BCIEQ-T-0082 Montero Cabello Eileen Astrid.pdf
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0 UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS MODALIDAD SISTEMATIZACIÓN TEMA: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS EN MOLUSCOS BIVALVOS CRUDOS QUE SE EXPENDEN EN EL MERCADO MUNICIPAL PEDRO PABLO GÓMEZ TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR AL TÍTULO DE QUÍMICA Y FARMACÉUTICA AUTOR: MONTERO CABELLO EILEEN ASTRID TUTOR ACADÉMICO: Q.F. ARTURO JOSÉ LANDIVAR MOREIRA GUAYAQUIL – ECUADOR 2015 ii CERTIFICADO DEL TRIBUNAL Acta de registro de la Sustentación Final El tribunal de Sustentación del Trabajo de titulación de la Srta. EILEEN ASTRID MONTERO CABELLO, después de ser examinada en su presentación, memoria científica y de defensa oral, da por aprobado el Trabajo de Titulación. __________________________________ Q.F HÉCTOR NÚÑEZ ARANDA. MSc DECANO – PRESIDENTE DEL TRIBUNAL _______________________________ ____________________________ Q.F. CELESTE CARRILLO TOMALA ING. RAÚL DÍAZ TORRES Ph D. MIEMBRO DEL TRIBUNAL MIEMBRO DEL TRIBUNAL ______________________________ ING. NANCY VIVAR CÁCERES SECRETARIA ENCARGADA iii CERTIFICADO DEL TUTOR En calidad de tutor del trabajo de titulación, yo Q.F. Arturo José Landivar Moreira, Certifico: que he asesorado, guiado y revisado el trabajo de titulación en la modalidad de sistematización, cuyo título es “ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS EN MOLUSCOS BIVALVOS CRUDOS QUE SE EXPENDEN EN EL MERCADO MUNICIPAL PEDRO PABLO GÓMEZ”, presentado por la Srita. Eileen Astrid Montero Cabello, con cédula de ciudadanía # 0930848346, previo a la obtención del título de Química y Farmacéutica. Este trabajo ha sido aprobado en su totalidad y se adjunta el informe de Antiplagio del programa URKUND. Lo certifico. ______________________________ Q.F. ARTURO JOSÉ LANDIVAR MOREIRA TUTOR DE TESIS Guayaquil, Marzo del 2015 iv CERTIFICADO DEL TUTOR INFORME DE ANTI-PLAGIO DEL PROGRAMA URKUND. Yo Q.F. Arturo José Landivar Moreira, tutor de la tesis: “ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS EN MOLUSCOS BIVALVOS CRUDOS QUE SE EXPENDEN EN EL MERCADO MUNICIPAL PEDRO PABLO GÓMEZ”, presentado por la Srita. Eileen Astrid Montero Cabello, con cédula de ciudadanía # 0930848346, certifico que dicho proyecto de titulación fue evaluado por el programa Anti-plagio URKUND demostrando un porcentaje de similitud del 7% sin presentar ninguna otra observación. Es todo en cuanto debo agregar en honor a la verdad. ___________________________ Q.F. ARTURO JOSÉ LANDIVAR MOREIRA TUTOR DE TESIS Guayaquil, Marzo del 2015 v CARTA DE AUTORÍA DEL TRABAJO DE TITULACIÓN. Yo, EILEEN ASTRID MONTERO CABELLO, autora de este trabajo “ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS EN MOLUSCOS BIVALVOS CRUDOS QUE SE EXPENDEN EN EL MERCADO MUNICIPAL PEDRO PABLO GÓMEZ declaro ante las autoridades de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil, que la responsabilidad del contenido de este TRABAJO DE TITULACIÓN, me corresponde exclusivamente; y el patrimonio intelectual de la misma a la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil. Declaro también que todo el material escrito me pertenece, salvo el que está debidamente referenciado en el texto. Además ratifico que este trabajo no ha sido parcial ni totalmente presentado para la obtención de un título, ni en la universidad nacional, ni en una extranjera. _____________________________ Eileen Astrid Montero Cabello CC: 0930848346 vi DEDICATORIA Dedico este esfuerzo a mi amado abuelo Prospero Montero Carpio, por la gran labor realizada en su vida terrenal, y el amor incondicional que brindo a su familia, siendo una personal invaluable para mí. vii AGRADECIMIENTO Agradezco a mis padres, el Sr. Marcos Montero Carpio y la Sra. Elsie Cabello Morante, haciendo honor al esfuerzo y sacrificio entregado para mi superación en la vida profesional y al infinito amor que me brindan día a día, siendo las bases fundamentales que guían mí camino en los logros alcanzados a lo largo de mi vida. viii ÍNDICE GENERAL CONTENIDO Pág. CERTIFICADO DEL TRIBUNAL…………………………..…………………….. ii CERTIFICADO DEL TUTOR…...…..…………………………………………….. iii INFORME DE ANTI-PLAGIO DEL PROGRAMA URKUND……….………….. iv CARTA DE AUTORÍA DEL TRABAJO DE TITULACIÓN.......................... v DEDICATORIA…………………………………………….…………………. vi AGRADECIMIENTO………………………………………………………… vii ÍNDICE GENERAL………………………………………………………… viii ÍNDICE DE TABLAS………………..……………...……………………….. x RESUMEN…………………...………………………………………………. xi ABSTRACT……………………………………………………………………… xii 1. INTRODUCCIÓN…………………………………….……………………….. 