S4-MCS03

ENSAYO DE MICRONÚCLEOS EN CÉLULAS DE DESCAMACIÓN DE
VAGINA DE RATA EN PROESTRO: NUEVA ALTERNATIVA PARA
EVALUAR GENOTÓXICOS.
A.L. Zamora-Perez a,b, B.C. Gómez-Meda a, M.L Ramos-Ibarra a, C.M. BatistaGonzález a, G.M. Zúñiga-González a
a Laboratorio de Mutagénesis, Centro de Investigación Biomédica de Occidente, Instituto Mexicano del
Seguro Social, Guadalajara, Jalisco, México, [email protected]
b Instituto de Investigación en Odontología, Departamento de Clínicas Odontológicas Integrales, División
de Disciplinas Clínicas, Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara.
RESUMEN
En toxicología genética se requiere más de una prueba para determinar el potencial genotóxico de un
compuesto. La prueba de micronúcleos (MN) in vivo permite evaluar la genotoxicidad de compuestos.
Para realizarla se requiere un tejido que se divida y las células de descamación de vagina de rata en
proestro (CVRP) cumplen con este requisito. En el presente se indujo incremento de células
micronucleadas de proestro (CMNP) en vagina de rata por administración de colchicina (COL),
ciclofosfamida (CF) ó 5-Fluorouracilo (5-FU). Se formaron 8 grupos experimentales y 2 testigos
negativos. A los grupos experimentales se les expuso a una de las tres dosis de COL vía intraperitoneal,
CF vía oral o una dosis de 5-FU vía vaginal. Se realizaron extendidos de CVRP sobre portaobjetos y
fueron analizados con microscopio de fluorescencia. Las CMNP de vagina de rata incrementaron cuando
se compararon los valores basales con los siguientes 3 ó 4 proestros posteriores a la administración de los
compuestos. Estos resultados muestran que contar CMNP de vagina de rata es una nueva alternativa
sencilla y económica para el estudio de compuestos genotóxicos que se administren vía vaginal.
1. INTRODUCCIÓN
Las pruebas para la detección de agentes que dañan al ADN son de gran importancia, ya que los
compuestos genotóxicos tienen la capacidad de alterar el material genético en los organismos, incluido el
hombre1, además pueden tener efectos teratogénicos, causar mutaciones en células germinales 1,2 e inducir
mutaciones en células somáticas que pueden contribuir al desarrollo del cáncer 3-5. Actualmente se
conocen pruebas con las que se puede determinar daño genético o detectar compuestos genotóxicos, como
el ensayo de micronúcleos (MN) que es a
b
una prueba sencilla, económica y
altamente informativa6-8 y se puede
realizar en cualquier lugar sin las
limitaciones económicas que se pudieran
tener al utilizar pruebas muy sofisticadas
y por ende, muy caras 9. Los MN son
fragmentos de cromosomas o cromosomas c
d
completos que quedan fuera del núcleo en
mitosis6 y la presencia de MN se traduce
en el ámbito celular como pérdida de
ADN. La prueba de MN sirve para
detectar el efecto de agentes genotóxicos
y sus metabolitos sobre los cromosomas
7,8
, identifica tanto agentes clastogénicos
Sin tinción /1 0x / Labo ra to rio de Mutag enésis,CIBO, IMSS
Sin tinción /10x/ Laboratorio de Mutagenésis, CIBO, IMSS
Sin tinción /1 0x / Labo ra to rio de Mutag enésis,CIBO, IMSS
Sin tinción /10x/ Laboratorio de Mutagenésis, CIBO, IMSS
Figura 1. Etapas del ciclo estral de la rata.
como aneuploidogénicos 6,10 y para realizarla se requiere de tejidos con rápida proliferación celular 11,
como sería el caso de las células de descamación de vagina de rata. El ciclo estral de la rata se completa
en 4 a 5 días12 y por medio de citología vaginal se pueden identificar las 4 etapas del ciclo, por el tipo de
células encontradas 12-13: diestro (Fig.1a), proestro (Fig. 1b), estro (Fig. 1c) y metaestro (Fig. 1d).
2. OBJETIVO
En el laboratorio de Mutagénesis del CIBO, IMSS, una de las líneas de investigación que se desarrollan
es la de identificar y seleccionar aquellas especies o tejidos que presenten el mayor número de MN que
sean viables de analizar sin causarles daño a los animales al obtener la muestra, para proponerlos como
probables bioindicadores de daño genotóxico 14-18, por lo que en el presente trabajo se plantea una nueva
posibilidad para estudios de genotoxicidad en la rata, por medio del conteo de células micronucleadas de
proestro (CMNP) de vagina de rata, mediante la administración de inductores micronucleogénicos
conocidos, como colchicina (COL), ciclofosfamida (CF) ó 5-Fluorouracilo (5-FU).
3. MATERIAL Y MÉTODOS
Se formaron 8 grupos experimentales y 2 testigos negativos (5 ratas cada uno) (Proyecto No.
