UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFIA DEPARTAMENTO BIOQUIMICA, BIOLOGIA MOLECULAR Y FARMACOLOGIA SECCION BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR PRACTICAS DE LABORATORIO EN BIOQUIMICA– 2006 II I.- DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE Y PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Azúcar en Sangre La sangre es el vehículo por el cual la glucosa es distribuida a los tejidos y esta puede provenir de fuentes exógenas (realimentación) o de la reserva de carbohidratos. En un adulto sano con 75 Kg de peso, la reserva de glucosa es de aproximadamente 370 g y se encuentra almacenada en forma de glucógeno hepático y muscular. Cuando es requerido por el organismo, estas reservas pueden ser movilizadas y degradadas rápidamente, lo que permite una autonomía máxima de 4 a 8 horas dependiendo de la actividad realizada, es por ello que el ser humano es altamente dependiente de la ingestión de carbohidratos de forma periódica. Monitorizar los niveles de glucosa como índice de los estados extremos fisiológicos que ocurren entre el ayuno y la realimentación no es posible, debido a que existen mecanismos de homeostasis finamente regulados que, en condiciones de ayuno, permiten mantener niveles de glucosa en sangre entre 3.6 y 6 mmoles/L (65 y 108 mg/dl), gracias a la degradación de glucógeno inicialmente y de aminoácidos glucogénicos posteriormente. Además, los niveles de glucosa son afectados por el ejercicio y por la presencia de muchas enfermedades, la edad, uso de drogas, factores de stress, etc. Sin embargo, después de corregir los niveles de glucosa en ayunas por los factores edad e interacción de drogas, se puede determinar enfermedades relacionadas con el control de los niveles de glucosa circulante, los cuales tienen gran importancia diagnóstica. Diabetes y problemas hepáticos pueden ser detectados haciendo mediciones de glucosa en ayunas y realizando a su vez una prueba de tolerancia a la glucosa Métodos para medir glucosa: El primer método que se utilizó para determinar glucosa es el denominado sustancias reductoras en sangre total, que utilizaba la reducción del cobre por la glucosa, para obtener un compuesto coloreado. Ese método es histórico, y ya no se utiliza en la práctica clínica. paso 1: paso 2: Cu ++ + glucosa Cu2OCu+ + molibdato complejos de molibdeno (azul) calor OH- Este método da un sesgo positivo grande, porque la reacción puede darse no sólo con glucosa sino con otros azúcares, creatinina, ácido ascórbico y otros compuestos reductores que puedan estar presentes en la sangre. Sin embargo, el sesgo positivo de este método era reducido en parte porque la medición se hacía en sangre total. Aunque la concentración de glucosa es usualmente la misma en el agua del plasma y en el agua dentro del eritrocito, existe relativamente menos agua por volumen de eritrocito que en el plasma. En general, los rangos de referencia para la glucosa son menores cuando se expresan para sangre total que para plasma. La tendencia en los últimos años ha sido usar ensayos enzimáticos para medir glucosa, indistintamente en suero o en plasma. Si bien los rangos de referencia para esos métodos no son muy diferentes, existe una convención para diferenciar los métodos enzimáticos del de sustancias reductoras, y es denominar “azúcar” al resultado del primer método y “glucosa” a los del segundo. La determinación de glucosa en plasma se considera más representativa de la concentración de ésta en fluidos corporales y por ello se prefiere a la determinación en sangre total. 