TP X Absorción intestinal

TP X: ABSORCIÓN INTESTINAL DE GLUCOSA IN VITRO
Introducción
El epitelio intestinal presenta transportadores para
monosacáridos, necesarios para su absorción hacia la sangre.
Los transportadores son proteínas de membrana que interactúan
con cierta especificidad con el substrato transportado. El
transportador para glucosa y galactosa es denominado SGLT,
existiendo los subtipos 1 y 2. Se hallan en la membrana apical
del epitelio intestinal, mientras que en la basolateral se
presentan ATPasas de Na+/K+, que generan un
gradiente de Na+ desde la cara luminal a la basal. Este gradiente es necesario para el transporte de glucosa,
conformando un mecanismo de cotransporte dependiente de energía.
La técnica de los sacos evertidos (Wilson y Wiseman, 1954) permite estudiar el transporte de substancias
a través de la pared intestinal, identificando si la molécula se absorbe por mecanismos activos o pasivos.
Se trata de evertir un segmento intestinal (de unos 3 cm de longitud), de modo que la mucosa intestinal
quede hacia el exterior, y hacer un saco mediante dos ligaduras. Los sacos llenos de solución conteniendo
glucosa se incuban en la misma solución bajo aireación continua.
Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se cuantifica la
acumulación de glucosa en el compartimiento interno.
Objetivo
El objetivo consiste en evidenciar el transporte activo de D-glucosa a
través de la pared intestinal. Para ello, se incubarán los sacos a
diferentes tiempos de 10, 20 y 30 minutos, en una solución de 1
mM de D-glucosa presente tanto dentro como fuera del saco. Dado
que las dos soluciones son inicialmente idénticas, no hay gradiente de concentración de substrato. Una vez
a transcurrido el tiempo de incubación se cuantificará la concentración de monosacárido en el
compartimento interno.
PROCEDIMIENTO
Material necesario
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Caja con hielo
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Placa de Petri
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Material quirúrgico: pinzas, tijeras, hilo quirúrgico, aguja de crochet
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Jeringa de 5 mL con aguja de punta roma
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Vasos con suero fisiológico mantenidos a 4°C
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Cronometro
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Eppendorf rotulados
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1. Soluciones de trabajo
a. Solución de Sörensen:
KH2PO4 (28,6 mM), K2HPO4 (118 mM), NaCl (1540 mM), MgSO4·7 H2O (154 mM), CaCl2 (109 mM).
b. Solución de incubación:
D-glucosa (100 mM) en solución de Sörensen (dilución 1/100, D-glucosa final: 1 mM).
La solución de incubación alcanzará un pH fisiológico (pH 7,4) y una osmolaridad de 320 mOsm/L.
2. Obtención e incubación de los sacos
Anestesiar la rata con un cóctel de ketamina (90 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) por vía intraperitoneal,
realizar incisión abdominal y extraer el intestino delgado (mejor la mitad apical, incluyendo el yeyuno).
Limpiarlo con una jeringa llena de suero fisiológico frio hasta extraer el contenido de la luz intestinal.
Mantener en el suero fisiológico frío. Evertir el intestino, mediante una aguja de crochet introducida y
fijada al extremo curvado con una doble ligadura. Seguidamente se realiza la eversión desplazando el tejido
hacia el extremo ligado.
Para armar los sacos intestinales, se llena el tubo con solución de incubación mediante jeringa de 5 ml y
aguja de punta roma. Se ligan los extremos y se incuban a 37°C durante 10, 20 o 30 min.
Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se retiran los sacos y se secan en un papel de filtro mojado
con suero fisiológico. Se los sujeta sobre un eppendorf y se práctica una incisión para recoger el líquido.
Luego se cuantifica la concentración de glucosa mediante una técnica estándar.
Representar gráficamente la concentración de D-glucosa en los sacos en función del tiempo de incubación.
Preguntas
1. ¿Cómo varía la concentración de D-glucosa a lo largo del tiempo? ¿A qué se debe esta variación?
2. La solución de incubación se prepara con la solución de Sörensen que contiene Na+ y Mg2+ ¿Para qué
son necesarios estos iones en el experimento?
3. En un experimento de absorción intestinal realizado en sacos evertidos, partiendo de solución de
incubación de glucosa 1 mM: a) se agregó ouabaína en la solución de incubación, b) se utilizó solución de
Sörensen sin Na+. Hacer un gráfico de la concentración de glucosa en función del tiempo.
Referencia:
The use of sacs of everted small intestine for the study of the transference of substances from the mucosal
to the serosal surface. Wilson TH, Wiseman GR J Physiol. 123, 116-25, 1954.
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