1 2. CAPÍTULO I: 2.1. PLANTEAMIENTO DE LA EXPERIENCIA……………….…...….......... 2 2.2. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………. 3 2.3. OBJETIVOS……………………………………………………………… 2.3.1. OBJETIVO GENERAL…………………………………………..………… 4 4 2.3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS……………………...………………………… 4 2.4. HIPÓTESIS…………………………………………………………...………. 5 2.5. VARIABLES…………………………………………………………………… 6 3. CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO……………………………………………………………... 7 - 17 ix 4. CAPÍTULO III: METODOLOGÍA 4.1. ENFOQUE METODOLÓGICO…………………………………………... 18 4.2. LUGAR DE LA EXPERIENCIA………………………………………….….18 4.3. UNIVERSO …………………………………………………………………..18 4.4. MUESTRA…………………………………………………………………….18 4.5. TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS…………….……………………….. 4.6. RECURSOS…………………………………………………………………. 19 19 4.6.1. HUMANOS ……………………………………………………………..…….19 4.6.2. MATERIALES.………………………………………………………..... 19 - 20 5. CAPÍTULO IV: LA EXPERIENCIA 5.1. CONTEXTO DE LA EXPERIENCIA …………………………………. 21 - 22 5.2. ACTORES INVOLUCRADOS………………………………………….…... 22 5.3. DATOS ESTADÍSTICOS………………………………………….….. 22 - 25 5.4. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS …......…… 26 5.5. COMPROBACIÓN DE LA HIPÓTESIS…………………………….……... 26 6. CAPÍTULO V: PRINCIPALES LOGROS DE APRENDIZAJE 6.1. LECCIONES APRENDIDAS DE LA EXPERIENCIA, LO POSITIVO Y NEGATIVO ………………………………………………………………..… 27 6.2. PRODUCTOS GENERADOS POR LA EXPERIENCIA………….……… 27 6.3. METAS ALCANZADAS POR LA EXPERIENCIA………………….…….. 27 6.4. IMPACTOS DE LA EXPERIENCIA ………………………………….……. 28 6.5. PROYECCIÓN DE LA EXPERIENCIA ……………………………….…... 28 6.6. ELEMENTOS DE RIESGO EN LA EXPERIENCIA………………….…... 28 7. CAPÍTULO VI 7.1. CONCLUSIONES………………………….……………………………….. 29 7.2. RECOMENDACIONES ……………………….……………………….…… 30 7.3. BIBLIOGRAFÍA …………………………..………………………….… 31 - 33 7.4. ANEXOS. …………………………………………………………….…. 34 - 41 x ÍNDICE DE TABLAS CONTENIDO Pág. Tabla 1: Número de enfermedades pronosticadas …………………………………………. 8 Tabla 2: Propiedades de Placas Compact Dry…………………………………… 14 Tabla 3: Datos Estadísticos Crecimiento de colonias azules – verdosas…………………………………. 23 - 25 xi UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL UNIDAD DE TRABAJOS DE TITULACIÓN (SISTEMATIZACIÓN) TEMA.ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS EN MOLUSCOS BIVALVOS CRUDOS QUE SE EXPENDEN EN EL MERCADO MUNICIPAL PEDRO PABLO GÓMEZ RESUMEN El propósito del presente proyecto se basa en destacar la importancia que brinda la aplicación de buenas prácticas de almacenamiento en los alimentos, enfocado específicamente en moluscos bivalvos crudos expendidos en 5 locales del mercado municipal Pedro Pablo Gómez, realizando un análisis microbiológico en 25 muestras por el método Compact Dry, en el laboratorio de Aseguramiento de Calidad – Pacific Bottling Company, ubicado en el Parque Industrial el Sauce Km 11 ½ Vía Daule, del 26 de Febrero al 04 de Marzo del 2015, para investigar la presunta presencia de V. parahaemolyticus, agente causal de enfermedades gastrointestinales al ser ingerido de una manera inadecuada mediante estos moluscos, aportando un análisis explicativo de porqué las personas que consumen este tipo de producto marino pueden padecer una enfermedad entérica y analizar qué factores pueden alterar la calidad de los mismos. PALABRAS CLAVES: Vibrio parahaemolyticus, gastrointestinales, moluscos bivalvos, ingesta. enfermedades xii UNIVERSITY OF GUAYAQUIL WORK UNIT TITLE (SYSTEMATIC) MICROBIOLOGICAL ANALYSIS OF VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS IN BIVALVE SHELLFISH THAT ARE SOLD RAW IN THE MUNICIPAL MARKET PEDRO PABLO GOMEZ ABSTRACT The purpose of this project is based on the importance afforded by the application of good practices in food storage, specifically focused on raw bivalve molluscs expended in local municipal market Pedro Pablo Gómez, performing microbiological testing laboratory Quality Assurance - Pacific Bottling Company, located in the Industrial Park Willow Road Km 11 ½ Duale, from February 26 to March 4, 2015, analyzing 25 samples to investigate the alleged presence of V. parahaemolyticus, causal agent of gastrointestinal illness when ingested inappropriately using these molluscs, providing an explanatory analysis of why people who use this type of marine product may suffer an enteric disease and analyze what factors may alter the quality of them. KEYWORDS: Vibrio parahaemolyticus, gastrointestinal diseases, bivalve molluscs intake. 