en
2
un proceso de corte y reunión llamado corte y empalme de RNA (del inglés, RNA
splicing) para producir un RNA maduro que contiene la información continua necesaria
para sintetizar una proteína.
¿Qué relación tienen los intrones y los exones con el bajo número de genes presente
en los humanos? Por ahora, es suficiente decir que el RNA transcrito a partir de un gen
puede empalmarse de distintas formas alternativas. Aunque tengamos sólo alrededor de
25 000 genes, estos genes codifican para más de 100 000 proteínas, gracias al proceso
del corte y empalme alternativo del RNA (en inglés, alternative splicing).
En este capítulo, se verán los primeros pasos de la transferencia de información desde
los genes a los productos génicos. En la secuencia de DNA del genoma de cualquier
organismo está codificada la información que especifica cada uno de los productos
génicos que un organismo puede fabricar. Estas secuencias de DNA también contienen
información que determina cuándo, cuánto, y dónde se debe hacer el producto. Sin
embargo, esta información es estática y se encuentra embebida en la secuencia de DNA.
Para utilizar esta información, debe sintetizarse una molécula intermediaria que sea una
copia de un gen discreto empleando una molécula de DNA como guía. Esta molécula es
el RNA y al proceso de su síntesis desde el DNA se denomina transcripción.
La transferencia de información desde el gen al producto génico tiene lugar en varios
pasos. El primero de ellos, que es el tema principal de este capítulo, es copiar
(transcribir) la información a una cadena de RNA empleando el DNA como guía o
molde para el alineamiento. En procariotas, la información en el RNA se convierte en
una cadena de aminoácidos prácticamente de forma inmediata por un proceso
denominado traducción. Este segundo paso será el tema principal del Capítulo 9. En
eucariotas, la transcripción y la traducción están separadas espacialmente: la
transcripción tiene lugar en el núcleo y la traducción en el citoplasma. Sin embargo,
3
antes que el RNA esté listo para trasportarse al citoplasma para la traducción, debe
someterse a un proceso exhaustivo, que incluye la eliminación de los intrones; la
adición de una caperuza en el extremo 5’ y de una cola de nucleótidos de adenina en el
extremo 3’. Al RNA completamente procesado se lo denomina RNA mensajero
(mRNA, del inglés, messenger RNA).
La función del DNA y el RNA se fundamenta en dos principios:
1. La complementariedad de bases es la responsable en la determinación de la
secuencia de una nueva cadena de DNA en la replicación y del transcrito de
RNA
en
la
transcripción.
A
través
del
emparejamiento
de
bases
complementarias, se replica el DNA y la información codificada en el DNA pasa
a RNA (y finalmente a proteína).
2. Ciertas proteínas reconocen secuencias particulares de bases en el DNA. Estas
proteínas de unión a los ácidos nucleicos reconocen a las secuencias y actúan
sobre ellas.
Se verán estos dos principios en la discusión detallada de todos los procesos
implicados en la transcripción y la traducción en este capítulo y los siguientes.
Mensaje: Las transacciones del DNA y RNA se producen a través del
emparejamiento de bases complementarias y de la unión de proteínas a sitios específicos
en el DNA o el RNA.
(Fin de la página 296)
(Principio de la página 297)
8.1.
RNA
4
Los primeros investigadores tenían buenas razones para pensar que la información no
se trasfiere en forma directa del DNA a la proteína. En una célula eucariótica, el DNA
se encuentra en el núcleo, mientras que las proteínas se sintetizan en el citoplasma. Se
requería un intermediario.
Los primeros experimentos sugieren un RNA intermediario
En 1957, Elliot Volkin y Lawrence Astrachan hicieron una observación significativa.
Descubrieron que uno de los cambios moleculares más llamativos que se produce
cuando el fago T2 infecta a E. coli, es una rápida explosión de síntesis de RNA. Más
aún, el RNA inducido por el fago se “extingue” rápidamente; su tiempo de vida medio
es breve, del orden de minutos. Su rápida aparición y desaparición sugiere que el RNA
podría jugar un papel en la expresión del genoma de T2 para que pueda fabricar más
partículas virales.
Volkin y Astrachan demostraron la rápida desaparición del RNA empleando un
protocolo llamado “experimento de pulso y caza” (del inglés, pulse-chase experiment).
Para llevar a cabo este experimento, se suministra uracilo radiactivo a la bacteria
infectada durante un período de tiempo muy corto, un pulso; el uracilo es una molécula
necesaria para la síntesis de RNA pero no para la síntesis de DNA. Cualquier RNA
sintetizado en la bacteria, a partir del contacto con el uracilo, estará “marcado” con la
molécula radioactiva. Después del pulso, se lava el uracilo radioactivo y se reemplaza
por uracilo que no es radioactivo. Este procedimiento “caza” la marca que se encuentra
fuera del RNA, ya que el RNA se rompe, y sólo los precursores sin marca estarán
disponibles para la síntesis de nuevas moléculas de RNA; los precursores marcados
quedan “diluidos” por el exceso enorme de uracilo añadido sin marcar. El RNA que se
recupera inmediatamente después del pulso está marcado, pero el que se recupera
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transcurrido un determinado tiempo después de la caza está sin marcar, indicando que el
RNA tiene un tiempo de vida muy corto.
Se puede realizar un experimento similar con células eucarióticas. Primero, durante
un periodo muy corto de tiempo, se colocan las células con uracilo radiactivo, y luego
se transfieren a un medio rico en uracilo pero que no es radiactivo. En las muestras
tomadas después del pulso, la mayor parte de la marca está en el núcleo. En las muestras
tomadas después de la caza, el RNA marcado está en el citoplasma (Figura 8-1). Por lo
que parece, en los eucariotas el RNA se sintetiza en el núcleo, tras lo cual se mueve
hacia el citoplasma, donde se sintetizan las proteínas. De esta forma, el RNA es un buen
candidato como intermediario en la transferencia de la información entre el DNA y las
proteínas.
Propiedades del RNA
Se considerarán las características generales del RNA. Aunque el RNA y el DNA son
ácidos nucleicos, el RNA difiere del DNA en algunos aspectos importantes:
1. El RNA generalmente es una molécula de una sola cadena de nucleótidos, no es
una doble hélice como el DNA. Como consecuencia de esta característica, el
RNA es más flexible y puede formar una gran variedad de estructuras
moleculares complejas en tres dimensiones. Una cadena de RNA puede curvarse
de tal forma que sus bases pueden aparearse entre sí. El apareamiento
intramolecular de las bases es un determinante importante de la forma del RNA.
2. El RNA tiene el azúcar ribosa en sus nucleótidos, y no la desoxirribosa del
DNA. Como sugieren sus nombres, los dos azúcares difieren en la presencia o
ausencia de sólo un átomo de oxígeno. El RNA contiene un grupo hidroxilo
6
(OH) unido al átomo de carbono 2’, mientras que el azúcar del DNA sólo
contiene un átomo de hidrógeno.
Como se verá en este Capítulo, la presencia del grupo hidroxilo facilita la acción del
RNA en muchos procesos celulares importantes.
(Fin de página 297)
(Principio de página 298)
Al igual que una cadena individual de DNA, una cadena de RNA está formada un
esqueleto de azúcar-fosfato, con una base ligada covalentemente a la posición 1’ de
cada ribosa. Los enlaces azúcar-fosfato se realizan entre las posiciones 5’ y 3’ del
azúcar, igual que en el DNA; de manera que la cadena de RNA tendrá un extremo 5’ y
otro 3’.
3. Los nucleótidos de RNA, llamados ribonucleótidos, contienen las bases adenina,
guanina, y citosina, pero está presente la base pirimidínica uracilo (abreviada U)
en vez de la timina.
El uracilo forma puentes de hidrógeno con la adenina, igual que lo hace la timina.
La Figura 8-2 muestra los cuatro ribonucleótidos presentes en el RNA.
Además, el uracilo es capaz de aparearse con la base G. Las bases U y G forman
pares de bases sólo cuando el RNA se pliega, y no durante la transcripción. Los dos
puentes de hidrógeno que se forman entre la U y la G son más débiles que los que se
forman entre la U y la A. La capacidad de la U de emparejarse tanto con A como con
G es una propiedad importante que permite al RNA formar estructuras complicadas y
extensas, que intervienen en importantes procesos biológicos.
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4. El RNA, como si fuera una proteína y a diferencia del DNA, puede catalizar una
reacción biológica. El nombre ribozima se acuñó para las moléculas de RNA
que funcionan como una enzima proteica.
Clases de RNA
Los RNA pueden agruparse en dos clases generales. Una clase de RNA codifica la
información necesaria para hacer cadenas de polipéptidos, o sea, proteínas. Se refiere a
esta clase como RNA mensajero (mRNA), porque, como un mensajero, sirve
(Fin de página 298)
(Principio de página 299)
de intermediario que pasa la información del DNA a proteína. La otra clase es el RNA
funcional porque el RNA no codifica información para producir una proteína. En su
lugar, el mismo RNA es el producto final. Debido a que el RNA es una molécula tan
versátil, puede realizar funciones y participar en una variedad de procesos celulares.
RNA mensajero. Los pasos a través de los que un gen ejerce su influencia sobre el
fenotipo se denominan expresión génica. Para la gran mayoría de genes, los transcritos
de RNA son sólo un intermediario necesario para la síntesis de una proteína, que es el
producto funcional que influye sobre el fenotipo.
RNA funcional. El conocimiento de los detalles íntimos de la expresión génica y su
regulación, han puesto en evidencia la gran variedad de RNA funcionales existentes y
los diversos papeles que desempeñan. De nuevo, es importante enfatizar que los RNA
funcionales son activos como RNA, nunca se traducen a polipéptidos.
Las principales clases de RNA funcionales actúan en varios pasos de la transferencia
de información desde el DNA hasta la proteína, en el procesamiento de otros RNA, y en
8
la regulación de los niveles de RNA y proteínas en la célula. Dos de estas clases se
encuentran tanto en procariotas como en eucariotas y son los RNA de transferencia y los
RNA ribosómicos.

RNA de transferencia (tRNA): son las moléculas responsables de llevar el
aminoácido correcto al mRNA en el proceso de la traducción.

RNA ribosómico (rRNA): estas moléculas son el componente mayoritario de los
ribosomas, las maquinarias macromoleculares que guían el ensamblaje de la cadena
de aminoácidos junto con el mRNA y los tRNA.
La colección completa de tRNAs y rRNAs está codificada por un número pequeño de
genes (desde unas pocas decenas a unas pocas centenas, como mucho). Sin embargo,
aunque los genes que los codifican son pocos en número, un gran porcentaje del RNA
total presente en la célula es rRNA, debido a que se transcriben muchas copias y es
estable.
Existe otra clase funcional de RNA específica de los eucariotas que participa en el
procesamiento del RNA:

RNA nuclear pequeño (snRNA, del inglés, small nuclear RNA): forma parte de un
sistema adicional de procesamiento de los transcritos de RNA en las células
eucarióticas. Algunos snRNA se unen a distintas subunidades proteicas para formar
el complejo ribonucleoproteico de procesamiento (el empalmosoma, del inglés
spliceosome) que remueve los intrones de los mRNA eucarióticos.
Finalmente, una gran fracción del genoma eucariótico se transcribe a un grupo diverso
de RNAs funcionales que participan en distintos niveles de la regulación de la expresión
génica, y pueden agruparse en dos clases:
9
-
MicroRNA (miRNA): recientemente los científicos reconocieron que tiene un
papel generalizado en la regulación de la cantidad de proteína que se produce a
partir de muchos genes eucarióticos.
