Report about the function of Okazaki`s fragment

Report about the function of Okazaki’s fragment
TOPICS IN NANOBIOTECHNOLOGY
GRADUATE STUDIES IN CHEMICAL AND PROCESS ENGINEERING
Professor: Ciara K. O'sullivan
Eva María López Mendoza
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Para comprender la funcion y actuacion del fragmento de Okasaki es necesario entender en que
consiste la replicacion del ADN y todas las estructuras puestas en juego.
El modelo de Watson y Crick para la estructura del ADN sugería un modo de replicación
semiconservativa.
Sin embargo, mientras no se descartaran experimentalmente, tres modelos de replicación eran
posibles:
Fig. 1. Modelos de reproducción de ADN
El experimento de Matthew Meselson y Franklin Stahl (1958) demuestra que la replicación del
ADN ocurre según el modelo semiconservativo: cultivaron bacterias E.coli en un medio que
contenía como única fuente de nitrógeno cloruro amónico marcado con 15N hasta que llegó un
momento en que el ADN sólo presentaba en sus bases nitrogenadas 15N. Posteriormente cambiaron
el medio de cultivo por otro con 14N normal. Las bacterias de la primera generación presentaban en
su ADN 14N y 15N en igual cantidad. A continuación se puede ver un esquema de la metodología a
seguir y los resultados del experimento.
El proceso de replicación es similar tanto en los organismos procariotas como en los eucariotas,
pero es en los primeros donde más se conocen los detalles; en concreto la más estudiada es la
replicación en E.coli.
A continuación se puede ver un esquema de la metodología a seguir y los resultados del
experimento.
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fig 2.Esperimento de Matthew Meselson y Franklin Stahl (1958) en E.coli.
La replicación en Escherichia coli
Origen de replicación y horquilla de replicación
Los orígenes de replicación suelen ser regiones ricas en pares A=T. El cromosoma bacteriano
contiene una sola región de 245 pb, denominada oriC, donde se inicia la replicación. Esta región
contiene repeticiones de 9 pb y repeticiones de 13 pb.
A partir del origen la replicación es bidireccional, lo que da lugar a la formación de dos horquillas
de replicación.
Puesto que el cromosoma bacteriano es circular, las dos horquillas acaban encontrándose en una
región denominada ter.
La longitud de ADN que se replica a partir de un solo origen de replicación se denomina
replicón. En E. coli el cromosoma entero constituye un replicón.
Síntesis continua y discontinua. Fragmentos de Okazaki.
La síntesis de ADN sólo ocurre en sentido 5'-3'. Debido a que las cadenas del ADN son
antiparalelas, una de ellas se replicará en la misma dirección en que se desplaza la horquilla de
replicación y la otra en la dirección contraria. La primera se sintetiza de modo continuo (cadena
líder), la segunda se sintetiza de modo discontinuo (cadena retrasada). Cada fragmento que se
sintetiza de la cadena retrasada se denomina fragmento de Okazaki.
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fig 3 Sintesis de ADN
Enzimología de
replicación
En 1957 Kornberg y colaboradores aíslan la primera enzima de E. coli capaz de catalizar la
síntesis de ADN. Se denomina ADN polimerasa I (pol I).
Requerimientos de la polimerasa de ADN:
 Los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
 ADN molde
la
En 1967, Goulian, Kornberg y Sinsheimer demuestran que el ADN del fago X174 sintetizado
in vitro con esta polimerasa es biológicamente activo (capaz de dirigir la formación de nuevos
fagos).
En 1969, Peter De Lucia y John Cairns descubren un mutante de E. coli deficiente en actividad
ADN polimerasa I (mutante en el gen polA). Este mutante, aunque con defectos en reparación de
daños al ADN, era viable y, por tanto, capaz de replicar su ADN. Esto implicaba:
Existe en E. coli al menos otra enzima con capacidad para replicar el ADN
La polimerasa I sólo tiene una función secundaria en la síntesis de ADN in vivo
Hasta ahora se han descubierto dos ADN polimerasas más en E. coli: ADN polimerasas II y III.
Propiedades de las tres polimerasas de ADN bacterianas:
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La ADN polimerasa III es la responsable de la polimerización esencial para la replicación.
Subunidades de la holoenzima de la ADN polimerasa III
La polimerasa de ADN no tiene capacidad para separar las dos cadenas ni para iniciar la
síntesis. Para esto se requieren otras proteínas: helicasa, proteínas de unión a ADN de cadena
simple (ssb), girasa, primasa. La unión de los fragmentos de Okazaki requiere una actividad
ligasa.
La iniciación de la replicación requiere las proteínas DnaA, DnaB y DnaC. Dna B tiene actividad
helicasa, necesaria para romper puentes de hidrógeno y desenrollar las cadenas:
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fig 4. Iniciacion de replicacion, actividad de enzima Helicasa.
Las proteínas de unión a cadena simple (ssb) impiden que vuelva a formarse la doble hélice así
el avance de la horquilla de replicación lleva a la formación de superenrollamientos que
deben ser eliminados. Aquí interviene la girasa, un tipo de topoisomerasa, enzima capaz de
cortar y reunir cadenas de ADN.
La cadena líder necesita un solo cebador de ARN, que es una corta cadena de ARN con una
secuencia complementaria de una de las porciones de las hebras del ADN y frente a la cual se
coloca. En la hebra que tiene el sentido 3'--5' la ADN -polimerasa va colocando nucleótido tras
nucleótido a continuación del ARN cebador. Esta hebra complementaria que va creciendo en
sentido 5'--3' es la hebra conductora.
En la hebra opuesta del ADN original no se puede realizar el mismo proceso porque discurre en
sentido 5'--3'. Por tanto, a continuación del ARN cebador se coloca un fragmento de Okazaki y,
después de éste, un nuevo ARN cebador seguido de otro fragmento de Okazaki.
En este momento actúa una ribonucleasa que elimina el ARN cebador que está entre dos fragmentos
de Okazaki. El hueco que queda es rellenado por la ADN-polimerasa. El proceso continuaría con la
colocación de un nuevo ARN cebador, otro fragmento de Okazaki, eliminación del ARN cebador y
llenado del hueco por la ADN -polimerasa. Y así sucesivamente. La hebra que se sintetiza de esta
manera es la retardada y crece en sentido 3'--5'.
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fig 5 Replicacion de cadena de ADN.
Errores en la replicacion.
La ADN polimerasa III introduce un nucleótido incorrecto cada 105 nucleótidos. El mecanismo
corrector de pruebas, basado en la actividad exonucleasa 3'-5', reduce la tasa de error a 1 cada 107.
Además, después de la replicación existen mecanismos de reparación que hacen descender la tasa
de error a 10-9 se trata de un complejo enzimático que detecta el nucleótido mal emparejado, lo
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elimina y regenera la secuencia correcta. De este modo se logra alcanzar una perfección de un error
cada 1010 pares de bases..
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