1 1. INTRODUCCIÓN Vibrio parahaemolyticus es una especie bacteriana que puede ser un patógeno importante en humanos, pues se considera el causante principal de infecciones gastrointestinales tras el consumo de moluscos crudos o poco cocinados. Las enfermedades entéricas van de la mano con los malos hábitos alimenticios de las personas y la falta de conocimiento de los expendedores para almacenar el producto, lo cual afectan en un alto porcentaje al crecimiento de la bacteria. Debido a esta realidad, se motiva a analizar la problemática del proyecto, planteando objetivos específicos, por los cuales se procedió a la investigación de la presencia presuntiva de V. parahaemolyticus en las muestras analizadas del Mercado Municipal “Pedro Pablo Gómez”, así como destacar cuáles son los factores que pueden provocar su desarrollo. El trabajo se divide en seis capítulos: Capítulo I: El problema Capítulo II: Marco teórico Capítulo III: Metodología Capítulo IV: Experiencia Capítulo V: Factores de riesgos positivos y negativos Capítulo VI: Conclusión y recomendación 2 2. CAPÍTULO I: 2.1. PLANTEAMIENTO DE LA EXPERIENCIA Con el objetivo de conocer en qué forma los moluscos bivalvos constituyen un vehículo de transmisión de enfermedades gastrointestinales, producidas por la presencia de V. parahaemolyticus, se realizó un estudio preliminar en el Mercado Municipal Pedro Pablo Gómez de la ciudad de Guayaquil; ya que en estos lugares populosos se capta un mayor interés de análisis pues posee una población considerable de consumidores, que hacen de este tipo de producto marino parte de su alimentación diaria. La problemática se enfoca en que muchas veces por falta de información de parte de los expendedores como de los consumidores, se desconocen las condiciones adecuadas en que se debe almacenar, y consumir el producto; pues al no mantener la cadena de frío en su almacenamiento, provee el medio propicio para el desarrollo de la bacteria, debido a que el V. parahaemolyticus se reproduce en ambientes cálidos, a temperaturas entre 20°C y 30°C., al aumentar la concentración de esta bacteria presente en los moluscos produce un mayor índice de contaminación, pues se considera que la enfermedad se puede producir con una ingesta de 1.000.000 de vibriones viables. El debido almacenamiento va de la mano con el proceso de preparación del molusco, ya que el V. parahaemolyticus muere al alcanzar una temperatura de cocción de 70° C por 15 minutos, lo cual muchas veces no se cumple, pues la mayoría de las personas prefieren ingerir el producto curtido con limón. 3 2.2. JUSTIFICACIÓN En la República del Ecuador uno de los problemas de salud más importantes lo constituyen los padecimientos gastrointestinales, en los cuales el V. parahaemolyticus ocupa un lugar relevante, por este motivo se realizó un análisis microbiológico a 25 muestras de moluscos bivalvos crudos, expendidos en 5 locales diferentes del mercado Municipal Pedro Pablo Gómez, para investigar la presencia presuntiva de V. parahaemolyticus, mediante un análisis microbiológico realizado en el Laboratorio de Aseguramiento de Calidad – Pacific Bottling Company, mediante la metodología Compact Dry Vp, obteniendo crecimiento de colonias verdes en 20 muestras; resultado presuntivo que indica una posible contaminación por V. parahaemolyticus, en el que se destaca la incorrecta conservación y/o comercialización del producto; siendo un dato de gran interés, pues todos los locales expenden el molusco a los vendedores de comida del mismo mercado, por lo que se expone a un mayor riesgo de intoxicación a la población que consume estos mariscos, ya que algunos platos preparados en ellos no pasan por los procesos de cocción adecuados, como son los ceviches curtidos con limón. 4 2.3. OBJETIVOS 2.3.1. OBJETIVO GENERAL Investigar la presencia presuntiva de V. parahaemolyticus en moluscos bivalvos crudos expendidos en el mercado municipal Pedro Pablo Gómez. 2.3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 2.3.2.1. Analizar los factores que pueden provocar un mayor desarrollo de V. parahaemolyticus, a los moluscos expendidos en los locales del mercado. 2.3.2.2. Proponer cuáles son las medidas correctivas para un menor desarrollo de V. parahaemolyticus en los moluscos bivalvos. 5 2.4. HIPÓTESIS Se presume que el consumidor de moluscos bivalvos crudos expendidos en el mercado municipal Pedro Pablo Gómez, se encuentra expuesto a ingerir V. parahaemolyticus y a adquirir enfermedades gastrointestinales. 6 2.5. VARIABLES 2.5.1. Independiente: Moluscos bivalvos crudos 2.5.2. Dependiente: V. parahaemolyticus. 7 3. CAPITULO II 3.1. MARCO TEÓRICO. 