UNIVERSIDAD DE PUERTO RICO- HUMACAO DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA BIOL 3013 Experiencia de Laboratorio: Macromoléculas: ácidos nucléicos y método de separación Adaptado y traducido por la Dra. Melissa Colón Cesario, UPRH 2009 de: “Exercise Seven: Separating Organic Compounds”, Biology Laboratory Manual, Vodopich & Moore, McGraw Hill, 2008. Objetivos: 1. Describir y utilizar procedimientos clásicos para aislar DNA. 2. Reconocer que la gel de electroforesis es una técnica utilizada para separar moléculas orgánicas. Introducción: Todo sistema vivo se compone de moléculas orgánicas que forman las estructuras principales de la célula. Las moléculas orgánicas de mayor abundancia en la célula son los hidratos de carbono, los lípidos, las proteínas y los ácidos nucléicos. En la unidad pasada utilizamos pruebas para detectar la presencia de los hidratos de carbono y los lípidos en diferentes soluciones. En esta unidad vamos a utilizar una prueba bioquímica para detectar la presencia de las proteínas en una solución y un procedimiento para aislar el DNA de las células. El DNA y el RNA son ácidos nucléicos compuestos por pequeñas unidades conocidas como nucleótidos. Los nucleótidos se caracterizan por estar compuestos de tres grupos: un azúcar (desoxirribosa o ribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada. Existen cuatro nucleótidos que componen la molécula del DNA: timina, citosina, guanina y adenina, los cuales varían en la base nitrogenada. Un nucleótido se une a otro nucleótido mediante un enlace fosfodiester, esta unión ocurre entre el grupo fosfato de un nucleótido y el del azúcar del nucleótido adyacente. Esta cadena larga de nucleótidos forma los ácidos nucléicos. Aunque el DNA y el RNA son ácidos nucléicos estructuralmente éstas moléculas difieren. La molécula de DNA se caracteriza por tener dos cadenas de nucleótidos que permanecen unidas por puentes de hidrógeno, mientras que la molécula de RNA se compone de una cadena sencilla de nucleótidos. Los nucleótidos de DNA están compuestos por una azúcar conocida como desoxirribosa, mientras que la molécula de RNA está compuesta por una ribosa. Además, la molécula de RNA carece de timina, la cual es sustituida por uracilo. Tanto la molécula de DNA como la de RNA son de gran importancia en los organismos vivos porque son las moléculas que están asociadas con la herencia. 1 Terminal 5’ Bases Nitrogenadas Pirimidinas 5’C 3’C Nucleósido Base Nitrogenada Citosina (C) Timina (T, en DNA) Uracilo (U, en RNA) Purinas Grupo Fosfato 5’C Azúcar (pentosa) Adenina (A) Guanina (G) (b) Nucleótido 3’C Azúcar Terminal 3’ (a) Ácido nucléico Desoxirribosa (en DNA) Ribosa (en RNA) (c) Nucleósido componentes: azúcar Extracción de DNA El siguiente procedimiento experimental es para aislar (extraer) DNA de las células de un organismo. Este método es una versión modificada del procedimiento que se utiliza en los laboratorios de biotecnología. El objetivo es extraer DNA del filtrado de una fruta o vegetal. Procedimiento para extraer DNA de una fresa: 1. Coloca en una bolsa zip-locked una fresa. Añade 6 mL de detergente de fregar o SDS/NaOH. Cuidadosamente remueve el aire de la bolsa y ciérrala apretadamente. 2. Suavemente, pero completamente, tritura la fresa de forma tal que no queden pedazos grandes (tipo puré). El filtrado de fruta se obtiene de la mezcla de la fruta con un detergente. El detergente emulsifica y forma complejos con los lípidos y las proteínas de la membrana plasmática precipitándolas fuera de la solución. El contenido celular, incluyendo el DNA, queda suspendido en la solución. La mezcla celular se purifica para producir un filtrado que contenga el DNA y proteínas adheridas. 