1 El método que se va a utilizar en la práctica utiliza a la enzima glucosa oxidasa, produciendo acido Dglucónico y peróxido. El peróxido reacciona con el ácido p-hidroxibenzoico (p-HBA) y la 4-aminoantipirina (4-AAP) formando un compuesto coloreado, el cual es cuantificado por espectrofotometría a 505 nm. La glucosa oxidasa es altamente específica para la ß-D-glucosa. D-glucosa + O2 ácido D- glucónico + H2O2 Glucosa Oxidasa H2O2 + p-HBA + 4-AAP compuesto coloreado+ H2O peroxidasa Prueba de Tolerancia a la Glucosa Se puede evaluar la eficiencia del metabolismo de glucosa cuantificando los niveles de glucosa en sangre luego de una carga de glucosa oral. La tolerancia a la glucosa implica que luego de esta carga no se observe glucosa en la orina (glucosuria) y que la glucosa en sangre siga una curva típica a la largo del tiempo (ver figura). Curva de Tolerancia Promedio después de la ingestión de 100 g de glucosa glucosa (mg/dL) 350 300 250 normal 200 daño hepático 150 diabetes ligera diabetes severa 100 50 0 0 50 100 150 200 minut o s d esp ués d e la ing est ió n Idealmente, para realizar esta prueba la carga de glucosa debe ser ajustada al peso corporal del paciente (1.75 g glucosa/kg peso). Los valores de glucosa observados a los 60 minutos no deben sobrepasar las 160 mM/dL (9 mmol/l), y deben retornar a los valores de referencia dentro de los 180 minutos posteriores a la ingestión de la carga de glucosa. Existe el caso en que no se observa un incremento de los niveles de glucosa sobre el basal a lo largo del tiempo. Esto puede ser normal si se trata de un paciente joven y de contextura delgada. Sin embargo, estos resultados también pueden indicar la presencia de hipotiroidismo o estados de malabsorción. Las condiciones clínicas que pueden estar asociadas con un resultado anormal de tolerancia a la glucosa (fuera de la diabetes) son las siguientes: 1. ingestión de carbohidratos disminuida en los días anteriores a la prueba 2. insuficiencia hepática severa 3. enfermedades crónicas con desnutrición (alcoholismo, uremia) 4. inactividad física prolongada (más de 72 horas en cama) 5. stress agudo (fiebre, trauma, cirugía mayor) 6. enfermedades endocrinas (acromegalia, síndrome de Cushing, insulinoma, glucagonoma entre otras) 7. uso de drogas 8. sobrepeso (más de 20% sobre el peso ideal) 9. trastornos gastrointestinales 2 II.- DETERMINACION DE COLESTEROL Y TRIGLICERIDOS EN SANGRE El colesterol se encuentra presente en la sangre, bilis, y tejido cerebral. Es el precursor de los ácidos biliares, esteroides y de la vitamina D. El colesterol así como los triglicéridos y fosfolípidos son esencialmente insolubles en el agua: Sin embargo deben ser transportados desde el tejido de origen (el hígado donde son sintetizados o el intestino donde son absorbidos a partir de la dieta) hacia los tejidos donde serán almacenados o consumidos: Son transportados en el plasma formado lipoproteínas, las cuales se diferencian por su composición y por lo tanto en su densidad: quilomicrones, VLDL, LDL, HDL. En mamíferos, la síntesis del colesterol esta regulada por la concentración de colesterol intracelular y las hormonas glucagon e insulina. Sin embargo esta regulación puede verse alterada por las condiciones de la dieta o por defectos genéticos en el metabolismo del colesterol. Si la suma del colesterol sintetizado y el obtenido de la dieta excede la cantidad requerida para la síntesis de membranas, sales biliares y esteroides, se produce la acumulación patológica del colesterol produciendo la obstrucción de vasos sanguíneos (ateroesclerosis). Varios investigadores han encontrado relación entre esta patología y las enfermedades coronarias, con altos niveles de colesterol