3.1.1. Antecedentes Se ha reconocido que el V. parahaemolyticus es el agente principal en la adquisición de gastroenteritis transmitida por productos marinos, asociándolos casi exclusivamente al consumo de estos productos insuficientemente cocidos, o contaminados después de la cocción. En Australia, en 1990 y 1992, hubo dos brotes de gastroenteritis causados por V. parahaemolyticus en camarones congelados y cocidos importados de Indonesia y también se produjo una muerte en 1992 asociada al consumo de ostras. (Kraa, 1995) En los Estados Unidos de América, durante 1997 y 1998, se produjeron más de 700 casos de enfermedades debidas a V. parahaemolyticus, la mayoría de las cuales se asociaron con el consumo de ostras crudas. (González, 2000). En el 2002, la FAO y la OMS decidieron realizar una evaluación de riesgos sobre el consumo de ostras crudas en varios países distintos, además de generar una estimación del número de enfermedades anuales. La evaluación de riesgos abarca el consumo de ostras crudas en cinco países: Nueva Zelandia, el Japón, el Canadá, Australia y los Estados Unidos de América. (Huertas, 2013) 8 Pronósticos preliminares de enfermedades causadas por V. parahaemolyticus asociadas con el consumo de ostras. Tabla 1: Número de enfermedades pronosticadas Número de enfermedades pronosticadas País (Enero-Mar) (Abril-Jun) 4 1 Solo Abril 0 196 201 Australia 157 28 10 33 228 Nueva Zelanda 13 17 0 5 35 Canadá 0 1 7 0 8 Estados Unidos 40 1587 3881 376 5884 Japón (Jul-Sep) (Oct-Dic) Total Fuente: (FAO, 2002) La Consulta de expertos determinó que un componente fundamental en los brotes entéricos, era la temperatura cálida del agua; que es similar en varios países con importantes industrias ostrícolas, también se consideró que se deben mejorar todas las aplicaciones de las fases de recolección, post-recolección, almacenamiento y consumo, para disminuir los brotes entéricos. (FAO, 2002) 9 3.1.2. BASES TEÓRICAS 3.1.2.1. Aspectos Generales El Vibrio parahaemolyticus es una bacteria entérica, cuyo hábitat natural son las costas marinas, pues requiere sal para su desarrollo. Los moluscos se encuentran en aguas litorales, mientras que en época fría se encuentran en los sedimentos marinos. Existen diferentes clones patógenos de este agente, algunos de los cuales tienen distribución mundial y otros son propios de algunas regiones específicas. No existe claridad sobre la dosis infectante requerida para provocar un cuadro gastroentérico y en consecuencia, los brotes epidémicos tienen frecuencias y características que varían ampliamente según la región. Desde el punto de vista de la salud pública, la presencia de Vibrio parahaemolyticus en los productos del mar ha sido identificada en todo el mundo como una importante causa de brotes de intoxicación alimentaria. (Domínguez, 2007) 3.1.2.2. Características del V. parahaemolyticus El V. parahaemolyticus es una bacteria halófila gram negativa, que forma parte de la microbiota normal de los moluscos bivalvos, es anaerobio facultativo, catalasa y oxidasa positiva, móviles con flagelos polares, tiene forma de bastón curvo, posee entre 0.5 - 0.8 micras de ancho y 1.4 a 2.4 micras de longitud, crece en las costas marinas, ya que requiere de sal para su crecimiento y desarrollo, el pH optimo es ligeramente alcalino de 7,5 a 8,5. Crecen a temperaturas entre 15-43 ºC, siendo la temperatura ideal de 37ºC, la que permite una mayor concentración de bacterias; soportan concentraciones de cloruro sódico del 6 y 8%, pero no del 10%, en ausencia de cloruro sódico no crecen. (Silva, 2007) 10 El transporte o almacenamiento de productos del mar sin las condiciones adecuadas de refrigeración favorecen la proliferación de la bacteria y, por lo tanto, la posibilidad de infectar. (Rivas, 2012) El periodo de incubación es de 12 a 24 horas, después del cual produce un cuadro intestinal acompañado de cólicos abdominales, diarrea acuosa, nauseas, vomito, fiebre y dolor de cabeza; dura alrededor de 3 a 7 días; cabe recalcar que la infección no se transmite de persona a persona. También se puede transmitir por contaminación cruzada al ingerir cualquier alimento que haya tenido contacto con mariscos o agua contaminada. Entre las características bioquímicas de esta bacteria se encuentran, la fermentación del manitol y la arabinosa, descarboxilan la lisina y la ornitina; no fermentan la sacarosa ni la lactosa y no forman acetil-metil-carbinol. (Silva, 2008). 