3. Coloca el jugo de fresa y detergente en un filtro de café. Recoge el filtrado líquido en un beaker o tubo de ensayo limpio. No te preocupes si parte de los desechos de fresas caen en el filtrado. Presiona suavemente el filtro a la pared del tubo de ensayo para facilitar el flujo del jugo de fresa. a. Vas a obtener más o menos 8 mL del jugo de la fresa. b. El jugo de fresa contiene el DNA, pero no se puede observar porque está disuelto en el agua. 4. Cuidadosamente añade 2 mL de 100% alcohol etílico (EtOH) al jugo de fresa filtrado. Añade el EtOHl de forma tal que este baje por las paredes 2 del tubo de ensayo, se formará una capa de alcohol sobre el jugo de fresa. NO mezcle el alcohol con el jugo. a. En este punto se va a observar que se forma una interfase borrosa entre las capas del alcohol y el jugo de fresa. Este es el DNA que se está precipitando del jugo de fresa. El DNA es insoluble al alcohol. 5. Sin alterar las dos capas, sumerge una varilla fina de cristal dentro del jugo de fresa y alcohol. Con la varilla obtén la molécula de DNA (tiene forma de algodón) que se va a encontrar en la zona del EtOH. Preguntas: 1. ¿Cuál es la función del detergente en este protocolo de extracción de DNA? 2. ¿Qué sucedió con el jugo filtrado al añadir el EtOH 100%? 3. Cuál es la función del EtOH 100% en este protocolo de extracción de DNA? Separar moléculas orgánicas: Como podemos reconocer las células se componen de una mezcla de moléculas orgánicas (hidratos de carbono, proteínas, lípidos y ácidos nucléicos). Para poder caracterizar todas estas moléculas los científicos utilizan ciertos métodos para separar los compuestos de la célula. Entre los diferentes métodos que existen, la gel de electroforesis se utiliza para separar las moléculas de acuerdo a sus cargas, estructuras y tamaño. Las muestras (moléculas orgánicas) son ubicadas en los pozos que se encuentran en la gel (parecida al Jello). Luego a la gel se le aplica una corriente eléctrica que permite que las moléculas orgánicas se muevan fuera del pozo y atraviesen la gel. La velocidad, la dirección y la distancia de movimiento de cada molécula está asociado a su carga, tamaño y estructura. 3 Técnica Fuente de Según ilustrado en la figura, el aparato energía Mezcla de para una gel de electroforesis se moléculas ánodo + – cátodo de DNA de compone de una cámara de diferente electroforesis, una gel, un buffer (solución tamaños amortiguadora), las muestras y una fuente de energía. gelatina 1 La gel: consiste de agarosa (derivado de agar) disuelta en una Fuente de solución amortiguadora caliente. energía Cuando la solución se enfría esta – + se solidifica en una gel porosa que Moléculas grandes funciona como un cedazo. La gel se sumerge en una cámara que contiene electrodos y está llena de 2 Moléculas solución amortiguadora. pequeñas La solución amortiguadora conduce electricidad y controla el pH. El pH suele afectar la estabilidad y cargas de las muestras. Las muestras son una mezcla de moléculas (DNA o proteínas) ubicadas en los pozos de la gel y migran a lo largo de la gel durante la electroforesis. La fuente de energía provee la corriente que pasa a través de la gel. Las moléculas con cargas responden a la corriente migrando desde el pozo a lo largo de la gel. Las moléculas con cargas negativas migran hacia el electrodo positivo (el ánodo), mientras que las moléculas con cargas positivas migran hacia el electrodo negativo (el catión). Mientras más alto sea el voltage más rápido migran las moléculas. Las propiedades de cedazo de la gel afecta la velocidad de movimiento de las moléculas a través de la gel. Las moléculas pequeñas se mueven más facilmente por los poros de la gel que las moléculas grandes. Por tanto, moléculas pequeñas y compactas (esféricas) se mueven más rápido que las moléculas grandes. Si las moléculas tienen estructuras similares y el mismo peso, entonces la molécula con mayor carga se mueve más rápido. En la mesa de demostración usted podrá observar el equipo para una electroforesis. Aunque en esta experiencia no tendremos la oportunidad de llevar a cabo una electroforesis para la muestra de DNA obtenida, si tendremos la oportunidad de manejar una micropipeta digital y hacer un simulacro de cómo