-
RNA de interferencia pequeño, siRNA (del inglés, small interfering RNA):
ayuda a proteger la integridad de los genomas de plantas y animales. El RNA de
interferencia pequeño inhibe la producción de virus y previene la expansión de
los elementos transponibles a otros loci cromosómicos.
Mensaje: Hay dos clases de RNA, los que codifican para proteínas (mRNA) y los
que son funcionales como RNA. Los RNA funcionales participan en una variedad de
procesos celulares que incluyen la síntesis de proteínas (tRNA, rRNA), el
procesamiento del RNA (snRNA), la regulación de la expresión (miRNA) y la
defensa del genoma (siRNA).
(Fin de página 299)
(Principio de página 300)
8.2 Transcripción
El primer paso en la transferencia de la información desde un gen a la proteína es
producir una cadena de RNA cuya secuencia de bases es complementaria a la
secuencia de bases de un segmento de DNA, algunas veces seguido por una
modificación del RNA que lo prepara para su papel específico en la célula. Por lo
tanto, el RNA se produce por un proceso que copia la secuencia de nucleótidos del
DNA. La síntesis de RNA se denomina transcripción, debido a que este proceso
recuerda a la trascripción (copiado) de palabras escritas. El DNA se dice que se
transcribe en RNA, y el RNA se denomina transcrito.
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Visión general: El DNA como molde de la transcripción
¿Cómo se transfiere la información codificada en la molécula de DNA al transcrito
de RNA? La transcripción depende de la complementariedad en el emparejamiento
de las bases. Considere la transcripción de un segmente cromosómico que constituye
un gen. Primero, las dos cadenas de DNA se separan localmente, y una de las
cadenas se emplea como molde para la síntesis de RNA. En el cromosoma, ambas
cadenas de DNA se emplean como moldes, pero, para un gen determinado, sólo una
cadena es el molde, y para cada gen siempre es la misma cadena la que se transcribe
(Figura 8-3). En el siguiente paso, los ribonucleótidos que se han sintetizado
químicamente en otra parte de la célula, forman pares estables con las bases
complementarias del molde. El ribonucleótido A se empareja con el T en el DNA, el
G con el C, el C con la G, y la U con la A. La enzima RNA polimerasa coloca cada
ribonucleótido frente a su base complementaria. La enzima se une al DNA
(Fin de la página 300)
(Inicio de la página 301)
y se desplaza a lo largo de él, ligando los ribonucleótidos alineados para producir
una molécula de RNA en crecimiento, como se muestra en la Figura 8-4a. Así pues,
se han visto en acción los dos principios de la complementariedad de bases y de la
unión ácido nucleico-proteína (en este caso, la unión de la RNA polimerasa).
El RNA tiene un extremo 5’ y un extremo 3’ que durante la síntesis, siempre crece
en la dirección 5’ a 3’; en otras palabras, los nucleótidos siempre se añaden al
extremo 3’ creciente, como se muestra en la Figura 8-4b. La cadena molde debe estar
orientada en dirección 3’ a 5’, debido a que las cadenas de ácido nucleico se aparean
complementariamente de forma opuesta, y a que el RNA se sintetiza de 5’ a 3’.
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A medida que la molécula de RNA polimerasa se mueve a lo largo del gen, la
doble hélice de DNA se desenrolla por delante de la enzima y se enrolla cuando ya se
ha transcrito. La molécula de RNA se va prolongando progresivamente, y el extremo
5’ se desplaza del molde y la burbuja de transcripción se cierra por detrás de la
polimerasa. Los “trenes” de RNA polimerasa se mueven a lo largo del gen, y cada
uno sintetiza una molécula de RNA. Al microscopio electrónico se observan las
múltiples cadenas de RNA saliendo de una molécula simple de DNA, así como el
alargamiento progresivo de las cadenas de RNA (Figura 8-5).
Como ya se ha mencionado, las bases en el transcrito y el molde son
complementarias. Por consiguiente, la secuencia de nucleótidos en el RNA debe ser
igual a la que lleva la cadena de DNA que no es el molde, excepto que la U
reemplaza a la T, como se observa en la Figura 8-6. Cuando la secuencia de bases del
DNA se cita en la literatura científica, por convención se escribe la secuencia de la
cadena que no es el molde, porque esta secuencia es la misma que se encuentra en el
RNA. Por esta razón, se refiere a la cadena que no es el molde del DNA como la
cadena codificadora. Es extremadamente importante tener en cuenta esta distinción
cuando se discuta la transcripción.
Mensaje: La transcripción es asimétrica: sólo se emplea una cadena de DNA de un
gen como molde para la transcripción. Esta cadena tiene la orientación 3’ a 5’, y el
RNA se sintetiza en la dirección 5’ a 3’.
Etapas de la transcripción
La secuencia que codifica una proteína en un gen, es un segmento relativamente
pequeño de DNA integrado en una molécula de DNA mucho mayor (el cromosoma).
¿Cómo se transcribe el segmento apropiado en una molécula simple de RNA con el
12
tamaño y la secuencia correcta? Debido a que el DNA de un cromosoma es una
unidad continua, la maquinaria transcripcional debe dirigirse al inicio del gen para
comenzar la transcripción en el sitio adecuado, continuar transcribiendo a lo largo del
gen y detenerse en el extremo del mismo. Estas tres etapas de la transcripción se
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(Inicio de la página 302)
denominan iniciación, elongación y terminación. Aunque el proceso completo de
la transcripción es sorprendentemente similar entre procariotas y eucariotas, hay
diferencias que son importantes. Por esta razón, primero se describirán las tres etapas
en los procariotas, empleando como ejemplo a la bacteria intestinal E. coli, y luego
se describirá en los eucariotas.
Iniciación en los procariotas. ¿Cómo encuentra la RNA polimerasa el sitio de
iniciación correcto? En los procariotas, la RNA polimerasa generalmente se une a
una secuencia específica del DNA llamada promotor, localizada en un sitio cercano
al inicio de la región a transcribir. Un promotor es una parte importante de la región
reguladora de un gen. Recuerde que, debido a que la síntesis de un transcrito de RNA
comienza por su extremo 5’ y continúa en la dirección 5’ a 3’, por norma se dibuja y
se refiere a la orientación del gen también en la dirección 5’ a 3’. Generalmente, el
extremo 5’ se dibuja a la izquierda y el extremo 3’ a la derecha. Debido a que el
promotor se encuentra cercano al sitio donde comienza la transcripción, se denomina
a ésta región el extremo 5’ del gen, y a la región precisa del promotor se denomina
región 5’ reguladora (Figura 8-7a).
La primera base que se transcribe siempre se encuentra en la misma posición, y se
denomina sitio de iniciación. Se dice que el promotor se encuentra aguas arriba del
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sitio de iniciación porque se localiza por delante, en el sentido opuesto al de la
transcripción. Mientras que un sitio localizado aguas abajo se encuentra después en
el sentido de la transcripción. Por convención, la primera base que se transcribe se
indica con el número +1. La posición del nucleótido aguas arriba del sitio de
iniciación se indica con el signo negativo (-) y la posición que se encuentra aguas
abajo se indica con un signo (+).
La Figura 8-7b muestra la secuencia promotora de siete genes diferentes del
genoma de E. coli. Debido a que es la misma RNA polimerasa la que se une a las
secuencias promotoras de distintos genes, no sorprende ver que existe una gran
similitud entre ellas. En particular, se observan dos regiones de gran similitud en
cada caso, que se denominan regiones -35 y -10 (menos 35 y menos 10) porque se
localizan en los pares de base 35 y 10 aguas arriba de la primera base que se
transcribe. Estas secuencias se muestran en amarillo en la Figura 8-7b. Como se
puede observar, las regiones -35 y -10 de genes diferentes no tienen que ser idénticas
para realizar funciones similares. Sin embargo, es posible llegar a una secuencia de
nucleótidos, llamada secuencia consenso, que concuerde con la mayoría de las
secuencias. La secuencia consenso de E. coli se muestra en la región inferior de la
Figura 8-7b. Una holoenzima de RNA polimerasa (véase el siguiente párrafo) se une
al DNA en este punto, entonces desenrolla la doble hélice, y comienza la síntesis de
una molécula de RNA. Observe en la Figura 8-7a que la parte del gen que codifica la
proteína generalmente comienza con una
(Fin de página 302)
(Inicio de página 303)
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secuencia ATG, pero el sitio de iniciación, donde comienza la transcripción, está
situado en una región aguas arriba bastante alejada, a la que se refiere como la
región 5’ no traducida, 5’UTR (del inglés, 5’ untranslated region).
La polimerasa bacteriana que rastrea las secuencias promotoras en el DNA se
denomina holoenzima de la RNA polimerasa (Figura 8-8). Este complejo se
compone de 5 subunidades de la enzima central, dos subunidades de α, una de β, una
de β’ y una de ω, además de una subunidad llamada factor sigma (σ). Las dos
subunidades α ayudan a ensamblar la enzima y promueven las interacciones con las
proteínas reguladoras, la subunidad β es catalítica, la subunidad β’ se une al DNA, y
la subunidad ω tiene diversas funciones en el ensamblaje y la regulación de la
expresión génica. La subunidad σ se une a las regiones -10 y -35, y posiciona la
holoenzima para que inicie la transcripción correctamente en el sitio de iniciación
(véase la Figura 8-8a). La subunidad σ también tiene un papel en la separación
(desnaturalización) de las cadenas de DNA alrededor de la región -10 de manera que
el núcleo de la enzima puede unirse firmemente al DNA para la preparación de la
síntesis del RNA. Después que el núcleo de la enzima se ha unido, la transcripción
comienza y la subunidad σ se disocia del resto del complejo (véase la Figura 8-8b).
Como la mayoría de las bacterias, E. coli tiene diversos factores σ; uno de ellos, se
denomina factor σ70 porque su masa es de 70 kilodaltons y es la subunidad primaria
empleada para iniciar la transcripción en la gran mayoría de genes de E. coli;
mientras que otros factores σ reconocen distintas secuencias promotoras. A través de
a asociación con diferentes factores σ, el núcleo de la enzima puede reconocer
diferentes secuencias promotoras y transcribe diferentes grupos de genes.
Elongación A medida que la RNA polimerasa se mueve a lo largo del DNA, lo
desenrolla por delante y lo vuelve a enrollar una vez que se ha trascrito. De esta
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forma, mantiene una región de DNA de cadena simple que se denomina burbuja de
transcripción, donde está expuesta la cadena molde. En la burbuja, la polimerasa
controla la unión de un ribonucleósido trifosfato libre a la siguiente base expuesta en
el molde de DNA y, si hay emparejamiento complementario, lo añade a la cadena. La
energía para la unión de un nucleótido proviene de la ruptura del enlace trifosfato de
alta energía que libera difosfato inorgánico, de acuerdo con la siguiente fórmula
general:
DNA
NTP + (NMP)n
(NMP)n + 1 + PPi
Mg2+
RNA polimerasa
En la Figura 8-9a se observa un esquema de la elongación. Dentro de la burbuja,
los últimos ocho o nueve nucleótidos añadidos a la cadena de RNA forman un
híbrido RNA-DNA por
(Fin de la página 303)
(Principio de la página 304)
complementariedad de bases con la cadena molde. A medida que la cadena de
RNA aumenta de tamaño en su extremo 3’, el extremo 5’ de cadena simple es
impelido fuera de la polimerasa.