3.1.2.3. Cuadro clínico Generalmente es autolimitado, el paciente se recupera un período de 3 días, pero puede variar entre 1 a 7 días; en los casos más severos puede producirse un síndrome disentérico, caracterizado por deposiciones sanguinolientas y fiebre alta. La septicemia primaria es causada por la entrada del microorganismo al torrente sanguíneo a través de la vena porta o del sistema linfático intestinal, los primeros síntomas incluyen fiebre, hipotensión, compromiso del estado general, escalofríos, náuseas, vómitos, diarrea y dolor abdominal. Por su parte, las infecciones de heridas pueden ocurrir cuando hay lesiones de piel, quemaduras o cortes preexistentes que entran en contacto con el agua de mar o con las especies marinas contaminadas, el cuadro se caracteriza por una lesión en la piel que se desarrolla dentro de las primeras 24 horas posteriores al contacto con el material contaminado. (Koneman, 2006) 11 El sitio de la infección se presenta inicialmente con eritema, extremadamente edematoso o equimótico, luego progresa rápidamente a una lesión con vesículas o bulas y finalmente a necrosis que involucra la piel y la grasa subcutánea, estas infecciones pueden ocurrir tanto en personas sanas como aquellos con enfermedades preexistentes. (Silva, 2007) 3.1.2.4. Diagnóstico El cultivo de la bacteria se realiza en un medio selectivo, denominado agar TCBS (tiosulfato citrato y sales biliares), en el cual frecuentemente crecen colonias azul-verdosas, las que se identifican con la realización de pruebas bioquímicas. El Vibrio parahaemolyticus también puede cultivarse en otros medios no selectivos, como el agar sangre, pero su detección es un poco complicada. (Burgos, 2010). 3.1.2.5. Es Tratamiento fundamental la rehidratación, no se debe administrar antiespasmódicos ni inhibidores de la motilidad intestinal. Se recomienda el empleo de antibióticos cuando la diarrea excede más de 5 días, el antimicrobiano administrado mayormente es la tetraciclina o doxiciclina, por un período no menor de 5 días. En infecciones cutáneas o septicemia por Vibrio parahemolítico, se recomienda tratar agresivamente con antibióticos como la cefalosporinas de tercera generación más doxiciclina o aminoglucósidos, también se recomienda el empleo de quinolonas más aminoglucósidos. (Heitmann, 2005). 12 3.1.2.6. Prevención Medidas para evitar infección por Vibrio parahaemolyticus No comer ningún tipo de marisco crudo o mal cocido, especialmente en los meses más cálidos. Para consumir mariscos, estos deben ser hervidos a 70°C grados centígrados, por 15 minutos antes de comer. Se debe tener claro que no basta con pasarlos por aguar hervida y que el jugo de limón no sirve para cocer los mariscos. Otra medida para prevenir la intoxicación es lavarse muy bien las manos antes y después de cocinar, lo que además previene otras infecciones. Al comprar mariscos hay que asegurarse de refrigerarlos muy bien hasta que los vaya a cocinar y no mezclarlos con otros alimentos. Es importante no manipular los mariscos que ya están cocidos, después de haber tocado mariscos crudos y mantener muy limpios los mesones y cubiertas donde se preparan los alimentos. Si el consumo de mariscos se realizará fuera del hogar, es necesario hacerlo en lugares establecidos y autorizados asegurándose que las medidas utilizadas por el recinto sean las especificadas por la autoridad sanitaria. (Anderson M. , 2000) 3.1.2.7. Síntomas Infecciones causadas por ingesta de moluscos bivalvos con presencia de Vibrio parahemolítico causa enteritis, acompañada de dolor abdominal, nauseas, vómitos, fiebre, dolor de cabeza, entre otros. (Anderson M. d., 2005) 13 3.1.2.8. Transmisión Se produce por comer mariscos crudos o poco cocidos, en particular las ostras. Con menor frecuencia, se pueden producir infecciones en las heridas cuando las heridas o tejidos blandos están expuestos al agua de mar caliente. (Road, 2013) 3.1.2.9. Medios de enriquecimiento para identificación de V. parahaemolyticus Agua Peptonada Alcalina La viabilidad de Vibrio spp. se mantiene intacta a pH alcalino y el uso de agua peptonada alcalina ha sido recomendado para incrementar la recuperación de Vibrio spp. y de las muestras. El medio contiene peptona de carne, cloruro de sodio y el pH final es de 8.6 ± 0.2 a 25ºC. Se incuba 6 a 8 horas y se siembra en los medios de cultivo. Peptona (Difco) 10g ,Na Cl 10g ,Agua 1000ml. Ajustar pH a 8.6, distribuir 6-8 ml por tubo y esterilizar a 121°C por 15 minutos. (Rojas, 2011) 3.1.2.10. PLACAS COMPACT DRY Propiedades y ventajas Las placas Compact Dry Vp, se producen en Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio - Japón; instalaciones certificadas según la norma ISO 9001, validadas por MICROVAL, y aprobadas por la AOAC. Reúnen las propiedades de las placas convencionales sumadas a las ventajas de los medios deshidrogenados, la combinación de estas propiedades permite un procesamiento acelerado de las muestras, con ello se incrementa la eficiencia al tiempo y se reducen los costes. 