Genomica de los hongos formadores de micorrizas

GENOMICA DE LOS HONGOS FORMADORES DE MICORRIZA
La importancia de las micorrizas
Aproximadamente cien mil especies de hongos han sido descritas hasta ahora, y aproximadamente el 10% de
estas obtienen nutrientes al vivir en una estrecha asociación con otros organismos tales como plantas,
animales y humanos. Muchas infecciones por hongos son parasíticas y pueden causar enfermedades severas
mientras que otras por el contrario son simbiosis mutualistas beneficiosas para el organismo huésped. En este
último grupo se encuentran las infecciones causadas por hongos micorrícicos que infectan la raíz de muchas
especies forestales y de importancia económica (Tunlid & Talbot 2002).
Nuestra comprensión de hongos parasíticos y simbiontes infectan sus huéspedes, incluyendo los organismos
del reconocimiento del huésped, desarrollo de estructuras de infección, control de reacciones de defensa del
huésped y penetración − colonización de los tejidos es limitado (Martin 2001; Tunlid & Talbot 2002).
La simbiosis entre hongos pertenecientes a Glomeromycota y plantas involucra cerca de dos tercios de todas
las especies, lo que le confiere tiene una importancia ecologica muy grande, entre estos se encuentra Glomus
intraradices (endomicorriza) que se encuentra en ecosistemas temperados y tropicales. Existen cerca de 150
especies descritas entre los Glomeromycota y cerca de 200000 especies vegetales involucradas en la
simbiosis, los hongos pertenecientes a este orden presentan características muy particulares como el ser
cenocíticos, multinucleados, asexuales y simbiontes obligados no específicos (Martin et al 2004).
Las micorrizas − características génicas y adelantos
Desde que se completó la secuenciación del genoma Saccharomyces cerevisiae en 1996, el proceso de la
secuenciación de otros genomas fúngicos ah sido limitado. A comienzos del 2002 se publicaron las
anotaciones del genoma de la levadura Schizosaccharomyces pombe y la terminación de otros proyectos de
secuenciación de hongos esta por completarse. Entre esas especies se cuentan el hongo filamentoso
Neurospora crassa , los patogenos humanos Candida albicans , Cryptococcus neoformans y el fitopatógeno
Magnaporthe grisiae. Las colecciones de información de secuencia genómica y de ESTs de otros hongos
simbióticos y parásitos que infectan humanos, otros animales y plantas está en aumento (Tunlid & Talbot
2002).
Comparados con el tamaño genómico de otros eucariotas tales como animales y plantas, los genomas de los
hongos son pequeños. S. cerevisiae y S. pombe tiene tamaños genómicos de 13.7 Mb y 13.8 Mb
respectivamente, mientras que como excepción se encuentra Ashbya gossypii con 8.9 Mb. Otros hongos
basidiomicetes y ascomicetes filamentosos tienen genomas de entre 13 − 42 Mb. A partir de esto se
puede decir que los genomas de los hongos son aproximadamente un tercio de Caenorhabditis elegans y
Arabidopsis thaliana, y un orden de magnitud menos que el del arroz (Oriza Sativa). Además los genomas de
los hongos tiene una mayor densidad genica y una baja proporción de secuencias repetitivas, así por ejemplo,
S. cerevisiae presenta un gen por cada 2 Kb, mientras que Neurospora crassa, cuyo genoma es mayor
contiene un gen por cada 4 Kb. La densidad génica de M. grisiae esta estimada en uno por cada 4.2 Kb, y para
el hongo ectomicorrícico Paxillus involutus, uno cada 2.8 Kb (Tunlid & Talbot 2002).
Los genomas de los hongos formadores de micorriza arbuscular tienen tamaños y estructuras inusuales. El
tamaño estimado para sus genomas es de 100 − 1000 Mb, lo cual es significativamente mas grande
comparado con los de ascomicetes y basidiomicetes. La proporción de G − C (Guanina y Citosina) es
significativamente mas bajo (30 − 35%) que le rango de (40 − 56 %) reportado para otros hongos. Comparado
con otros hongos los genomas de los glomaleanos tienen una mayor proporción de citosina metilada (mC), un
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hecho que explica la evolución de los grandes genomas ricos en adenina y timina de estos hongos (Tunlid &
Talbot 2002).
La divergencia nucleotídica puede reducir los eventos de recombinación entre repeticiones, y por lo tanto
lleva a la acumulación de DNA que no codifica en los genomas de los hongos de micorriza arbuscular (Tunlid
&Talbot 2002).