Terminación La transcripción de un gen individual continúa más allá del
segmento que codifica la proteína en el gen, creando una región 3’ no traducida (3’
UTR, del inglés, 3’ untranslated region) al final del transcrito. La elongación
continúa hasta que la RNA polimerasa reconoce secuencias especiales de nucleótidos
16
que actúan como una señal para la terminación de la cadena. El encuentro con la
señal nucleotídica inicia la liberación del RNA naciente y de la enzima molde
(Figura 8-9b). Existen dos mecanismos principales de terminación en E. coli (y otras
bacterias) que se denominan intrínseco y dependiente de rho.
En el mecanismo intrínseco, la terminación es directa. La secuencia terminadora
contiene cerca de 40 pares de bases que terminan en una región rica en G-C, a la que
le sigue una serie de seis o más As. Debido a que G y C en el molde se aparearán en
el transcrito con C y G, respectivamente, el RNA de esta región también es rico en
CG. Los puentes de hidrógeno complementarios que forman estas bases entre sí,
lleva a la formación de un bucle en horquilla (Figura 8-10). Recuerde que los pares
de bases C y G son más estables que los pares de A y T porque tienen tres puentes de
hidrógeno, mientras que los pares A-T o A-U solo tienen dos. Los bucles horquilla
que están formados por largas secuencias de C-G son más estables que los que están
formados por pares A-T. Al bucle le sigue una serie de alrededor de 8 Us que
corresponden a los residuos de A en el molde de DNA.
Generalmente, en el curso de la elongación de la transcripción, la RNA polimerasa
hará una pausa si el pequeño híbrido DNA-RNA en la burbuja es débil y volverá
atrás para estabilizar el híbrido. Como en los bucles horquilla, la fuerza del híbrido la
determina el número relativo de pares de bases G-C comparado con los pares de
bases A-U, o pares de bases A-T en los híbridos RNA-DNA. En el mecanismo
intrínseco, se supone que la polimerasa hace una pausa después de sintetizar la serie
de residuos de Us, que forman un híbrido débil de DNA-RNA, pero, al volver hacia
atrás se encuentra con el bucle. Este bloqueo provoca la liberación del RNA de la
polimerasa y la liberación de la polimerasa del molde de DNA.
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El segundo tipo de mecanismo de terminación requiere la ayuda de una proteína
llamada el factor rho, que reconoce las señales de terminación para la RNA
polimerasa. Los RNA con señales de terminación dependientes de rho no tienen la
serie de residuos de U en su extremo 3’, ni generalmente el bucle en horquilla. En
cambio, tienen una secuencia de alrededor de 40 a 60 nucleótidos que es rica en
residuos C y pobre en residuos G e incluyen un segmento aguas arriba denominado
sitio rut (del inglés, rho utilization). Rho es un hexámero de seis subunidades
idénticas que se une a la cadena de RNA naciente en el sitio rut. Estos sitios se
localizan justo aguas arriba de la secuencia donde la RNA polimerasa suele hacer
una pausa (recuerde que aguas arriba significa 5’ de). Después de la unión, rho
facilara la liberación de la RNA polimerasa del RNA. Así pues, la terminación
dependiente de rho conlleva a la unión de rho a rut, la pausa de la polimerasa y la
disociación mediada por rho del RNA de la RNA polimerasa.
8.3 Transcripción en eucariotas
Como se ha descrito en el Capítulo 7, la replicación del DNA en eucariotas es
similar a la replicación del DNA en procariotas, aunque es más complicada. En
cierto modo, se puede decir lo mismo de la transcripción, porque los eucariotas
retienen muchos de los sucesos asociados con la iniciación, la elongación y la
terminación de los procariotas. La replicación del DNA es más compleja en los
eucariotas en gran parte debido a que hay mucho más DNA que copiar. La
transcripción es más complicada en los eucariotas por tres razones fundamentales.
1. Los genomas eucarióticos son mayores y tienen muchos más genes que
reconocer y transcribir. Mientras que las bacterias tienen unos pocos miles de
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genes, los eucariotas tienen decenas de miles de genes. Más aún, hay mucho más
DNA no codificador en los eucariotas que se origina por una variedad de
mecanismos que se
(Fin de página 304)
(Principio de página 305)
discutirán en el Capítulo 14. Por lo tanto, a pesar de que los eucariotas tienen más
genes que los procariotas, sus genes están, en promedio, bastante más separados.
Por ejemplo, mientras que la densidad de genes (el promedio del número de genes
dividido por la longitud del genoma) en E. coli es de 1 gen por cada 1400 pb. El
número baja a 1 gen cada 9000 pb en la mosca de la fruta Drosophila, y es sólo de 1
gen por 100.000 pb en humanos. Esta baja densidad hace que la transcripción sea un
proceso mucho más complicado, específicamente en el paso de la iniciación. En los
genomas de los eucariotas multicelulares, encontrar el inicio del gen puede ser como
encontrar una aguja en un pajar.
Los eucariotas se enfrentan esta situación de diferentes maneras. Primero, han
dividido el trabajo de la transcripción entre tres polimerasas diferentes.
a. La RNA polimerasa I transcribe los genes de rRNA (excluyendo al gen 5S
rRNA).
b. La RNA polimerasa II transcribe todos los genes que codifican para proteínas,
para los que el transcrito es el mRNA, además transcribe algunos snRNA.
c. La RNA polimerasa III transcribe los genes funcionales de RNA pequeños
(incluyendo los genes para tRNA, algunos snRNA y los 5S rRNA).
En esta sección se centrará la atención en la RNA polimerasa II.
19
Segundo, antes que la RNA polimerasa II pueda comenzar a sintetizar el RNA,
los eucariotas requieren el ensamblaje de muchas proteínas al promotor, entre las
que se encuentran los factores generales de la transcripción (GTFs, del inglés,
general transcription factors), que se unen antes que lo haga la RNA polimerasa II,
mientras que otros se unen después. El papel de los GTF y sus interacciones con la
RNA polimerasa II se describirá en la próxima sección sobre la iniciación de la
transcripción en los eucariotas.
2. Una diferencia significativa entre eucariotas y procariotas es la presencia de un
núcleo en los eucariotas. En procariotas, la información en el RNA se traduce casi
inmediatamente a la cadena de aminoácidos (polipéptido), como se verá en el
Capítulo 9. En cambio, en eucariotas, la transcripción y la traducción están
separadas espacialmente; la transcripción tiene lugar en el núcleo y la traducción en
el citoplasma (Figura 8-11). En eucariotas, el RNA se sintetiza en el núcleo dónde
se localiza el DNA y se exporta fuera del núcleo al citoplasma para la traducción.
Antes que el RNA deje el núcleo, debe modificarse de varias formas a las que se
refieren como procesamiento del RNA. Para distinguir entre el estado anterior y
posterior al procesamiento, el RNA recién sintetizado se denomina transcrito
primario o pre-mRNA, y el término mRNA se reserva para el trascrito
completamente procesado que se exporta fuera del núcleo. Como se puede ver, la
mitad correspondiente al extremo 5’ se procesa mientra que la mitad 3’ aún se está
sintetizando. Así pues,
(Fin de página 305)
(Principio de página 306)
20
la RNA polimerasa II debe sintetizar RNA mientras que coordina simultáneamente
un conjunto diverso de sucesos de procesamiento. Por esta razón, entre otras, la
RNA polimerasa II es una enzima formada por múltiples subunidades, más
complicada que la RNA polimerasa de los procariotas. De hecho, se la considera
como otra maquinaria molecular. La coordinación del procesamiento y la síntesis
por la RNA polimerasa se discutirá en la sección de la elongación de la
transcripción en los eucariotas.
3. Finalmente, el DNA genómico que sirve de molde para la transcripción se
organiza en la cromatina en eucariotas (véase Capítulo 2), mientras que en
procariotas está prácticamente “desnudo”. Como se verá en el Capítulo 11,
ciertas estructuras de la cromatina pueden bloquear el acceso de la RNA
polimerasa al molde de DNA. Esta característica de la cromatina en los
eucariotas ha evolucionado en un mecanismo muy sofisticado de regulación de
la expresión génica. Sin embargo, ahora se dejará de lado la discusión acerca de
la influencia de la cromatina sobre la habilidad de la RNA polimerasa II para
iniciar la transcripción, y se centrará la atención en los eventos que tienen lugar
después que la RNA polimerasa accede al molde de DNA.
Iniciación de la transcripción en los eucariotas.
En procariotas, la transcripción comienza cuando la subunidad σ de la holoenzima
RNA polimerasa reconoce las regiones -10 y -35 en el promotor de un gen. Después
que se inicia la transcripción, la subunidad σ se disocia y el componente central de
la polimerasa continúa con la síntesis de RNA dentro de la burbuja de transcripción
que se mueve a lo largo del DNA. De igual forma, en eucariotas, el componente
21
central de la RNA polimerasa II no puede reconocer las secuencias promotoras por
si mismo. A diferencia de las bacterias, donde el factor σ es un componente integral
de la holoenzima polimerasa, los eucariotas requieren GTFs para unirse a regiones
en el promotor antes que se una al núcleo de la enzima.
La iniciación de la transcripción en los eucariotas tiene algunas características
que se asemejan a la iniciación de la replicación en los orígenes de la replicación.
Recuerde del Capítulo 7 que las proteínas que no son parte del replisoma inician el
ensamblaje de la maquinaria de la replicación. Por ejemplo, la DnaA en E. coli y el
complejo de reconocimiento del origen (ORC) en levaduras, reconocen y se unen
primero a las secuencias de origen del DNA. Estas proteínas sirven para atraer a las
proteínas de replicación, incluyendo a la DNA polimerasa III, a través de
interacciones entre proteínas. De manera similar, los GTF, aunque no están
directamente implicados en la síntesis del RNA, reconocen secuencias del promotor
u otras secuencias y se unen a ellas, para atraer el núcleo de la RNA polimerasa II y
colocarlo en el sitio correcto para empezar la transcripción. Los GTFs se designan
TFIIA, TFIIB y así sucesivamente (Factores de Transcripción de la RNA polimerasa
II; del inglés transcription factor of RNA polymerase II).
Los GTFs y el núcleo de la RNA polimerasa II constituyen el complejo de
preiniciación (PIC, del inglés preinitiation complex). Este complejo es bastante
grande: contiene seis GTFs, cada uno de los cuales es a su vez un complejo
multiproteico; más el núcleo de la RNA polimerasa II, que está compuesto de una
docena o más de subunidades. La secuencia de aminoácidos de algunas subunidades
del núcleo de la RNA polimerasa II están conservadas desde las levaduras hasta los
humanos. Esta conservación se puede demostrar espectacularmente reemplazando
alguna subunidad de la polimerasa de las levaduras con su homóloga humana para
22
formar un complejo funcional de RNA polimerasa II quimérico (denominado así por
una criatura de la mitología griega que escupía fuego, con cabeza de león, cuerpo de
cabra y cola de serpiente).
Los promotores eucarióticos, así como los procarióticos, se localizan en el lado 5’
(aguas arriba) del sitio de inicio de la transcripción. En un alineamiento de regiones
promotoras eucarióticas, la secuencia TATA se observa a menudo localizada
alrededor de la base 30 aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción (-30 pb)
(Figura 8-12). Esta secuencia, llamada caja TATA, es el sitio del primer suceso en
la transcripción: la unión de la proteína de unión al TATA (TBT) (del inglés,
TATA- binding protein). El TBT forma parte del complejo TFIID, uno de los seis
GTF. Una vez unido a la caja TATA, el TBT atrae al promotor a otras GTF y al
núcleo de la RNA polimerasa II, formando el complejo de preiniciación. Después de
haberse iniciado la transcripción, la RNA polimerasa II se disocia de la mayoría de
los GTF para elongar el transcrito primario. Algunas de los GTF permanecen en el
promotor
(Fin de página 306)
(Principio de la página 307)
para atraer al siguiente núcleo de la RNA polimerasa. De esta forma, múltiples
enzimas RNA polimerasa II pueden sintetizar simultáneamente varios transcritos de
un mismo gen.