14 Las placas Compact Dry se pueden almacenar sin frigorífico, siendo estables a temperatura ambiente (+ 5 a 30° C), hasta un periodo de 24 meses, y después del uso, se deben aplicar las normas vigentes sobre la eliminación de residuos. (Lutz, 2007) Tabla 2: Propiedades de Placas Complact Dry Fuente: (Nissui, 2004) 15 Las placas Compact Dry son un método de ensayo completo, sencillo y seguro para determinar y cuantificar microorganismos en productos alimenticios, cosméticos y otras materias primas, incluidas las farmacéuticas. Se elaboran en plástico estable con un tapón para el cultivo y recuento de microorganismos, así como para el monitoreo de la calidad del producto por posible contaminación; la tapa con cierre giratorio permite transportar las muestras con seguridad y se incuban a la temperatura que se especifique para el caso entre 20° C y 42° C. (Bachmann, 2003) El área de crecimiento es de 20 cm², en la parte posterior de la placa hay una cuadrícula de 1 cm. x 1 cm, gravada para facilitar el recuento de las colonias. Si se tiene dificultades al contar las colonias debido a que existe un gran número de ellas, el recuento total de gérmenes vivos puede obtenerse multiplicando por 20 el número promedio de colonias por cuadrícula de varias cuadrículas. (Hechenrainerstr, 2007) Ensayo Compact Dry Vp Gracias a los indicadores redox y a los sustratos cromógenos, las colonias bacterianas crecen en colores específicos, pudiendo así distinguirse e identificarse con suma facilidad, el Vibrio parahaemolyticus se caracteriza por formar colonias verde-azuladas o azules. (Sanchis, 2009) Otras especies de vibrios, como por ejemplo vibrio cholarae, se pueden identificar con facilidad gracias a los sustratos cromógenos de la coloración roja lila correspondiente. (Cerquera, 2014) El Tiempo de incubación es de 20 a 24 horas y una temperatura de 35 a 37 °C También pueden aplicarse las temperaturas de incubación recomendadas por los reglamentos nacionales para el análisis de vibrios en alimentos. (Silva, 2007) 16 3.1.2.11. ETAS Las Enfermedades transmitidas por Alimentos mejor conocidas por sus siglas como ETAS; son la causa principal de trastornos en el tubo intestinal, con dolores abdominales, diarrea y vómito; causadas por la ingestión de cualquier alimento contaminado por microorganismos patógenos, toxinas, venenos naturales, sustancias químicas dañinas. (Hurtado, 2012) 3.1.2.12. Los contaminantes más comunes en alimentos Entre los contaminantes principales está el contacto con la tierra, aire, agua contaminada, basura, fauna nociva, alimentos crudos, el ser humano, utensilios y trapos, de los cuales hay que mantener las medidas preventivas adecuadas. (Chin, 2001) 3.1.2.13. Factores que contribuyen ETAS Entre los factores que inciden en el padecimiento de enfermedades de transmisión alimentaria está la mala higiene personal en compañía de la contaminación cruzada; preparar los alimentos un día o más antes del consumo incrementan las probabilidades de este padecimiento. El uso de equipo y utensilios sucios, inadecuadas temperaturas de conservación de alimentos, los operarios infectados son un punto crítico a la hora de manipular los alimentos, los productos químicos cerca de los alimentos e Inadecuadas temperaturas de cocción y recalentamiento. (Bravo, 2004) 3.1.2.14. Contaminación cruzada Una enfermedad también se puede propagar por culpa de la contaminación cruzada, que es la transferencia de sustancias o microorganismos dañinos a la comida. (Becton, 2013) 17 Al tocar los alimentos crudos o listos para consumir a través de las manos sucias y de las superficies de contacto sin desinfectar, así como trapos, esponjas de limpieza que tocan alimentos crudos y que no están limpios ni desinfectados y que después se usan en superficies, equipo y utensilios para alimentos que están listos para consumirse. (Vargas, 2008) 18 4. CAPÍTULO III: METODOLOGÍA 4.1. ENFOQUE METODOLÓGICO Hermenéutico: La sistematización del proyecto se dirige en crear un análisis explicativo del análisis microbiológico realizado a 25 muestras de moluscos bivalvos crudos, expendidos en el Mercado Municipal Pedro Pablo Gómez, en el que se investigó la presunta presencia de V. parahaemolyticus, como un indicador en el padecimiento de infecciones gastrointestinales causadas por las malas prácticas de recolección y almacenamiento de los moluscos que van a son consumidos posteriormente. 