en particular el colesterol unido al LDL. La evaluación de los niveles de colesterol (total, asociado a HDL, asociado a LDL) y los niveles de triglicéridos constituyen una herramienta valiosa para la clasificación de los desordenes lipídicos y para prevenir los riesgos de ateroesclerosis y enfermedades coronarias. Determinación de Colesterol Total El método para determinar el Colesterol Total consta de 3 reacciones acopladas: 1. La enzima Colesterol Ester Hidrolasa, libera el colesterol de los esteres de colesterol 2. EL colesterol liberado es oxidado por la Colesterol Oxidasa produciéndose péroxido de hidrógeno 3. El peroxido de hidrogeno, en presencia de la enzima Peroxidasa reacciona con el sistema cromogénico dando origen a un compuesto coloreado, que es leido en el espectofotómetro a 505nm. Colesterol ester Colesterol + Acidos grasos Colesterol ester Hidrolasa Colesterol + O2 colesterol-4-en-3-ona + H2O2 Colesterol oxidasa 2 H2O2 + 4-AAP + p-HBA compuesto coloreado + 4H2O peroxidasa Determinación de LDL-Colesterol EL LDL-Colesterol (colesterol asociado a las lipoproteínas de baja densidad, LDL) es obtenido por precipitación selectiva del LDL mediante el uso de una solución de Heparina y Citrato de Sodio, quedando el colesterol asociado al HDL y VLDL en el sobrenadante. Por lo tanto la concentración de LDL-Colesterol precipitado se calcula obteniendo el diferencial entre el valor de Colesterol Total y el valor obtenido en el sobrenadante, el cual corresponde al Colesterol asociado a HDL y VLDL. Determinación de Triglicéridos El método para determinar los triglicéridos, se basa en la hidrólisis de los Triglicéridos por una enzima Lipasa específica, liberando los ácidos grasos y el glicerol. El glicerol luego es fosforilado por la enzima Glicerol kinasa y posteriormente el glicerol 1-fostato es oxidado a dihidroxiacetona – fosfato por la enzima Glicerol fosfato oxidasa, generándose peróxido de hidrogeno. Posteriormente, el peróxido reacciona con 3 otro sistema cromogénico compuesto por 4-aminoantipirina (4-AAP) y 3,5 Dicloro-2-Hidroxibencensulfónico (DCBS) para producir por acción de la peroxidasa un compuesto coloreado, cuya absorbancia es leída en el espectofotómetro a 520nm. Triglicéridos Glicerol + Acidos grasos Lipasa Glicerol + ATP Glicerol-1-fosfato + ADP Glicerol kinasa Glicerol 1-fosfato + O2 Dihidroxiacetonafosfato + H2O2 Glicerol-fosfato Oxidasa 2 H2O2 + 4-AAP + DCBS compuesto coloreado + 4H2O peroxidasa III. DETERMINACION DE UREA EN SANGRE La urea es el producto final mayoritario del metabolismo del nitrógeno proteico en los seres humanos. Constituye la fracción más abundante de nitrógeno no proteico. Es producida por el hígado, derivada hacia la sangre y luego excretada por la orina. Es por eso que la medición del nitrógeno ureico en sangre permite evaluar la función renal. El rango de concentración normal de urea sérica en humanos es del 10 a 50 mg/dL. Es posible encontrar niveles elevados de urea en sangre como consecuencia de alteraciones en la función hepática o renal, diabetes o luego de una ingesta elevada de proteínas. La determinación de urea en orina tiene escaso valor clínico, aunque todavía se suele realizar para evaluar el balance nitrogenado en pacientes sometidos a nutrición parenteral o en algunos casos de pacientes con insuficiencia renal aguda o crónica. La intoxicación por ingesta de exceso de urea u otras fuentes de nitrógeno no proteico es usualmente aguda, progresa rápidamente y puede ser letal. Fundamentos del método: La urea (NH2CONH2) presente en la muestra es desdoblada a amonio por acción de la enzima ureasa, según la proposición