¿Cómo es capaz el núcleo de la RNA polimerasa II de separarse de las GTF y de
iniciar la transcripción? Aunque aún se están estudiando los detalles de este proceso,
se sabe que la subunidad β de la RNA polimerasa II contiene una cola proteica,
llamada dominio de la cola carboxilo (CTD, del inglés, carboxil tail domain), que
23
juega un papel clave. El CTD está localizado estratégicamente cerca del sitio desde
donde emerge el RNA recién sintetizado de la polimerasa. La fase de iniciación
termina y comienza la fase de elongación después que uno de los GTF forforile al
CTD. Se cree que esta fosforilación debilita de alguna manera la conexión de la
RNA polimerasa II a las otras proteínas del complejo de preiniciación y permite la
elongación. El CTD también participa en otras fases críticas de la síntesis y
procesamiento del RNA.
Mensaje Los factores generales de la transcripción (GTF) primero reconocen a los
promotores eucarióticos. Su función es la de atraer al núcleo de la RNA polimerasa
II para posicionarla y comenzar así la síntesis del RNA en el sitio de iniciación de la
transcripción.
Elongación, terminación y procesamiento del pre-mRNA en los eucariotas.
La elongación ocurre dentro de la burbuja de transcripción de manera esencialmente
similar a la descrita para la síntesis de RNA en los procariotas. Sin embargo, el
RNA naciente en eucariotas tiene destinos muy distintos a los de procariotas. En
procariotas, la traducción comienza en el extremo 5’ del RNA naciente mientras que
la mitad 3’ todavía se está sintetizando. En contraste, el RNA de los eucariotas debe
sufrir un procesamiento antes de traducirse que incluye: 1) la adición de una
caperuza en el extremo 5’, 2) el corte y empalme para eliminar los intrones, y 3) la
adición de una cola de nucleótidos de adenina en el extremo 3’ (poliadenilación).
Como en la replicación del DNA, la síntesis y el procesamiento del pre-mRNA a
mRNA requiere que se realicen muchos pasos de forma rápida y exacta. Primero, se
piensa que la mayor parte del procesamiento del pre-mRNA eucariótico tiene lugar
24
después que concluye la síntesis del RNA. El procesamiento después de la síntesis
del RNA se denomina postranscripcional. Sin embargo, la evidencia experimental
actual indica que el procesamiento tiene lugar durante la síntesis, y que es
cotranscripcional. Por lo tanto, el RNA naciente parcialmente sintetizado está
sufriendo reacciones de procesamiento a medida que emerge del complejo de la
RNA polimerasa II.
El CTD de la RNA polimerasa II eucariótica juega un papel central coordinando
todos los sucesos del procesamiento. Está compuesto por muchas repeticiones de
una secuencia de siete aminoácidos, que sirven de sitio de unión para algunas
enzimas y otras proteínas requeridas en el procesamiento del RNA. El CTD se sitúa
cercano al sitio donde emerge el RNA de la polimerasa, ya que es el sitio ideal para
orquestar la unión y liberación de las proteínas necesarias para procesar el transcrito
de RNA naciente mientras continúa la síntesis. En varias etapas del procesamiento,
los aminoácidos del CTD se modifican en forma reversible, a través de la adición y
eliminación de grupos fosfato (llamado fosforilación
y desfosforilación,
respectivamente). El estado de fosforilación del CTD determina qué tipo de proteína
puede unirse. Así pues, el CTD determina la tarea que se realizará sobre el RNA a
medida que emerge de la polimerasa. Los
(Fin de página 307)
(Principio de página 308)
sucesos del procesamiento y el papel del CTD en su ejecución se muestran en la
Figura 8-13.
25
Procesamiento de los extremos 5’ y 3’. En la Figura 8-13a se representa el
procesamiento del extremo 5’ del transcrito de una proteína codificada en un gen.
Cuando emerge el RNA de la polimerasa, diversas proteínas que interactúan con el
CTD añaden al extremo 5’ una estructura especial llamada caperuza, que consiste
de un residuo de 7-metilguanosina ligado al transcrito por tres grupos fosfato. La
caperuza tiene dos funciones: la de proteger el RNA de la degradación (un paso
importante, considerando que el mRNA eucariótico tiene un largo viaje antes de ser
traducido); y la de participar en la traducción del mRNA, como se verá en el
Capítulo 9.
La elongación del RNA continúa hasta la secuencia conservada AAUAAA o
AUUAAA cercana al extremo 3’, que es reconocida por una enzima que corta el
extremo del RNA aproximadamente 20 bases más abajo. Al extremo cortado se le
añade una serie de 150 a 200 nucleótidos de adenina a los que se denominan cola de
poli(A) (véase Figura 8-13c). A la secuencia AAUAAA del mRNA de genes que
codifican proteínas se denomina señal de poliadenilación.
Corte y empalme del RNA para remover los intrones. En 1977, apareció un
estudio científico titulado “Una reordenación asombrosa de secuencia en el extremo
5’ del RNA mensajero 2 del adenovirus”. Los científicos en general tienden a ser
cautos, al menos en sus publicaciones, y el empleo de la palabra “asombroso” indicó
que habían descubierto algo verdaderamente inesperado. Los laboratorios de
Richard Roberts y Philip Sharp descubrieron independientemente que la
información codificada en los genes eucarióticos (en su caso, el gen de un virus que
infecta células eucarióticas) puede estar fragmentada en dos tipos de piezas, los
exones y los intrones. Las piezas que codifican partes de las proteínas son los
26
exones, y las piezas que separan los exones son los intrones. Los intrones están
presentes tanto en los genes que codifican proteínas como también en algunos genes
de rRNA y de tRNA. Los intrones se eliminan del transcrito primario mientras el
RNA se está transcribiendo y después de añadirse la caperuza pero antes que el
transcrito sea transportado al citoplasma. La extracción de los intrones y la unión de
los exones, se denomina corte y empalme del RNA (en inglés, splicing), porque
este mecanismo se asemeja a la forma en la que se cortan y unen las escenas de una
película o una cinta de vídeo. El corte y empalme de RNA une las regiones
codificadoras o exones, de manera que ahora el mRNA contiene una secuencia
codificadora equivalente a la proteína que codifica.
El número y el tamaño de los intrones varían de gen a gen y de especie a
especie. Por ejemplo, sólo alrededor de 200 de los 6300 genes de las levaduras
tienen intrones, mientras que los genes típicos de mamíferos, incluyendo al humano,
tienen varios intrones. El tamaño promedio de un intrón de mamífero es de
alrededor de 2000 nucleótidos y el exón promedio tiene cerca de 200 nucleótidos;
por lo tanto, un gran porcentaje del DNA de los mamíferos codifica intrones, no
exones. Un ejemplo extremo es el gen humano de la distrofia muscular de
Duchenne, que tiene 79 exones y 78 intrones extendidos a lo largo de 2 millones y
medio de pares de bases. Cuando se cortan y empalman los 79 exones se produce un
mRNA de 14.000 nucleótidos, lo que implica que la mayor parte de los 2,5 millones
de pares de bases son intrones.
Corte y empalme alternativo de RNA. En este punto uno se podría preguntar cuál
es la utilidad de tener genes organizados en exones e intrones. Recuerde que este
capítulo comenzó con
(Fin de página 308)
27
(Principio de página 309)
una discusión del número de genes en el genoma humano. Este número ( 25 000
genes) es sólo dos veces mayor al número de genes del gusano C. elegans, sin
embargo, el espectro de proteínas humanas (llamado proteoma, véase el Capítulo 9)
es superior a 100 000. La razón por la que el número de proteínas supera al número
de genes indica que un gen puede codificar la información para más de una proteína.
Una forma en la que un gen puede codificar para múltiples proteínas es a través de
un proceso llamado corte y empalme alternativo de RNA, que puede producir
diferentes mRNA y posteriormente, diferentes proteínas, a partir del mismo
transcrito primario, cortando y empalmando diferentes combinaciones de exones.
Por razones que actualmente se desconocen, la proporción de genes empalmados
alternativamente varía de especie a especie. Más del 70% de los genes humanos son
producto del corte y empalme alternativo, mientras que en las plantas es un
fenómeno poco frecuente. Muchas mutaciones con serias consecuencias para el
organismo se deben a defectos en el corte y empalme.
Las consecuencias del corte y empalme alternativo sobre la estructura y función
de las proteínas se presentarán más adelante en este libro. Por ahora, es suficiente
decir que las proteínas producidas por corte y empalme alternativo están
generalmente relacionadas, porque contienen una parte de los mismos exones del
transcrito primario, que son empleados a menudo en diferentes tipos celulares o en
distintos estadios del desarrollo. La Figura 8-14 muestra la infinidad de
combinaciones producidas por corte y empalme alternativo del transcrito primario
del gen de la –tropomiosina. El mecanismo del empalme se considerará en la
siguiente sección.
28
Mensaje: El pre-mRNA eucariótico se procesa completamente antes de ser
transportado como mRNA al citoplasma para su traducción a proteína; se le añade la
caperuza 5’, la cola de poliA en el extremo 3’, se eliminan los intrones y se
empalman los exones. Un gen puede codificar más de un polipéptido cuando los
exones de su pre-mRNA se empalman alternativamente.
8.4 RNA funcional
Debido a que el RNA es una molécula versátil, participa en una variedad de
procesos celulares. En el Capítulo 9, se verá más acerca del papel de los RNA
funcionales como componentes importantes del ribosoma, la maquinaria biológica
de donde tiene lugar
(Fin de página 309)
(Inicio de página 310)
la síntesis de proteínas. En esta sección, se verá que el RNA funcional también tiene
papeles importantes tanto en el procesamiento del mRNA como en la regulación de
sus niveles en la célula.
RNA nuclear pequeño (snRNA): el mecanismo del corte y empalme de los
exones
Después de descubrir los exones y los intrones, los científicos centraron su atención
en el mecanismo del corte y empalme del RNA. Debido a que los intrones deben
eliminarse y los exones deben ser empalmados de maneras precisas, el primer
29
acercamiento fue comparar las secuencias de los pre-mRNA para buscar pistas de
cómo se reconocen los intrones y los exones. La Figura 8-15 muestra las uniones
entre exones e intrones del pre-mRNA, que son sitios en los que tienen lugar las
reacciones de corte y empalme. En estas uniones, se encuentran ciertos nucleótidos
específicos casi idénticos a través de los genes y las especies; están muy
conservados porque participan en las reacciones de corte y empalme. Cada intrón se
corta en sus extremos y éstos son casi siempre GU en el extremo 5’ y AG en el 3’
(la regla GU-AG). Otro sitio que no varía es una A entre los nucleótidos 15 y 45
aguas arriba del sitio de empalme 3’. Los nucleótidos que flanquean estas señales
también se encuentran conservados aunque en menor grado. La existencia de
secuencias nucleotídicas conservadas en los sitios de corte y empalme sugieren que
debe haber una maquinaria que los reconozca y que lleve a cabo el proceso. Como
ocurre a menudo en la investigación científica, el descubrimiento de la maquinaria
de corte y empalme se reveló por accidente y el mecanismo del empalme resultó ser
completamente inesperado.
Un hallazgo casual realizado en el laboratorio de Joan Steitz llevó al
descubrimiento de los componentes de la maquinaria del corte y empalme. Los
pacientes con una variedad de enfermedades autoinmunes, que incluye al lupus
eritrematoso sistémico, producen anticuerpos en contra de sus propias proteínas.