4.2. LUGAR DE LA EXPERIENCIA Mercado Municipal Pedro Pablo Gómez, ubicado entre las calles Alcedo y Pedro Pablo Gómez de la ciudad de Guayaquil. 4.3. UNIVERSO 25 Muestras de “Moluscos bivalvos crudos” que se expenden en 5 diferentes locales del Mercado Municipal Pedro Pablo Gómez. 4.4. MUESTRA Moluscos bivalvos crudos “Conchas”, todas las muestras obtenidas en el mercado se encontraban a temperatura ambiente de (28° a 34°). 19 4.5. TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS Técnica Compact Dry Vp, Obtener de forma aséptica, la carne y el licor de los moluscos. Licuar la carne y el licor de los moluscos. Medir 10 ml. de muestra y homogenizar con 90 ml de agua de peptona alcalina. Dispensar 1 ml de la dilución preparada sobre las placas Compact Dry, hasta que se difundida de forma homogénea por toda la superficie de la placa. Incubar las placas Compact Dry VP a 35 ± 2 ° C. por 18 a 24 horas. El crecimiento de colonias azules - verdosas, es característico para Vibrio parahaemolyticus; gracias a los indicadores redox y a los sustratos cromógenos presentes en la placa. 4.6. RECURSOS 4.6.1. Humanos Eileen Montero Cabello, estudiante de la Universidad de Guayaquil en la Facultad de Ciencias Químicas. Q.F. Arturo José Landivar Moreira, Tutor Académico. Ing. Claudia Acosta Cárdenas, Jefe de Aseguramiento de Calidad en Pacific Bottling Companny S.A. Expendedores de productos marinos en los puestos del Mercado Municipal Pedro Pablo Gómez. 4.6.2. Materiales Alcohol Algodón Mechero Encendedor Hielera 20 Licuadora Micro pipetas 4.6.3. Medios de enriquecimiento: Agua de peptona alcalina 4.6.4. Metodología Compact Dry Placas Compact Dry Vp 4.6.5. Equipos Incubadora Autoclave 21 5. CAPÍTULO IV: LA EXPERIENCIA 5.1. Contexto de la Experiencia Al realizar consultas bibliográficas en medios informativos, tales como revistas científicas, información por internet, etc. referentes a enfermedades entéricas, llamó mucho la atención que, el incorrecto modo de recolección, almacenamiento y consumo de los moluscos bivalvos crudos, son factores directos en la transmisión de enfermedades gastrointestinales, por ello se planteó el objetivo de investigar la presencia presuntiva de V. parahaemolyticus en 25 muestras de moluscos bivalvos crudos, expendidos en el Mercado Municipal Pedro Pablo Gómez, ubicado entre las calles Alcedo y Pedro Pablo Gómez de la ciudad de Guayaquil, ya que los mercados son uno de los lugares más populosos y concurridos por las personas que desean adquirir este tipo de producto marino. Del 26 de Febrero al 04 de Marzo del 2015; se efectuó un análisis preliminar a 5 diferentes locales expendedores de moluscos bivalvos crudos, en los que se pudo observar que el producto marino no pasaba por un correcto modo de almacenamiento, pues todas las muestras se encontraban a temperatura ambiente de 28°C a 34°C, expuestos a la vista del cliente. La recolección de las muestras se la realizó en hieleras, en un rango de (7 ° C a 10 °C) y llevadas rápidamente al laboratorio. En el análisis microbiológico se lo realizó mediante la metodología Compact Dry, en el Laboratorio de Aseguramiento de Calidad – Pacific Bottling Company, analizando 5 muestras por día. En el se pesaron 10 gr. de muestra en una licuadora estéril con 90 ml de agua de peptona alcalina, dispensando 1 ml de la dilución preparada sobre las placas Compact Dry, esperando que quede difundida de forma homogénea por toda la superficie de la placa. 22 Se incubaron las placas Compact Dry VP a 35 ± 2 ° C. por 18 a 24 horas; presenciando el crecimiento de colonias verdes, positivas para Vibrio parahaemolyticus; pues gracias a los indicadores redox y a los sustratos cromógenos presentes en la placa, las bacterias crecen en colores específicos, pudiendo así distinguirse e identificarse con suma facilidad. 5.2. Actores involucrados. Eileen Montero Cabello, estudiante de la Universidad de Guayaquil en la Facultad de Ciencias Químicas, quien participo en el desarrollo del proyecto, realizando el respectivo análisis microbiológico. Q.F. Arturo José Landivar Moreira, Tutor Académico; quien fue guía durante el proceso de la elaboración del proyecto de titulación. Ing. Claudia Acosta Cárdenas, Jefe de Aseguramiento de Calidad en Pacific Bottling Companny S.A.; quien brindo las facilidades para realizar los análisis microbiológicos en las instalaciones del laboratorio. Expendedores de productos marinos en los puestos del Mercado Municipal Pedro Pablo Gómez, quienes dieron la facilidad de realizar el muestreo y estuvieron dispuestos a aceptar sugerencias de mejoras, para ofrecer un producto de mejor calidad. 