Otra característica única de los hongos de micorriza arbuscular es la presencia de esporas unicelulares
vegetativas grandes que contienen de varios cientos a miles de núcleos. Estos hongos parecen haber sido
asexuales por los últimos 4000 millones de años, en la ausencia de recombinación, se ha propuesto que los
hongos de micorriza arbuscular evolucionaron hasta desarrollar la capacidad de contener muchos genomas
genéticamente divergentes. Al utilizar hibridización fluorescente in situ (FISH) en los núcleos provenientes de
esporas de Scutellospora castanea se demostró que una población de núcleos genéticamente diferentes
coexiste en un hongo individual (Tunlid &Talbot 2002).
Además, empleando análisis filogenéticos se ha mostrado que la variación genética que ocurre dentro de un
individuo de micorriza arbuscular se ha desarrollado a traves de acumulación de mutaciones en un genoma
esencialmente clonal con algunos eventos de recombinaciones poco frecuentes (Tunlid &Talbot 2002).
Perspectivas
En los próximos años, numerosos genomas fúngicos se han programado para su secuenciación, debido
principalmente al Fungal Genome Initiative del Whitehead Institute. Esta iniciativa ha propuesto secuenciar
hasta 44 genomas que incluyen modelos bien estudiados, importantes para la salud humana, fitopatógenos y
especies mutualistas (Paxillus involutus y Tuber borchii). De cualquier manera, no se han secuenciado
genomas micorrícicos y ninguno de ellos esta en la lista final del instituto Whitehead, por lo tanto la
resolución de secuenciar los hongos Glomus intraradices y Laccaria bicolor, asociados al árbol Populus
trichocarpa (Martin et al 2004) reviste de gran importancia por consistir en el primer proyecto de
secuenciación a gran escala de micorrizas.
Los árboles en general son organismos experimentales difíciles debido a su gran tamaño y tiempo de
generación, por ello se ha centrado la atención en especies comerciales como Populus trichocarpa; durante la
ultima década Populus se ha convertido en la planta leñosa modelo debido a su tamaño genómico
relativamente modesto, recursos genéticos extensos, rápido crecimiento inicial, facilidad de propagación
clonal y protocolos de transformación rutinarios (Martin et al 2004).
Por otro lado se encuentra Laccaria bicolor perteneciente al orden Tricholomataceae, que se caracteriza por
cambiar entre saprofitismo y ectomicorricismo. Este hongo es importante porque sirve como modelo de
evolución de especificidad ecológica y de hospedero, porque se asocia con árboles de ecosistemas
temperados.
Metodologías para el estudio de los genes fúngicos
La mayor dificultad para el análisis de la expresión génica de hongos de micorriza arbuscular es el
crecimiento simbiótico del hongo, lo cual limita la cantidad de material disponible que solo se puede aislar de
hifas e hifas extraradicales; en adición, la cantidad de material fúngico dentro de la raíz es muy poco
comparado con otras interacciones planta−microorganismo de manera que solo 1% del mRNA extraído de
raíces altamente colonizadas genera que el descubrimiento de genes de reducida expresión sea muy bajo. Con
la ayuda de la tecnología del PCR muchas de las limitaciones se han superado de manera que a partir de pocas
cantidades de mRNA se han construido librerías de cDNA (Franken & Requena 2001; Clapp et al 2002).
La identificación de los genes de micorriza arbuscular fue aproximada por medio de la transformación fúngica
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en los primeros intentos de aislamiento de genes por Forbes en 1998, teniendo en cuenta que en comparación
con otros hongos filamentosos, la espora contiene más de 2000 núcleos y por lo tanto la deleción de los genes
de los genes de interés no es factible (Franken & Requena 2001).
Las secuencias reportadas en bases de datos como BLASTX y BLASTN entre otras, han surgido a partir del
aislamiento y caracterización aleatoria de DNA aislado de micelio extraradical (el cual solo esta contaminado
por genes mitocondriales y nucleares si es que se empleará el rDNA) creando ESTs (Peter et al 2003). Sin
embargo, un gran conjunto de datos se necesita analizar para poder señalar diferencias estadísticamente
significativas en el nivel de expresión a partir de la frecuencia de la secuencia de los ESTs (Tunlid &Talbot
2002). La selección diferencial es otro método empleado basado en las diferencias de concentración de
especies de ácidos nucleicos entre dos o mas muestras y esta enfocado a aislar mRNAs transcritos
diferencialmente, con esta aproximación se han aislado nuevos genes vegetales y de micorriza arbuscular
(Martin et al 2004).