Mientras analizaban muestras de sangre de pacientes con lupus, Joan Steitz y sus
colaboradores identificaron anticuerpos que podían unirse a un gran complejo
molecular de pequeños RNA y proteínas. Debido a que estas riboproteínas están
localizadas en el núcleo, los componentes de RNA se denominaron RNA nuclear
pequeño (snRNA, del inglés, small nuclear RNA). Los snRNAs fueron descubiertos
por que tienen complementariedad de bases con las secuencias consenso de las
30
uniones de empalme, lo que llevó a los científicos a formular una hipótesis del papel
que desempeñan los snRNA en la reacción de corte y empalme. Se sabe ahora que
los nucleótidos conservados en el transcrito son reconocidos por cinco
ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP, del inglés, small nuclear
ribonucleoproteins), que son complejos de proteína y uno de los cinco snRNA (U1,
U2, U4, U5 y U6). Los snRNA y más de cien proteínas adicionales forman parte del
empalmosoma, la gran máquina biológica que elimina los intrones y empalma los
exones. Los componentes del empalmosoma interactúan con el CTD, como se
sugiere en la Figura 8-13b.
Los componentes del empalmosoma se asocian a las secuencias de los intrones y
los exones, como se muestra en la Figura 8-16. Las ribonucleoproteínas nucleares
pequeñas ayudan a alinear el sitio de empalme a uno de los extremos de un intrón
formando puentes de hidrógeno con la secuencia conservada del intrón y el exón.
Entonces, la ribonucleoproteína recluta otros complejos y forma el empalmosoma,
que cataliza la extracción de los intrones a través de dos pasos consecutivos de corte
y empalme (véase la Figura 8-16). El primer paso pega un extremo del intrón a la
adenina interna conservada, para formar una estructura que tiene la forma de un lazo
de vaquero. El segundo paso libera el lazo y empalma los dos exones adyacentes. La
Figura 8-17 representa las
(Fin de página 310)
(Principio de página 312, en la 311 sólo esta la figura 8-17)
reacciones químicas que se dan en la extracción de los intrones y el empalme de los
exones. Químicamente, los dos pasos son reacciones de transesterificación entre
nucleótidos conservados. Los grupos hidroxilo de las posiciones 2’ y 3’ de los
ribonucleótidos son elementos claves en la reacción.
31
Autoempalme de los intrones y el mundo del RNA
Dos casos excepcionales de procesamiento del RNA condujeron a un
descubrimiento que algunos investigadores consideran casi tan importante como el
descubrimiento de la estructura de la doble hélice del DNA. En 1981, Tom Cech y
sus colaboradores informaron que, en un tubo de ensayo, el transcrito primario de un
rRNA del protozoo ciliado Tetrahymena puede extraer un intrón de 413 nucleótidos
por si mismo, sin la adición de ninguna proteína (Figura 8-18). Posteriormente, se
observó que otro intrón tenía esta propiedad que se conoce como autoempalme de
intrones. Unos pocos años antes, mientras estudiaba el procesamiento del tRNA en
las bacterias, Sydney Altman identificó una ribonucleoproteína (llamada RNAsa P)
responsable de cortar la molécula pre-tRNA en un sitio específico. La enorme
sorpresa llegó cuando determinaron que la actividad catalítica de la RNAsa P residía
en el componente de RNA de la enzima más que del componente proteico. Los
descubrimientos de Cech y Altman se consideran un hito en Biología porque se
demostró por primera vez que otras moléculas biológicas diferentes de las proteínas
pueden catalizar reacciones.
El descubrimiento del autoempalme de los intrones llevó a reexaminar el papel
de los snRNA en el empalmosoma. Los estudios más recientes indican que la
eliminación de los intrones está catalizada por el snRNA y no por el componente
proteico del empalmosoma. Como se verá en el Capítulo 9, se piensa que es el RNA
en el ribosoma, y no las proteínas ribosomales, las que juegan un papel primordial
en la mayoría de los sucesos importantes de la síntesis de proteínas. Los numerosos
ejemplos de ribozimas aportaron una sólida evidencia para la teoría llamada el
mundo del RNA, que sostiene que el RNA habría de haber sido el material genético
32
en las primeras células porque sólo el RNA es capaz de codificar información
genética y catalizar reacciones biológicas.
Mensaje La extracción de los intrones y el empalme de los exones están catalizados
por moléculas de RNA. En los eucariotas, los snRNA del empalmosoma catalizan la
remoción de los intrones del pre-mRNA. Algunos intrones son autoempalmados; en
estos casos el intrón por sí mismo cataliza su propia extracción. Los RNA capaces
de catalizar reacciones biológicas se denominan ribozimas.
¿Qué hacen los genetistas hoy en día?
RNA de interferencia pequeño (siRNA)
En 2002, una de las revistas científicas más prestigiosas, Science, denominó al
“RNA pequeño” como el descubrimiento del año (Figura 8-19). Los RNA a los que
se refería no eran los pequeños RNA descritos previamente como los snRNA o los
tRNA. Por el contrario, estos RNA fueron detectados por primera vez en los años 90
como parte de dos áreas de experimentación muy distintas, una en mamíferos y la
otra en plantas.
En 1998, Andrew Fire y Craig Mello anunciaron que habían descubierto una
forma potente de silenciar genes en el nematodo C. elegans. Fire y Mello
descubrieron que, tras la inyección de copias de RNA de doble cadena (dsRNA, del
inglés, double-stranded RNA) de un gen de C. elegans en embriones de la misma
especie, eran capaces de bloquear la síntesis del producto proteico de ese gen. El
silenciamiento selectivo del gen a través de este procedimiento se denomina
silenciamiento génico (el silenciamiento génico puede ocurrir también de manera
natural, véase el Capítulo 11). El dsRNA sintetizado en el laboratorio estaba
33
compuesto por una cadena codificadora (con sentido) y una cadena complementaria
antisentido. En su experimento inicial, Fire y Mello inyectaron copias de dsRNA
del gen unc-22 dentro de embriones de C. elegans y observaron que cuando crecían
hasta adultos tenían espasmos y defectos musculares. Este resultado fue excitante
porque se sabía que unc-22 codificaba para una proteína muscular y los mutantes
nulos de unc-22 exhibían los mismos defectos musculares y espasmódicos. Estas
observaciones
(Fin de página 312)
(Principio de página 313)
indicaban que el dsRNA previno la producción de la proteína Unc-22. La pregunta
que queda por responder es ¿cómo?
Poco después, David Baulcombe estaba investigando por qué las plantas de
tabaco, manipuladas genéticamente para expresar un gen viral, eran resistentes a la
infección por el virus. Se sabe que el virus no puede replicar su genoma de RNA en
las plantas
manipuladas
genéticamente.
Baulcombe
y sus
colaboradores
descubrieron que las plantas resistentes, y sólo las plantas resistentes, producían
grandes cantidades de un RNA corto, de 25 nucleótidos, que era complementario al
genoma viral. Los RNA cortos se produjeron también durante el silenciamiento en
C. elegans.
La producción de RNA cortos también está asociada a dos fenómenos
relacionados en las plantas, el silenciamiento transgénico y la cosupresión.
Transgén es la manera corta de decir “gen transformado”; y se trata de un gen que se
ha introducido en el cromosoma de un organismo en el laboratorio. Algunas veces,
el transgén se incorpora en el cromosoma pero no se obtiene el producto proteico.
34
En este caso, se dice que ha ocurrido un silenciamiento transgénico. Si el transgén es
una copia de un gen que se halla normalmente en el organismo (llamado gen
endógeno), entonces ambas copias fallan en la producción de la proteína. Este
resultado se llama cosupresión. Por ejemplo, los patrones florales inusuales que se
muestran en la Figura 8-20 son el resultado de la cosupresión. Estos bellos patrones
fueron observados primero cuando el científico botánico Richard Jorgenson insertó
un gen de petunia que codifica para la síntesis del pigmento floral azul púrpura en
una planta de coloración normal (con flores azules púrpura). Expuesto de otra
manera, en este experimento, se insertó un transgén en los cromosomas de una
petunia que ya tenía una copia buena de este mismo gen en su locus habitual en el
genoma de petunia. De un modo totalmente inesperado, el transgén de petunia
provocó la supresión de ambos genes, el transgén y el normal. Significativamente,
también se descubrió el RNA corto presente durante el silenciamiento del transgén y
la cosupresión.
En resumen, los RNA cortos se han observado en el silenciamiento génico por
dsRNA en C. elegans, la resistencia a virus en las plantas manipuladas
genéticamente del tabaco, y en el silenciamiento por transgenia y cosupresión en
varias especies de plantas. La producción de RNA cortos en todos estos fenómenos
sugiere una conexión entre estos fenómenos diversos en los reinos vegetal y animal.
(Fin de página 313)
(principio de página 314)
La identificación de la maquinaria celular que lleva al silenciamiento de un gen y un
transgén y a la resistencia viral ha sido una de las áreas más candentes de la
investigación genética en la década pasada. Ahora se entiende mejor cómo los
35
dsRNA y los RNA cortos encajan en la figura. Los RNA cortos (de 21-25
nucleótidos) se denominan ahora de manera colectiva como RNA de interferencia
corto (siRNA, del inglés, small interferering RNA), y el fenómeno que resulta en el
silenciamiento del gen y el transgén y en la resistencia viral a través de la
producción de siRNA se denomina interferencia de RNA (RNAi, del inglés RNA
interference). La Figura 8-21 resume el conocimiento actual de la ruta del RNAi.
Brevemente, dos maquinas biológicas, con la capacidad de cortar el RNA, toman
parte en un proceso de dos pasos. Una maquinaria, llamada DICER, reconoce a las
moléculas largas de dsRNA y las corta en siRNA de doble cadena. Una segunda
maquinaria, llamada RISC (complejo de silenciamiento inducido por RNA, del
inglés, RNA-induced silencing complex), se une a estos siRNA y los desenrolla en
siRNA de cadena simple de manera que la cadena antisentido, todavía unida al
RISC, puede hibridar con el mRNA celular que sea complementario. De esta forma,
RISC es enviado para destruir mRNA celular específico, cortándolo en piezas
pequeñas.
Se ha visto que los dsRNA provocan un mecanismo que termina en la
destrucción del mRNA complementario en la célula. En el experimento en que se
silenciaron los genes de gusanos, los dsRNA se inyectaron en los embriones del
laboratorio. ¿Cuál fue la fuente de los dsRNA en las plantas transgénicas resistentes
a los virus o en las que sufrieron silenciamiento del transgén o cosupresión? En
todos estos casos, las plantas transgénicas contienen genes que fueron introducidos
en el laboratorio. Debido a que los científicos no pueden controlar dónde y cómo se
inserta el transgén, algunos terminarán insertándose en orientación opuesta al
finalizar el gen de la planta. La Figura 8-22 ilustra cómo resulta la cosupresión
cuando esto ocurre. Cuando se inicia la transcripción en el promotor del gen puede
36
“leer hasta” el transgén y producir un RNA “quimérico” muy largo que contiene a la
cadena con sentido del gen y la cadena antisentido del transgén. Entonces, cuando la
parte antisentido del RNA largo hibride con el RNA con sentido del transgén se
formará el dsRNA. Dicer reconocerá el dsRNA y lo cortará en siRNA, que se unirá
a RISC y dirigirá este complejo al mRNA complementario en la célula. En los casos
descritos con anterioridad, el RNA complementario podría venir de un virus que
infecte a la célula (en las plantas resistentes), del mismo transgén (en el
sileciamiento del transgén) o de un gen endógeno (en la cosupresión).