de Fauces y Scout. Ureasa CONH2CO + 2 H2O 2 NH3 + CO2 + H2O El amonio producido reacciona con salicilato e hipoclorito en ambiente alcalino formándose un complejo de color verde. La intensidad del color producido es directamente proporcional a la cantidad de urea presente en la muestra y su absorbancia se lee a 600nm. 4 PARTE PRÁCTICA OBJETIVO Determinar los niveles de Glucosa, Colesterol, Triglicéridos y Urea en muestras de suero. Discutir según los valores obtenidos para las muestras el riesgo de enfermedad coronaria, diabetes u otras patologías. MATERIALES Equipo espectrofotómetro y cubetas de plástico de 1 cm de paso. Micropipetas automáticas Tubos de ensayo (de vidrio) Tubos de microcentrífuga, puntas de pipeta, guantes REACTIVOS Reactivo para la determinación de Glucosa (Solución G) (Cromógeno + buffer + enzimas ) Reactivo para la medición de Colesterol (C) Reactivo para la medición de Triglicéridos (T) Reactivo de precipitación de LDL (L) Reactivo para la determinación de Urea (U) Reactivo Hipoclorito (para la reacción de Urea) (H) Estándar de Glucosa ( 100mg/dl) Estándar de Colesterol ( 200mg/dl) Estándar de Triglicéridos ( 200mg/dl) Estándar de Urea (66 mg/dL) Muestras de suero problema PROCEDIMIENTO I. DETERMINACIÓN DE GLUCOSA 1. Rotular los tubos de ensayos como se indica en el cuadro 2. Pipetear los volúmenes correspondientes a cada tubo según como esta indicado en el cuadro. Blanco Estandar Tiempo luego de ingesta de glucosa Muestra Estándar Glucosa Solución (G) Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Basal 30 min 60 min 90 min 120min 0.01mL 0.01mL 0.01mL 0.01mL 0.01mL 1mL 1mL 0.01mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 3. Incubar a 37°C por 5 minutos o 10 minutos a Temperatura ambiente. 4. Leer absorbancia de las muestras a 505nm dentro de los primeros 30 minutos 5. Calcular la concentración de la glucosa en las muestras proporcionadas, según la siguiente fórmula: Concentración de Glucosa: Amuestra x Cestándar / Aestándar 6. Graficar la curva de tolerancia de glucosa con los datos obtenidos 7. Determinar el diagnóstico del paciente de la muestra según el grafico de la curva de tolerancia a la glucosa 8. Discutir los resultados DATO: El intervalo de referencia normal en suero es 70 mg/dL – 100 mg/dL 5 Cuestionario: 1. Cómo varían los niveles de glucosa con la edad? 2. Qué drogas y factores pueden afectar los niveles de glucosa en sangre? 3 Discutir los mecanismos metabólicos implicados en la ocurrencia de las condiciones anormales de tolerancia a la glucosa listadas en el texto. 4 Discutir cómo aplicaría esta prueba en un paciente que tiene problemas gastrointestinales conocidos II. DETERMINACIÓN DE COLESTEROL TOTAL 1. Rotular los 3 tubos de ensayos como se indica en el cuadro 2. Pipetear los volúmenes correspondientes a cada tubo según como esta indicado en el cuadro. Estándar Colesterol Muestra Reactivo (C) Blanco Estándar 0.01mL 1mL 1mL MUESTRA 0.01mL 1mL 3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a Temperatura ambiente 4. Leer las absorbancias a 505 nm, dentro de los primeros 30 minutos 5. Calcular la concentración del colesterol, según la siguiente fórmula: Concentración de colesterol: Amuestra x Cestándar / Aestándar 6. Discutir los resultados III. DETERMINACIÓN DE COLESTEROL ASOCIADO A LDL 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. En un tubo de microcentrifuga colocar 0.05mL de la muestra Agregar 0.5mL de reactivo precipitante para LDL Mezclar y dejar reposar por 10 minutos a Temperatura ambiente Centrifugar por 3 minutos a 10,000 rpm Separar el sobrenadante en otro tubo de microcentrifuga nuevo Rotular