Con los adelantos en biología molecular de la ultima década se ha logrado identificar cualquier micorriza
potencialmente hasta especie por medio de PCR−RFLP de los espaciadores internos transcritos del DNA
ribosomal nuclear o por secuenciación de DNA;
Resultados a partir de la información que se tiene
Una observación importante a partir de las comparaciones de las secuencias genómicas de los hongos y otros
organismo es que una proporción significativa de las secuencias no exhibe similaridad con las proteínas de
función conocida presentes en la bases de datos. Por ejemplo, 40−60% de las unisecuencias de ESTs de
patógenos de plantas fúngicos muestran poca o ninguna similaridad con proteínas de función conocida; tales
genes se han llamado huérfanos (ORFs sin ninguna función conocida) se han encintrado frecuentemente en
los genomas de organismos eucariotas modelo. Por ejemplo, se ha calculado que un tercio de todas las
regiones codificadoras de proteínas de S. cerevisiae son huérfanos, aunque estos probablemente representan
los límites de la investigación empírica de la función celular, desde un punto de vista evolutivo existen dos
explicaciones mutuamente no exclusivas para la alta proporción de huérfanos en un organismo: i) pueden
representar genes cuya distribución filogenético esta restringida a ciertos linajes evolutivos, y ii) los genes
huérfanos pueden representar genes que rápidamente divergen entre especies cercanamente relacionadas. Las
proteínas codificadas por tales genes pueden no estar presionados por la evolución de su secuencia o presentar
selección direccional, mientras que sus estructura y función puede estar conservada entre organismos distantes
(Tunlid &Talbot 2002).
A grandes rasgos, la tasa de reorganización genómica parece ser mas alta en eucariotas que en procariotas,
pero parece actuar a una escala mas local que a menudo involucra genes individuales, por lo tanto las
translocaciones pueden ser mas raros en los hongos que en bacterias (Tunlid &Talbot 2002).
La filogenia a partir de datos moleculares ha mostrado que los hongos parásitos y simbióticos se encuentran
en muchos grupos taxonómicos, lo cual sugiere que estos estilos de vida han aparecido repetidamente dentro
del reino. A nivel genómico, hay básicamente tres mecanismos compatibles que pueden explicar la múltiple
emergencia y adaptaciones para la simbiosis y parasitismo. En primer lugar, el parasitismo y la simbiosis
están asociados con la presencia de genes nuevos, tales genes pueden tener un papel específico durante la
infección del hospedero y pueden ser adquiridos por duplicación génica o por transmisión horizontal.
Segundo, las adaptaciones para los hábitos simbióticos y parasíticos pueden resultar de diferencias en la
regulación de la expresión génica. Tercero, el parasitismo y la simbiosis están asociados a la perdida de genes
y la deleción (Tunlid &Talbot 2002).
Otros casos probables de transferencia horizontal de genes en hongos involucran elementos genéticos egoístas
no infectivos como plasmados, intrones y transposones; en adición a esto, la transferencia de genes a través de
mecanismos similares a la transformación de genes han sido reportados para estudiasen cultivo y suelo estéril.
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Las bases de la mayoría de estudios hasta la fecha indican que la historia evolutiva de un gen difiere de los
genes ancestrales (verticalmente transmitido); sin embargo, en muchos casos existen explicaciones
alternativas que se ajustan a las observaciones (Tunlid &Talbot 2002).
La disponibilidad de secuencias genómicas ha hecho posible el construir microarreglos de DNA para el
análisis simultaneo de los niveles de expresión de grandes grupos de genes en muchas especies de patógenos y
simbiontes fúngicos. El análisis proteómico ofrece la posibilidad de identificar directamente la abundancia de
las proteínas, su localización, interacciones y modificaciones post transcripcionales, aunque una cantidad
modesta de investigaciones concernientes a las proteínas fúngicas se debe su difícil diferenciación de las
vegetales. Actualmente se han usado para el análisis de la expresión de proteínas en las paredes celulares de
hongos parásitos, técnicas como el fraccionamiento subcelular con el cual se enriquecen los extractos
vegetales con proteínas especificas de interés (Cánovas et al 2004; Harrier 2001; Tunlid &Talbot 2002).