2000249016). A los grupos experimentales se les expuso en única ocasión o en administraciones repetidas
a una de las tres dosis de COL vía intraperitoneal, CF vía oral (Cuadro I) o una dosis de 5-FU vía vaginal
(Cuadro II) para inducir incremento de MN dosis-respuesta. A cada rata se le realizó diariamente un
lavado vaginal y con este material se realizaron extendidos de células de descamación de vagina de rata
en proestro (CVRP) sobre portaobjetos, se dejaron secar a temperatura ambiente, se fijaron, se tiñeron con
naranja de acridina19 y se tomaron los siguientes 3 proestros de los grupos a los que se les administró una
sola vez la dosis correspondiente del compuesto y 4 proestros en los grupos a los que se les administró el
compuesto diariamente durante 5 días. Se utilizó agua inyectable como vehículo para la COL o CF y para
tratar a los grupos testigo negativos. Se contaron 2,000 células mediante microscopio de fluorescencia
OLYMPUS CX31 y los resultados se expresan como CMNP en 2,000 CVRP. Las comparaciones se
hicieron entre las células del proestro basal contra las células de los siguientes 3 ó 4 proestros después de
recibir el inductor micronucleogénico y se evaluaron por ANOVA y prueba de ajuste Bonferroni. Las
características tomadas en cuenta para
considerar a una célula como normal a
b
fueron que presentara citoplasma con
perímetro intacto y homogéneo, con

bordes íntegros y definidos, núcleo entero
(Fig. 2a); y en el caso de las CMNP se
tomaron en cuenta las características de la
célula normal, además de que el MN
tuviera forma redonda, con ausencia de
Figura 2. Células del proestro.
empalme o puente con el núcleo (Fig.2b).
Tinción naranja de acridina /100x/ Mutagénesis, CIBO, IMSS
Tinción naranja de acridina /100x/ Mutagénesis, CIBO, IMSS
4. RESULTADOS
El promedio, desviación estándar y la significancia estadística de los valores de los diferentes grupos se
muestran en los Cuadros I y II. El promedio del valor basal de CMNP de la vagina de la rata es de
2.3±1.6/2,000 CVRP. Los grupos testigos negativos no mostraron diferencias significativas de un
proestro a otro (Cuadro I y II). Las CMNP de vagina de rata incrementaron significativamente cuando se
compararon los valores basales con los siguientes 3 ó 4 proestros posteriores a la administración de los
compuestos.
Cuadro I. CMNP por administración de COL ó CF.
CMNP / 2,000 células de proestro
Grupos
n
Basal
1er
2o
3er
4o
proestro proestro proestro proestro
1 (Testigo negativo; 200 l de agua)b
5
2 (0.129 mg de COL /kg )a
3 (0.258 mg de COL
5
/kg)a
5
4 (0.387 mg de COL /kg)a
5
Grupo 5 (0.129 mg de COL /kg) b
5
Grupo 6 (20 mg de CF /kg)a
Grupo 7 (50 mg de CF /kg)
5
a
5
Grupo 8 (80 mg de CF /kg)a
5
Grupo 9 (20 mg de CF/kg)b
5
2.0±2.4
2.4±0.5
1.8±1.0
3.2±2.5
2.4±1.5
3.8±1.9
2.2±1.4
2.0±1.2
3.0±1.7
2.0±1.8
3.0±1.8
2.4±0.5
NS
NS
NS
6.0±0.7
4.8±3.1
2.6±1.1
P < 0.05
NS
NS
8.4±3.5
6.4±3.5
5.6±3.2
P < 0.05
NS
NS
4.2±6.0
5.2±1.3
4.0±2.0
NS
NS
NS
7.8±1.9
11.4±5.1 11.8±5.9
NS
P < 0.05
P < 0.05
12.4±3.2
7.0±4.0
4.8±1.9
P < 0.05
NS
NS
14.6±1.6
7.8±3.2
4.8±1.9
P < 0.05
P < 0.05
NS
15.0±3.4
9.6±4.3
7.4±3.2
P < 0.05
P < 0.05
NS
11.4±4.5 15.2±3.3 11.0±2.5
P < 0.05
P < 0.05
P < 0.05
7.0±3.3
NS
7.2±2.1
NS
Los resultados están expresados como promedio±desviación estándar. CMNP: células micronucleados de proestro;
CMNP: células micronucleadas de proestro; NS: no significativo; n: tamaño de la muestra. aEstos grupos recibieron
diariamente durante 5 días la dosis correspondiente del compuesto, ajustada a un volumen final de 100 µl con agua
inyectable.
Cuadro II. CMNP por administración de 5-FU.
CMNP / 2,000 células de proestro
Grupos
n
Basal
1er
2o
3er
4o
proestro proestro proestro proestro
Grupo 10 (Testigo negativo; 100 l de
5
1.4±0.8
agua)a
Grupo 11 (2.5 mg de 5-FU)a
5
1.8±1.7
2.0±1.0
1.4±1.3
1.8±1.3
NS
NS
NS
9.0±5.4
18.6±3.6 10.2±2.2
P < 0.05
P < 0.05
P < 0.05
Los resultados están expresados como promedio±desviación estándar. CMNP: células micronucleados de proestro;
CMNP: células micronucleadas de proestro; NS: no significativo; n: tamaño de la muestra; 5-FU: 5-Fluorouracilo.
aEstos grupos recibieron diariamente durante 5 días la dosis correspondiente del compuesto, ajustada a un volumen
final de 100 µl con agua inyectable.
5. CONCLUSIONES
El conteo de CMNP de vagina de rata es una nueva alternativa, para el estudio de compuestos
genotóxicos que se apliquen por vía vaginal, sin requerir el sacrificio de los animales para obtener la
muestra.
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