los tubos de ensayo según el cuadro Pipetear los volúmenes correspondientes a cada tubo según como esta indicado en el cuadro. Blanco Estándar Colesterol Sobrenadante Reactivo (C) 1mL Estándar 0.01Ml 1mL MUESTRA 0.1 mL (100 uL) 1mL 8. Agitar bien e incubar por 10 a 37oC o 20 minutos a Temperatura ambiente 9. Leer las absorbancias a 505 nm dentro de los primeros 30 minutos 10. Calcular la concentración del colesterol en el sobrenadante: Amuestra x factor Factor = 240 . Absorb. standard 11. Calcular la concentración del LDL colesterol, según la siguiente fórmula: LDL colesterol (mg/dL) = Colesterol total - Colesterol en Sobrenadante 12. Discutir los resultados 6 IV. DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS 1. Rotular los tubos de vidrio como se indica en el cuadro 2. Pipetear los volúmenes correspondientes a cada tubo según como esta indicado en el cuadro. Estándar Triglicéridos Muestra Reactivo (T) Blanco Estándar 0.01mL 1mL 1mL MUESTRA 0.01mL 1mL 3. Agitar bien e incubar los tubos durante 5 minutos a 37oC 4. Leer las absorbancias a 520 nm dentro de los primeros 30 minutos 5. Calcular la concentración de los Triglicéridos, según la siguiente fórmula: Estándar de Triglicéridos = 200 mg/dL Concentración de Triglicéridos = Amuestra x Cestándar / Aestándar 6. Discutir los resultados Cuestionario: 1. En un cuadro comparativo indique la densidad y composición (% de proteínas, fosfolípidos, colesterol libre, esteres de colesterol, triacilgliceroles) de las diferentes lipoproteínas 4. ¿Cuál es la lipoproteína más rica en colesterol? Que puede ocurrir en el organismo si la concentración del colesterol asociado a esta lipoproteina es muy alto? IV. DETERMINACIÓN DE UREA EN SUERO Procedimiento: a. Preparar los tubos de ensayo según indica la siguiente tabla (todos los valores están dados en mililitros). Blanco Estándar Muestra desconocida Estándar (ml) 0.0 0.01 --Muestra (ml) ----0.01 Reactivo enzimático (ml) 1 ml 1 ml 1 ml Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. (o por 3 minutos a 37 oC) Reactivo Hipoclorito (ml) 1 ml 1 ml 1 ml Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos (o por 5 minutos a 37 oC) b. Leer la absorbancia de cada tubo a 600nm (en el plazo de no más de 1 hora) c. Calcule la concentración de urea de la muestra problema siguiendo la siguiente fórmula: Factor = 66 / Absorbancia del estándar Urea (mg/dL) = Factor x Absorbancia de la muestra desconocida. 7 Rangos de Referencia para Urea en humanos: Suero o plasma: Urea 10 a 50 mg/dl Nitrógeno ureico 4.5 a 22.7 mg/dl Orina: Urea Nitrógeno ureico 15 a 30 g / 24 horas 7 a 14 g / 24 horas Cuestionario: 1. Discutir los resultados obtenidos en las muestras desconocidas. 2. Explicar por qué es importante la eliminación de la urea presente en la sangre? ANEXO Los resultados de las pruebas enzimáticas para triglicéridos y colesterol dan valores discriminantes universales que ya han sido aprobados y establecidos para la evaluación de riesgos de contraer una enfermedad cardiaca coronaria (ECC) y se denominan como valores referenciales, siendo estos los siguientes: VALORES DE COLESTEROL Hasta 200 mg/dL 200-239 mg/dL ≥ 240 mg/dL Riesgo bajo o nulo (sujetos normales) Riesgo Moderado Riesgo Elevado VALORES DE LDL-COLESTEROL Menores de 150 mg/dl. 150-195 mg/dL ≥ 195 mg/dL Riesgo bajo o nulo (sujetos normales) Riesgo moderado a elevado (individuos con probabilidad de contraer ECC) Riesgo muy elevado (individuos sospechosos de padecer ECC) VALORES DE TRIGLICERIDOS 25 - 150 mg/dL. Rango deseable 150-199 mg/dL Rango moderadamente elevado a elevado 200-499 mg/dL Rango Elevado ≥ 500 mg/dL Rango muy elevado 8