El hecho que la ruta del RNAi esté conservada tanto en plantas como en
animales indica que es un mecanismo antiguo que evolucionó en su ancestro común
hace alrededor unos mil millones de años. Cuando un proceso biológico se
encuentra muy conservado, se considera que hace algo muy importante. ¿Cuál es el
papel vital que desempeña la ruta metabólica del RNAi en la naturaleza? Como
muchas otras preguntas intrigantes en genética, su respuesta se está estudiando en
muchos, quizás cientos, de laboratorios de todo el mundo. La ruta del RNAi
probablemente juegue un papel importante en la defensa viral. Sin embargo, su
papel más importante puede ser el de proteger el material hereditario de un
organismo de los elementos genéticos de su propio genoma. En el Capítulo 14, se
estudiarán los elementos transponibles que constituyen una fracción enorme del
genoma de los eucariotas multicelulares, incluyendo los humanos. Estos elementos
pueden amplificarse a sí mismos y moverse a nuevas localizaciones, creando una
amenaza obvia a la integridad del genoma. Así como los científicos introducen un
transgén, el movimiento de los elementos transponibles a una nueva localización
cromosómica puede disparar la ruta del RNAi generando dsRNA. La ruta
37
metabólica del RNAi inactivaría los elementos transponibles y frenaría su posible
amplificación.
Resumen:
Se sabe que la información no se transfiere directamente del DNA a las proteínas,
porque, en las células eucariotas, el DNA está en el núcleo, mientras que las
proteínas se sintetizan en el citoplasma. La transferencia de la información requiere
un intermediario que es el RNA.
Aunque el DNA y el RNA son ácidos nucleicos, el RNA difiere del DNA en que
1) es de cadena simple y no una doble hélice; 2) sus nucleótidos contienen el azúcar
ribosa en vez de desoxirribosa, 3) tiene la base pirimidínica uracilo en vez de la
timina, y 4) puede servir como catalizador biológico.
La similitud del DNA y el RNA sugiere que el flujo de la información del DNA
al RNA se apoya en la complementariedad de bases, lo cuál es clave para la
replicación del DNA. Una cadena molde de DNA se copia, o se transcribe, en un
RNA funcional (como el RNA de transferencia y el RNA ribosómico) que nunca se
traduce a polipéptidos, o en un RNA mensajero a partir del cual se sintetizan las
proteínas.
En los procariotas, todas las clases de RNA se transcriben por una única RNA
polimerasa. Esta enzima compuesta por múltiples subunidades inicia la transcripción
uniéndose al DNA en los promotores que contienen secuencias específicas
localizadas a -35 y -10 bases antes del sitio de iniciación de la transcripción en la
base +1. Después de unirse, la RNA polimerasa desenrolla al DNA localmente y
comienza a incorporar ribonucleótidos complementarios al molde de DNA. La
cadena crece en la dirección 5’ a 3’ hasta que uno de los dos mecanismos, intrínseco
38
o dependiente de rho, lleva a la disociación de la polimerasa y del RNA del molde
de DNA. Como se verá en el Capítulo 9, en la ausencia del núcleo, el RNA
procariótico que codifica proteínas se traduce mientras se está transcribiendo.
En los eucariotas, hay tres tipos diferentes de RNA polimerasa; sin embargo sólo
la RNA polimerasa II transcribe los mRNA. En general, las fases de iniciación,
elongación y terminación de la síntesis de RNA en eucariotas se parecen a la de los
procariotas. Sin embargo, hay diferencias importantes. La RNA polimerasa II no se
une directamente al promotor en el DNA, pero si se unen los factores generales de la
transcripción, que reconocen la secuencia TATA presente en la mayoría de los
promotores eucarióticos. La RNA polimerasa II es una molécula mucho mayor que
su homóloga procariótica. Contiene numerosas subunidades que funcionan en la
elongación del transcrito primario, y también coordinan los sucesos de
procesamiento que son necesarios para producir el mRNA maduro. Los sucesos de
procesamiento incluyen la adición de la caperuza 5’, la eliminación de los intrones y
el empalme de los exones por el empalmosoma, y la ruptura del extremo 3’ seguida
de la poliadenilación. Una parte del núcleo de la RNA polimerasa II, el dominio de
la cola carboxilo, se posiciona idóneamente para interactuar con el RNA a medida
que emerge de la polimerasa. A través del CTD, la RNA polimerasa II coordina los
numerosos sucesos de la síntesis y el procesamiento del RNA.
Los descubrimientos de los últimos 20 años han revelado la importancia de las
nuevas clases funcionales del RNA. Anteriormente se pensaba que sólo se trataba de
un “humilde” mensajero y ahora se reconoce al RNA como una molécula versátil y
dinámica que participa en muchos procesos celulares. El descubrimiento del
autoempalme de los intrones y exones demostró que el RNA puede funcionar como
una molécula catalítica, así como una proteína. Desde el hallazgo de las ribozimas,
39
la comunidad científica comenzó a prestar mayor atención al RNA. Se reconoce
ahora que los RNA nucleares pequeños y los RNA no codificadores en el
empalmosoma, poseen actividad catalítica para remover los intrones y unir los
exones. El siglo veinte terminó con el descubrimiento de otra clase de RNA
funcional, el RNA de interferencia pequeño, que protege la integridad de los
genomas de las plantas y los animales activando la ruta del RNA de interferencia.
Términos claves
aguas abajo (página 302)
aguas arriba (página 302)
burbuja de transcripción (página 303)
caja TATA (página 306)
caperuza (página 308)
cola de poliA (página 308)
complejo de preiniciación (PIC) (página 306)
corte y empalme (página 308)
corte y empalme alternativo (página 309)
corte y empalme del RNA (página 296)
cosupresión (página 313)
dominio de la cola carboxilo (CTD) (página 307)
elongación (página 302)
empalmosoma (página 296)
exón (página 296)
experimento de pulso y caza (página 297)
40
factor general de la trasncripción (GTF) (página 305)
factor sigma (σ) (página 303)
gen endógeno (página 313)
cadena codificadora (página 301)
cadena de RNA antisentido (página 312)
holoenzima RNA polimerasa (página 303)
iniciación (página 302)
interferencia de RNA (RNAi) (página 314)
intrón (página 296)
microRNA (miRNA) (página 299)
molde o templado (página 300)
mundo del RNA (página 312)
procesamiento cotranscripcional (página 307)
procesamiento del RNA (página 305)
procesamiento postranscripcional (página 307)
promotor (página 302)
proteína de unión a TATA (TBP) (página 306)
proteoma (página 309)
región 3’ no traducida (3’ UTR) (página 304)
región 5’ no traducida (5’ UTR) (página 304)
regla GU-AG (página 310)
ribosa (página 297)
ribozima (página 298)
RNA funcional (página 309)
RNA de interferencia pequeño (siRNA) (página 299)
41
RNA mensajero (mRNA) (página 298)
RNA nuclear pequeño (snRNA) (página 299)
RNA polimerasa (página 300)
RNA ribosómico (rRNA) (página 299)
RNA de transferencia (tRNA) (página 299)
ruta del RNAi (página 314)
secuencia consenso (página 302)
silenciamiento de un transgén (página 313)
silenciamiento génico (página 312)
terminación (página 302)
transcrito (página 300)
transcrito primario (pre-mRNA) (página 305)
transgén (página 313)
uracilo (U) (página 298)
Problemas
PROBLEMAS BÁSICOS
1. Las dos cadenas del material genético del fago  se distinguen por su contenido GC. Esta
propiedad permite separarlas en un gradiente alcalino de cloruro de cesio ya que la
alcalinidad desnaturaliza la doble hélice. Se observa que cuando se aísla de células
infectadas, el RNA sintetizado por el fago  hibrida con ambas cadenas del DNA del fago.
¿Qué significado tiene esta observación? Formule algunas predicciones que se puedan
42
comprobar.
2
Describa qué le ocurre al RNA mientras la polimerasa está sintetizando un
transcrito del molde de DNA, tanto en procariotas como en eucariotas.
3. Escriba tres ejemplos de proteínas que actúen sobre los ácidos nucleicos.
4. ¿Cuál es la función primaria del factor sigma? ¿Hay una proteína análoga en los
eucariotas?
5. Se ha identificado una mutación en levaduras, un eucariota unicelular, que
previene la adición de la caperuza 5’ al transcrito primario. Sin embargo, se
observó que las proteínas que se requieren para la colocación de la caperuza son
normales. Se determina entonces que la mutación está en una de las subunidades
de la RNA polimerasa II. ¿Cuál es la subunidad mutante y cómo esta mutación
produce el fallo en la colocación de la caperuza en el RNA de las levaduras?
6. ¿Por qué se produce el RNA sólo a partir de la cadena molde del DNA y no a
partir de ambas cadenas?
7. Un plásmido linear sólo contiene dos genes, que se transcriben en direcciones
opuestas, desde el extremo hacia el centro del plásmido. Dibuje diagramas de:
a. El DNA del plásmido, mostrando los extremos 5’ y 3’ de ambas cadenas.
b. La cadena molde de cada gen.
c. La posición del sitio de iniciación de la transcripción.
d. Los transcritos, mostrando los extremos 5’ y 3’.
8. ¿Existen similitudes entre la burbuja de replicación del DNA y la burbuja de
transcripción descubierta en los eucariotas? Explique.
9. Cuál de las siguientes afirmaciones acerca del mRNA eucariótico es cierta:
a. El factor sigma es esencial para la iniciación correcta de la transcripción.
43
b. El procesamiento del mRNA naciente puede comenzar antes que se
complete su transcripción.
c. El procesamiento del RNA tiene lugar en el citoplasma.
d. La terminación se produce por a partir de un bucle en horquilla o del
factor rho.
e. Pueden transcribirse muchos RNA simultáneamente a partir de un molde
de DNA.
10. Una investigadora mutó células procarióticas insertando segmentos de DNA.
Obtuvo las siguientes mutaciones:
Original TTGACAT 15 a17 pb TATAAT
Mutante TATAAT 15 a 17 pb TTGACAT
a. ¿Qué representa esta secuencia?
b. ¿Cual es su predicción acerca del efecto que tendrá esta mutación?
Explique.
11. En el Capíltulo20 se verá el tema de la ingeniería genética, pero, por ahora
póngase el título de ingeniero genético e intente resolver este problema. E. coli
se emplea en el laboratorio para producir proteínas de otros organismos.
a. Ha aislado un gen de levaduras que codifica para una enzima metabólica
y desea producir esta enzima en E. coli; pero tiene la sospecha que el
promotor de la levadura no funcionará correctamente en E. coli. ¿Por
qué?
b. Después de reemplazar el promotor de la levadura con un promotor de E.
coli, detecta RNA proveniente del gen de levadura, pero está confundido
porque el RNA tiene casi el doble del tamaño del mRNA del gen aislado
de la levadura. Explique por qué obtuvo este resultado.
44
12. Esquematice un gen procariótico y su producto de RNA. Asegúrese de incluir el
promotor, el sitio de transcripción, el sitio de finalización de la transcripción, la
región no traducida y los extremos marcados 5’ y 3’.
13. Esquematice un gen eucariota con dos intrones y sus productos pre-mRNA y
mRNA. Asegúrese de incluir todas las características del gen procariota del
problema 12, además de los sucesos necesarios para producir el mRNA.
14. Un gen que codifica para una proteína de Drosophila tiene un intrón. Si se
examina una gran muestra de alelos nulos de este gen, ¿se esperaría que hubiera
sitios mutantes:
a. en los exones?
b. en el intrón?
c. en el promotor?
d. en el puente entre el intrón y el exón?
15. ¿Qué es el autoempalme de los exones y por qué la existencia de este
mecanismo apoya la teoría que el RNA evolucionó antes que las proteínas?