cargar unas muestras en una gel. 4 Analizar e interpretar una Gel de electroforesis Utiliza la siguiente situación para analizar los resultados representados en la caricatura, de una electroforesis. Situación: La hemoglobina que genera anemia (HbS) migra más lentamente al polo positivo que la hemoglobina normal (HbA). Esta condición se genera por una mutación en donde glutamato (polar, Polo hidrofílica) es sustituida por valina (no polar, Carril 1 Carril 2 Carril 3 hidrofóbica). pozos 1. ¿Cuál carril contiene solo a HbS, indicando que el individuo es HbS HbS? 2. ¿Cuál carril contiene solo a HbA, indicando que el individuo es HbA HbA? Polo + 3. ¿Cuál carril contiene ambos HbA y HbS, indicando que el individuo es HbA HbS? 4. Basado en la información obtenida y el resultado, ¿qué puede decir usted de los amino ácidos de valina y glutamato? 5. ¿Cuál característica o factor está determinando el movimiento de las moléculas HbA y HbS a través de la gelatina? 5 Separar moléculas orgánicas por un gel de electroforesis Procedimiento: 1. Obtén una cámara de electroforesis. Cubre los extremos del plato con las gomas apropiadas (en algunos casos puedes utiliza tape), según le demuestre el instructor. 2. Ubica el peine en el extremo y en el centro de la cama (según sea indicado). Va a observar que existe un espacio entre el peine y el plato. 3. Mezcla 0.8% (peso por volumen) de polvo de agarosa con el “buffer” (solución amortiguadora), suficiente volumen para llenar el plato del gel. Calienta la mezcla hasta que la agarosa se disuelva. 4. Cuando la solución de agarosa se enfríe (que usted pueda tocarlo) añade la solución al plato del gel. 5. Cuando la gel se solidifique, quita las gomas de los extremos. Este paso hay que hacerlo con delicadeza para que el gel no se rompa. Además, quita el peine del gel. Va a observar los pozos del gel. 6. Ubica el plato con el gel en el interior del aparato de electroforesis. 7. Añade el buffer al aparato de electroforesis, de forma tal que el gel quede sumergido en el buffer. 8. Usted tendrá cuatro muestras: a. Muestra 1: Bromophenol blue (peso molecular = 670 g mole-1) b. Muestra 2: Methylene blue (peso molecular = 320 g mole-1) c. Muestra 1: Orange G (peso molecular = 452 g mole-1) d. Muestra 1: Xylene cyanol (peso molecular = 555 g mole-1) 9. Utilizando una micropipeta carga cada muestra en cada pozo del gel. Asegúrate que la solución esté en la punta de la pipeta (de esta forma la solución queda en el interior del pozo y no se forma burbujas dentro del pozo). a. Ubica la punta de la pipeta en el pozo sin tocar el fondo. No absorbas el buffer. b. Suavemente libera el contenido de la pipeta en el pozo del gel. Remueve la pipeta, sin absorber el material del pozo o el buffer. 10. Haz el procedimiento 9 para las demás muestras. Recuerda cambiar de tip para cada muestra. Utiliza los subsiguientes pozos para las diferentes muestras. 11. Cuidadosamente cubre la cámara de electroforesis con la tapa. Conecta la cámara con la fuente de energía. La conección roja es la carga positiva y la carga negra es la carga negativa. 12. Enciende la energia hasta que el voltage llegue a 90 V. Rápidamente se van a formar burbujas en el buffer cerca de los electrodos. 13. Después de 30 min, apaga la fuente de energía, desconecta la cámara de electroforesis. Suavemente remueve y dibuje sus resultados. 6 Preguntas: 1. Utilizando sus resultados, ¿Cuá es la carga del bromophenol blue, del orange G y el azul de metileno? Explique el resultado 2. ¿El orange G, el bromophenol blue se mueven a la misma distancia? ¿Por qué o por qué no? Referencias: Audesirk T, Audesirk, G & Byers B.E. Capítulo 4: Moléculas biológicas. Biología: La vida en la Tierra. (8va ed.). Pearson Prentice Hall. Campbell, Reece, Urry, Cain, Wasserman, Minorsky & Jackson. (2008) Chapter 4: Carbon and Molecular Diversity. Biology. 8va Ed. Pearson Benjamin Cummings, USA. Raven, Johnson, Losos, Mason & Singer. (2008) Biology. 8va Ed. McGraw Hill, USA 7