Sin embargo, el estudiar los transcriptomas que interaccionan durante una simbiosis nos dicen que genes están
siendo transcritos pero no si estos son traducidos a proteína o si los genes constitutivos expresados son
modificados post transcripcionalmente de manera diferencial Birch & Kamoun 2000; Batel−Corre et al 2004)
Tecnologías de base molecular han sido particularmente exitosas para estudiar secuencias de DNA ribosomal
que han arrojado como resultados una gran variación genética dentro y entre las especies de micorriza
arbuscular. El aislamiento y estudio de estas secuencias ha servido para la caracterización molecular de los
Glomales, la detección de hongos de micorriza arbuscular en plantas hospedero y dentro de ecosistemas del
suelo. Entre las técnicas alternativas de estudio de estos hongos están los RAPDs y la amplificación de
secuencias satélite. El estudio funcional de los genes no ribosomales se realiza mediante aproximaciones
definidas (targeted molecular approaches) y no definidas (untargeted molecular approaches). La primera
involucra la investigación de moléculas con secuencias génicas conocidas y/o proteínas con función conocida.
La segunda se refiere a la investigación con base en la presencia y/o ausencia de productos genicos no
conocidos de los cuales no es necesario conocer su secuencia (Harrier 2001).
El aislamiento y estudio de los elementos reguladores de los genes de micorriza arbuscular es necesario par el
entendimiento de los factores que controlan la expresión génica, para ello se deben construir librerías
genómicas libres de procariotas para el aislamiento de estos elementos como la región promotora PGK aislada
recientemente (Martin et al 2004).
Perspectivas
La genómica funcional deriva de la disponibilidad de la información de la secuencia de un organismo, de
manera que podría ser definida como la aplicación de los métodos de secuenciación automatizada a la biología
permitiendo el análisis funcional del genoma, proteoma y metaboloma de un organismo (Talbot 2003).
Actualmente no tenemos conocimiento acerca de los mecanismos moleculares que gobiernan los patrones
titulares para la simbiosis ni las señales específicas que coordinan el desarrollo conjunto de micelio y raíz, ni
de las que posibilitan la continuidad de la asociación. Sin embargo, los análisis de la expresión diferencial por
medio de microarreglos (microarrays) y de la subsecuente acumulación de información génica proveniente de
la secuenciación nos posibilitará la asignación de funciones a las porciones de DNA de manera que
comprendamos paso a paso los eventos de la simbiosis y una visión a nivel ecológico de los factores
ambientales que influencian la trascripción diferencial de genes (Martin 2004).
Literatura citada
TUNLID, A. & TALBOT, N. J. (2002) Genomics of parasitic and symbiotic fungi. Current Opinion in
Microbiology 5: 513−519
BESTEL−CORRE, G., DUMAS−GAUDOT, E. & GIANINAZZI, S. (2004) Proteomics as a tool to monitor
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plant−microbe endosymbiosis in the rhizosphere. Mycorrhiza 14: 1−10
MARTIN, F. (2001) Frontiers in molecular mycorrhizal research−genes, loci, dots and spins. New Phytologist
150: 499−507
MELIN, P. (2004) Proteomics as a tool to study microbial interactions. Current Proteomics 1: 27−34
CLAPP, J. P., RODRIGUEZ, A. & DODD, J. C. (2002) Glomales rRNA diversity−all that glistens is not
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PETER, M. et al (2003) Analysis of expressed sequence tags from the ectomycorrhizal basidiomycetes
Laccaria bicolor and Pisolithus microcarpus. New Phytologist 159: 117−129
FRANKEN, P. & REQUENA, N. (2001) Analysis of gene expression in arbuscular mycorrhizas: new
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HARRIER, L. A. (2001) The arbuscular mycorrhizal symbiosis: a molecular review of the fungal dimension.
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TALBOT, N. J. (2003) Functional genomics of plant−pathogen interactions. New Phytologist 159: 1−10
MARTIN, F. et al (2004) Symbiotic sequencing for the Populus mesocosm. New Phytologist 161: 330−335
CÁNOVAS, F. M. et al (2004) Plant proteome analysis. Proteomics 4: 285−298
BIRCH, P. & KAMOUN, S. (2000) Studying interaction transcriptomes: coordinated analyses of gene
expression during plant−microorganism interactions. New Technologies for life sciences a trends guide
publicado en linea
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