16. Los antibióticos son drogas que matan selectivamente a las bacterias sin dañar a
los animales. Muchos antibióticos actúan uniéndose a ciertas proteínas que son
críticas para la función bacteriana. Explique por qué la mayoría de los
antibióticos exitosos actúan sobre la polimerasa bacteriana.
PROBLEMAS PARA PENSAR.
17. Los siguientes datos proporcionan la composición de bases del DNA de doble
cadena y sus productos de RNA de dos especies bacterianas diferentes obtenidos
en experimentos in vitro:
45
Especies
(A+T)/(G+C)
Bacillus subtilis
E. coli
1.36
1.00
(A+U)/(G+C)
1.30
0.98
(A+G)/(U+C)
1.02
0.80
a. A partir de los datos, ¿se puede determinar si el RNA de estas especies se copia
a partir de una cadena única o de ambas cadenas del DNA? ¿Cómo?
Esquematice un diagrama que le facilitará la resolución de este problema.
b. Explique cómo se podría decir si el mismo RNA es de cadena simple o doble.
(El Problema 17 está tomado del libro de Strickberger, Genetics, con permiso de
Macmillan Publishing Co., Inc, Copyright 1968, Monroe Strickberger).
18. Se identificó inicialmente que un gen humano tiene tres exones y dos intrones.
Los exones tienen 456, 224, y 524 pb, mientras que los intrones tienen 2,3 kb y
4,6 kb.
a. Esquematice este gen, señalando sus promotores, los intrones, los exones
y los sitios de inicio y terminación de la transcripción.
b. Sorprendentemente, se descubrió que este gen codifica dos mRNA que
sólo tienen 224 nucleótidos en común. El mRNA original tiene 1.204
nucleótidos, y el nuevo mensajero tiene 2.524 nucleótidos. Emplee su
esquema para mostrar como ésta región de DNA puede codificar para
dos transcritos.
19. Mientras está trabajando en su laboratorio, aísla un mRNA de C. elegans que
sospecha que es esencial para que los embriones se desarrollen exitosamente.
Suponiendo que es capaz de trasformar el mRNA de simple cadena en un
mRNA de doble cadena; diseñe un experimento para contrastar su hipótesis.
46
20. El glifosato es un herbicida empleado para eliminar las malas hierbas. Es el
principal componente de un producto hecho en la Compañía Monsanto llamado
“Roundup”. El glifosato mata a las plantas inhibiendo un enzima en la ruta
metabólica shikimate llamada EPSPS. Se considera que este herbicida es seguro
para los animales, ya que no tienen la ruta metabólica shikimate. Para vender
todavía más su herbicida, Monsanto encargó a sus botánicos genetistas
manipular genéticamente diversos cultivos, incluyendo el maíz, para que sean
resistentes al glifosato. Los investigadores introdujeron una enzima EPSPS
resistente a la inhibición por glifosato en las plantas de cultivo y luego probaron
la resistencia al herbicida en las plantas transformadas.
Imagine que es uno de estos científicos y que ha manipulado los cromosomas de
maíz para introducir exitosamente el gen EPSPS; y descubre que algunas de las
plantas transgénicas son resistentes al herbicida, mientras que otras no lo son. Su
supervisor está muy disgustado y le exige una explicación de por qué algunas
plantas no son resistentes aunque tengan el transgén en sus cromosomas. Dibuje
una figura que ayude a su supervisor a entender el resultado.
21. Muchos cánceres humanos se producen cuando un gen normal muta y lleva a un
crecimiento descontrolado (un tumor). Cuando los genes que causan el cáncer
están mutados se denominan oncogenes. La quimioterapia es efectiva contra
muchos tumores porque se dirige a las células que se dividen rápidamente y las
mata.
Desafortunadamente,
la
quimioterapia
tiene
numerosos
efectos
secundarios, como la pérdida del cabello o náuseas, debido a que también mata
muchas células normales que se dividen rápidamente, como las células de los
folículos pilosos y el epitelio estomacal.
47
Muchos científicos y las grandes compañías farmacéuticas están
entusiasmados ante la posibilidad de explotar la ruta del RNAi para inhibir
selectivamente a los oncogenes en el tratamiento in vivo de los tumores.
Explique en términos muy generales cómo una terapia de silenciamiento génico
podría emplearse para tratar el cáncer y por qué este tipo de terapia podría tener
menos efectos secundarios que la quimioterapia.
48
FIGURAS Capítulo 8
Página 295
La RNA polimerasa en acción. Una RNA polimerasa muy pequeña (en azul), producida
por el bacteriófago T7, transcribe del DNA a una cadena de RNA (en rojo). La enzima
separa la doble hélice del DNA (en naranja y amarillo), exponiendo la cadena molde
para ser copiada a RNA. (David S. Goodsell, Scripps Research Institute)
Página 297
FIGURA 8-1
Título: El mRNA eucariótico migra del núcleo al citoplasma.
El experimento de pulso y caza mostró que el mRNA se mueve dentro del citoplasma.
Las células se colocan en un medio radiactivo donde crecen durante un breve lapso de
tiempo para marcar el RNA recién sintetizado (pulso). Se lavan las células para eliminar
el uracilo radiactivo y se ponen a crecer en un medio con exceso de uracilo no
radiactivo (caza). Los puntos rojos indican la localización del RNA que contiene el
uracilo a lo largo del tiempo.
Página 298
FIGURA 8-2
Título: Los cuatro ribonucleótidos presentes en el RNA.
Página 300
FIGURA 8-3
Título: Las cadenas opuestas de DNA pueden servir como molde para el RNA
49
Sólo una cadena de DNA es el molde para la transcripción génica, pero varía con el gen
cuál de ellas es. La dirección de la transcripción es siempre la misma para cada gen y
comienza desde el extremo 3’ del molde de DNA y el extremo 5’ del RNA transcrito.
Así pues, los genes transcritos en diferentes direcciones utilizan como molde cadenas
opuestas de DNA.
Página 300
FIGURA 8-4
Título: Visión general de la transcripción
a) La transcripción de dos genes en direcciones opuestas. Se muestra el gen 1 y el gen 2
de la Figura 8-3. El gen 1 se transcribe de la cadena inferior. La RNA polimerasa migra
hacia la izquierda, leyendo el molde en una dirección 3’ a 5’ y sintetizando el RNA en
una dirección 5’ a 3’. El gen 2 se trancribe en dirección opuesta, hacia la derecha,
porque la cadena en la parte superior es el molde. A medida que procede la
transcripción, el extremo 5’ del RNA se desplaza del molde y la burbuja de
trasncripción se va cerrando detrás de la polimerasa.
b) A medida que el gen 1 se transcribe, el grupo fosfato en el extremo 5’ del
ribonucleótido entrante (U) se engancha al extremo 3’ de la cadena de RNA en
crecimiento. S=azúcar.
WWW.ANIMATED ART Transcripción
Página 301
FIGURA 8-5
Título: Muchos RNAs pueden transcribirse simultáneamente de un mismo gen.
50
Esta electrofotomicrografía muestra la transcripción de los genes de RNA ribosomales
repetidos en tándem en el núcleo del anfibio Triturus viridiscens. A lo largo de cada
gen, muchas RNA polimerasas están transcribiendo en una dirección. Los transcritos de
RNA en crecimiento aparecen como hilos que se extiende hacia afuera del esqueleto de
DNA. Los transcritos más cortos están cercanos al sitio de inicio de la transcripción; los
más largos están cercanos al final del gen; el resultado tiene parecido a un “árbol de
navidad”. (Fotografía de O.L. Miller, Jr. and Barbara A. Hamkalo).
Página 301
FIGURA 8-6
Título: Secuencias de DNA y del transcrito de RNA
La secuencia del mRNA es complementaria a la cadena molde de DNA de la que se
transcribe y por lo tanto se corresponde con la secuencia de la cadena de DNA
complementaria al molde (excepto que el RNA tiene U en lugar de T). Esta secuencia es
del gen de la enzima β-galactosidasa.
Página 302
FIGURA 8-7
Título: Secuencias promotoras en E. coli
a) El promotor se localiza “aguas arriba (hacia el extremo 5’) del punto de iniciación y
la secuencia codificadora. b) Los promotores tienen regiones de secuencia similar, como
lo indica la región sombreada en amarillo en siete secuencias promotoras distintas de E.
coli. Se insertan espacios o puntos en la secuencia para optimizar el alineamiento de las
regiones comunes. Los números se refieren a los números de bases antes (-) o después
(+) del punto de iniciación de la síntesis de RNA. La secuencia consenso de la mayoría
51
de los promotores de E. coli se da abajo. (De H. Lodish, D. Baltimore, A. Berk, S.L.
Zipursky, P. Matsudaira, y J. Darnell. Molecular Cell Biology 3rd ed. Copyright 1995
por Scientifica American Books, Inc. Todos los derechos reservados. Vease W. R.
McClure, Annu. Rev. Bioichem. 54, 1985, 171, Secuencias consenso).
Página 303
FIGURA 8-8
Título: La iniciación de la transcripción en los procariotas
La posición de la subunidad σ en la RNA polimerasa procariótica al inicio de la
transcripción.
a) La unión de la subunidad σ a la región -10 y -35 posiciona a las otras subunidades
para la iniciación correcta.
b) Muy poco después que comience la síntesis del RNA, la subunidad σ se disocia de
las otras subunidades que continúan la transcripción. (De B.M. Turner. Chromatin and
gene regulation. Copyright 2001 por Blackwell Science Ltd.)
Página 303
FIGURA 8-9
Título: Elongación y terminación de la transcripción
Las cinco subunidades de la RNA polimerasa se muestran en la figura con una forma de
elipse rodeada por la burbuja de transcripción. a) Elongación: Síntesis de un RNA
complementario a la región de cadena única de la cadena molde de DNA en la dirección
5’ a 3’. El DNA que se desenrolla por delante de la RNA polimerasa se vuelve a
enrollar después de la transcripción. b) Terminación: El mecanismo intrínseco que se
muestra aquí es una de las dos formas empleadas para finalizar la síntesis de RNA,
52
liberar el transcrito de RNA y la RNA polimerasa. En este caso, la formación de un
bucle en horquilla desencadena su liberación. Tanto para el mecanismo intrínseco como
para el mecanismo mediado por rho, la terminación requiere primero la síntesis de
ciertas secuencias de RNA.
Página 304
FIGURA 8-10
Título: Sitio de terminación de la transcripción en bacterias.
Estructura de un sitio de terminación de la RNA polimerasa en bacterias. La estructura
de bucle en horquilla se forma por el apareamiento complementario dentro de una
cadena de RNA rica en GC. La mayor parte del apareamiento de bases del RNA ocurre
entre G y C, pero en este caso hay un par A-U.
Página 305
FIGURA 8-11
Título: Comparación de la transcripción y la traducción entre procariotas y eucariotas
La transcripción y la traducción en los procariotas tienen lugar en el mismo
compartimiento celular, pero en los eucariotas se realizan en compartimientos
diferentes. Además, a diferencia de los transcritos de RNA procarióticos, a los
eucarióticos se los procesa antes de ser traducidos a proteínas. (De J. Darnell. H.
Lodish, and D. Baltimore. Molecular Cell Biology 2nd ed. Copyright 1990 por
Scientific American Books, Inc. Todos los derechos reservados).
Página 307
FIGURA 8-12
53
Título: Iniciación de la transcripción en eucariotas
La formación del complejo de preiniciación generalmente comienza con la unión de la
proteína de unión TATA (TBP), que recluta a los otros factores generales de
transcripción (TFs) y a la RNA polimerasa II hacia el sitio de iniciación de la
transcripción. La transcripción comienza después de la fosforilación del dominio de la
cola carboxilo (CTD) de la RNA polimerasa II. (De “RNA polimerasa II Holoenzima y
factores de transcripción”, Enciclopedia de Ciencias de la Vida. Copyright 2001
Macmillan Publishing Group Ltd./Nature Publishing Group)
Página 308
FIGURA 8-13
Título: Procesamiento cotranscripcional del RNA
El procesamiento cotranscripcional del RNA está coordinado por el dominio de la cola
carboxilo (CTD) de la subunidad β de la RNA polimerasa II. La fosforilación reversible
de los aminoácidos del CTD (inidcado por P’s) crea los sitios de unión para las
diferentes enzimas de procesamiento y los factores que se requieren para a) la adición
de la caperuza, b) el corte y empalme del RNA, (c) la escisión y poliadenilación. (Parte
a) y b) de R.I. Drapkin y D.F. Reinberg, “Síntesis del RNA”, Enciclopedia de Ciencias
de la Vida. Copyright 2002, Macmillan Publishing Group Ltd./Nature Publishing
Group)
Página 309
FIGURA 8-14
Título: Patrón complejo de corte y empalme del mRNA eucariótico
54
El transcrito pre-mRNA del gen α-tropomiosina de la rata se corta y empalma
alternativamente en diferentes tipos celulares. Las cajas verde claro representan los
intrones; los otros colores representan los exones. Las señales de poliadenilación se
indican con una A. Las líneas interrumpidas en el RNA maduro indican las regiones
eliminadas por el corte y empalme. TM: tropomiosina. (De J.P. Lees et al., Mol Cell.
Biol. 10, 1990, 1729-1742).
Página 310
FIGURA 8-15
Título: Secuencias conservadas relacionadas con el corte de los intrones
Las secuencias de nucleótidos conservadas están presentes en las junturas de intrones y
exones. Los números de debajo de los nucleótidos indican el porcentaje de similitud
entre organismos. De especial importancia son los residuos de G y U en el extremo 5’,
los de A y G en el extremo 3’ y los residuos marcados como “puntos de ramificación”.
Véase en la Figura 8-17 una representación de la estructura de ramificación). N
representa una base cualquiera.
Página 311
FIGURA 8-16
Título: Ensamblaje y funcionamiento del empalmosoma
El empalmosoma se compone de varias snRNP que se adhieren secuencialmente al
RNA, ocupando sus posiciones aproximadas como se muestra en la figura. El
alineamiento de las snRNP resulta de los puentes de hidrógeno de sus moléculas de
snRNA con las secuencias complementarias del intrón. De esta forma, los reactivos
están alineados de manera adecuada y pueden tener lugar las dos reacciones de corte y
55
empalme. La química de estas reacciones puede verse con mayor detalle en la Figura 817.
Página 311
FIGURA 8-17
Título: Reacciones en el empalme de los exones
Las dos reacciones de transesterificación que tienen lugar en el corte y empalme del
RNA: primero, la unión del extremo donante 5’ al extremo de ramificación interno
(primera reacción en la Figura 8-16), y segundo, para juntar los dos exones (segunda
reacción en la Figura 8-16), (De H. Lodish, A. Berk, S.O. Zipurski, P. Matsudaira, D.
baltimore y J. darnell. Molecular Cell Biology, 4th. Ed. Copyright 2000 por W.H.
Freeman and Company).
Página 312
FIGURA 8-18
Título: Reacción de autoeliminación
La autoeliminación del intrón de Tetrahymena ejecuta dos reacciones de
transesterificación para su propia eliminación del RNA
Página 313
FIGURA 8-19
Título: Los RNAs pequeños fueron el gran descubrimiento del año
Cubierta de la revista Science de Diciembre de 2002. (Science, vol. 298, no. 5602,
December 20, 2002).
56
Página 313
FIGURA 8-20
Título: Flores de petunia que demuestran la cosupresión
a) El fenotipo salvaje (no transgénico). b) y c) Fenotipos de cosupresión resultado de la
transformación de la petunia salvaje de la figura a con un gen de petunia necesario para
la pigmentación. En las regiones sin color, están inactivados tanto el transgén como la
copia cromosómica del mismo gen. (Fotografías por cortesía de Richard A. Jorgensen,
Departament of Plant Science, Universidad de Arizona).
Página 314
FIGURA 8-21
Título: Mecanismo de acción del RNAi
En la ruta metabólica de la interferencia por RNA, los RNA de doble cadena (dsRNA)
interactúan específicamente con el complejo Dicer, que corta en trocitos cortos el
dsRNA. El complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC) utiliza los pequeños
dsRNA para descubrir y destruir los mRNA homólogos transcritos del DNA,
reprimiendo así la expresión génica.
Página 314
FIGURA 8-22
Título: Un modo de generar RNA de doble cadena en una célula
Como se describe en el texto, el dsRNA producido por inyección directa o posterior a la
integración en el cromosoma estimulará la ruta metabólica del RNAi.
57
FIGURAS
PARCHEADO:
Página 297
FIGURA 8-1
1: El mRNA eucariótico se mueve del núcleo al citoplasma.
2: Núcleo
3: Citoplasma
4: Después del pulso
5: Caza con precursores de RNA no radiactivos
6: Después de la caza.
Página 298
FIGURA 8-2
1-Los cuatro ribonucleótidos presentes en el RNA.
2-Ribonucleótidos de purina
3-Fosfato
4-Adenina (A)
5-Azúcar ribosa
6-Adenosina 5’-monofosfato (AMP)
7-Guanina (G)
8-Guanosina 5’- monofosfato (GMP)
9-Ribonucleótidos de pirimidina
10-Citosina (C)
11-Citidina 5’-monofosfato (CMP)
12-Uracilo (U)
58
13-Uridina 5’-monofosfato (UMP)
Página 300
1- Las cadenas opuestas de DNA pueden servir como molde para el RNA
2- Gen 2
3- Gen 3
4- Gen 1
5- Cadena molde para el gen 1
Página 300
FIGURA 8-3
Cadena molde del gen 1
Página 300
FIGURA 8-4
1- Vista general de la transcripción.
2- Enrollamiento
3- Re-enrollamiento
4- RNA
5- Cadena molde del gen 2
6- DNA
7- RNA polimerasa
8- Cadena molde del gen 1
59
9- RNA
10- Cadena no molde del gen 2
11- RNA polimerasa
12- Gen 1
13- Gen 2
14- Adición al extremo 3’ de la cadena creciente
15- RNA
16- Cadena molde de DNA
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FIGURA 8-5
No tiene parcheado
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FIGURA 8-6
1- Secuencias de DNA y del transcrito de RNA
2- Cadena complementaria a la molde 5’
3- Cadena molde 3’
4- DNA
5- mRNA
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FIGURA 8-7
1. Secuencias promotoras en E. coli
2. Gen
60
3. 5’ UTR
4. AUG
5. Transcripción
6. Promotor
7. Secuencia codificadora del gen
8. ATG
9. b) Promotores fuertes de E. coli
10. tyr tRNA
11. rrn D1
12. rrn X1
13. rrn (DXE)2
14. rrn E1
15. rrn A1
16. rrn A2
17. Secuencia consenso de la mayoría de los promotores de E. coli
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FIGURA 8-8
(a) Unión de la RNA polimerasa al promotor
(b) Iniciación
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FIGURA 8-9
1- Elongación y terminación de la transcripción.
2- a) Elongación
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3- Re-enrollamiento
4- Desenrollamiento
5- RNA polimerasa
6- b) Terminación: mecanismo intrínseco
7- Liberación del RNA
8- Horquilla
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FIGURA 8-10
1- Sitio de terminación de la transcripción en bacterias.
2- Transcrito de RNA.
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FIGURA 8-11
1- Comparación de la transcripción y la traducción entre procariotas y eucariotas.
2- DNA
3- mRNA
4- PROCARIOTA
5- Cadena creciente de aminoácidos
6- DNA
7- Núcleo
8- Transcripción y procesamiento
9- Citoplasma
10- mRNA
11- EUCARIOTA
62
12- Transporte
13- Procesamiento
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FIGURA 8-12
1- Iniciación de la transcripción en los eucariotas.
2- TATA
3- Sitio de iniciación
4- Unión de TBP y TFIID
5- TBP
6- TFIID
7- Formación del complejo de preiniciación
8- TFIIF
9- TFIIH
10- TFIII
11- RNA polimerasa II comienza la elongación
12- TFIID
13- TATA
14- CTD
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FIGURA 8-13
1- Procesamiento cotranscripcional del RNA
2- a) Adición de la caperuza
3- Sitio de iniciación de la transcripción
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4- CTD
5- Enzimas de adición de la caperuza
5’
Caperuza
6- b) Corte y empalme del RNA
7- CTD
8- Maquinaria de corte y empalme del RNA
9- c) Ruptura y poliadenilación
10- CTD
11- Adición de la cola de poli(A)
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FIGURA 8-14
1- Patrón complejo de corte y empalme del mRNA eucariótico
2- Pre-mRNA transcrito primario
3- Músculo estriado
4- Músculo liso
5- TMBr-1 Cerebro
6- TMBr-2 Cerebro
7- TMBr-3 Cerebro
8- TM-2 Fibroblasto
9- TM-3 Fibroblasto
10- TM-5a fibroblasto
11- TM-5b fibroblasto.
64
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FIGURA 8-15
1- Secuencias conservadas relacionadas con el corte de los intrones.
2- Sitio de corte y empalme 5’
3- Punto de ramificación
4- 5’ del exón
5- Intrón
6- Sitio de corte y empalme 3’
7- 3’ del exón
8- Pre-mRNA
9- Frecuencia de aparición (%)
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FIGURA 8-16
1- Ensamblaje y funcionamiento del empalmosoma.
2- Exón
3- Intrón
4- Exón
5- Los SNPs U1 y U2 se unen al sitio de empalme 5’ y a la A interna
6- El complejo U4-U5-U6 se une al empalmosoma
7- Primera reacción de corte y empalme: se fija un extremo del intrón a A.
8- Segunda reacción de corte y empalme: se corta el otro extremo del intrón y se
empalma el exón
9- Exones empalmados.
65
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FIGURA 8-17
1- Reacciones en el empalme de los exones
2- Intrón
3- Exón 1
4- Exón 2
5- Primera transesterificación
6- Segunda transesterificación
7- Eliminación del lazo del intrón
8- Exones empalmados
9- Oxígeno 3’ del exón 1
10- Oxígeno 2’ del punto de ramificación A
11- Oxígeno 3’ del intrón
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FIGURA 8-18
1- Reacción de autoeliminación
2- Sitio de unión a G
3- Intrón
4- Exón 4’ exón
5- Intrón linear
6- Exones empalmados
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66
FIGURA 8-19
1- Los RNAs pequeños fueron el gran descubrimiento del año
2- Nuevos roles para el RNA
3- Descubrimiento del año
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FIGURA 8-20
1- Flores de petunia que demuestran la cosupresión.
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FIGURA 8-21
1- Mecanismo de acción del RNAi.
2- Dicer
3- dsRNA
4- Dicer trocea el dsRNA
5- El segmento dsRNA se une a RISC y se separa en dos cadenas simples.
6- RISC
7- El mRNA complementario se une a RISC
8- mRNA blanco
9- RISC degrada al mRNA unido
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FIGURA 8-22
1- Un modo de generar RNA de doble cadena en una célula
2- mRNA
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3- Promotor en un gen flanqueante
4- Transgén
5- Gen
6- Antisentido del transgén
7- RNA de doble cadena.
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