23 5.3. Datos Estadísticos Tabla 3: Crecimiento de colonias Azules – Verdosas Día Local A Resultado Positivo 26/02/2015 Día Muestra 1 + Muestra 2 + Muestra 3 + Muestra 4 + Muestra 5 + Local B Resultado Positivo 27/02/2015 Día Muestra 6 + Muestra 7 + Muestra 8 + Muestra 9 + Muestra 10 + Local C Negativo Resultado Positivo 02/03/2015 Negativo Muestra 11 + Muestra 12 + Muestra 13 + Muestra 14 + Muestra 15 Negativo - Fuente propia 24 Día Local D Resultado Positivo 03/03/2015 Día Muestra 16 + Muestra 17 + Muestra 18 + Muestra 19 - Muestra 20 - Local E Resultado Positivo 04/03/2015 Negativo Muestra 21 + Muestra 22 + Muestra 23 + Negativo Muestra 24 - Muestra 25 - Fuente propia 25 Crecimiento de colonias verdes 25 Muestras analizadas --------------------------------------------------------100% Crecimiento de colonias verdes presentes en 20 muestras ------------- X X= Crecimiento de colonias verdes en un 80% de muestras analizadas CRECIMIENTO DE COLONIAS VERDES EN 25 MUESTRAS ANALIZADAS Presencia de colonias verdes Ausencia de colonias verdes 20% 5 muestras 80% 20 Muestras 26 5.4. Análisis e interpretación de los resultados Gracias a los indicadores redox y a los sustratos cromógenos presentes en las placas Compact Dry, el Vibrio parahaemolyticus se distingue con facilidad, pues sus colonias crecen en colores específicos, verde-azuladas o azules. 5.5. Comprobación de la hipótesis Se presenció crecimiento de colonias verdes en 20 muestras analizadas, en las que se presume una posible contaminación por V. parahaemolyticus, indicando la falta de conocimiento de los expendedores a la hora de efectuar el correcto almacenamiento de los moluscos, factor que incide directamente en el desarrollo de la bacteria, exponiendo al consumidor a adquirir infecciones gastrointestinales. 27 6. CAPÍTULO V: PRINCIPALES LOGROS DE APRENDIZAJE 6.1. Lecciones aprendidas de la experiencia, lo positivo y negativo Al culminar el proyecto las lecciones aprendidas fueron positivas, se presenció crecimiento de colonias verdes presuntivas para V. parahaemolyticus en 20 muestras de moluscos bivalvos crudos, expendidos en el mercado Pedro Pablo Gómez, lo que nos lleva a analizar; las posibles falencias que existente al aplicar las buenas prácticas de recolección y almacenamiento del producto, creando un análisis reflexivo sobre los factores que pueden acelerar la reproducción de la bacteria, capaz de producir cuadros entéricos. 6.2. Productos generados por la experiencia Se produjo un acercamiento a la realidad que afecta a la población consumidora de los moluscos, pues al desconocer los factores que afectan la buena calidad de las conchas, incrementa el índice de adquirir una enfermedad gastrointestinal. 6.3. Metas alcanzadas por la experiencia. En primer lugar, se alcanzó el objetivo del proyecto; pues se investigó la presencia presuntiva de V. parahaemolyticus en los moluscos bivalvos crudos expendidos en el mercado municipal Pedro Pablo Gómez. Se incrementó el aprendizaje al investigar y desarrollar las técnicas de análisis pertinentes para el análisis microbiológico realizado. Se obtuvo una mayor destreza al realizar los procesos de análisis, alcanzando la satisfacción por haber seguido los pasos correctamente. 28 6.4. Impactos de la experiencia (positivos y negativos) En el desarrollo de la experiencia el impacto negativo fue, que los expendedores del producto, mantenían las conchas a temperatura ambiente lo cual incide en el rápido desarrollo de la bacteria, pudiendo alcanzar altas concentraciones capaces de producir un cuadro entérico si el molusco no pasa por el adecuado proceso de cocción. Entre los impactos positivos, están la facilidad y cooperación de los expendedores, los cuales dieron la facilidad para realizar un muestreo en diez de los locales expendedores de mariscos del mercado municipal Pedro Pablo Gómez. 6.5. Proyección de la Experiencia Crear un análisis crítico de los moluscos bivalvos crudos que se expenden en el mercado municipal Pedro Pablo Gómez, por la presunta presencia de V. parahaemolyticus, determinando si son aptos para el consumo humano. 6.6. Elementos de riesgo en la experiencia. Los elementos de riesgo de la experiencia van de la mano con una mala manipulación de las muestras o siembras realizadas, pues se puede dar el caso de adquirir una infección por contacto directo con las presuntas colonias de V. parahaemolyticus durante la realización del análisis microbiológico, de igual manera si los analistas no siguen las adecuadas normas de bioseguridad y barreras de contacto. 29 7. CAPÍTULO VI 7.1. CONCLUSIONES Se investigó la presencia presuntiva de V. parahaemolyticus a 25 muestras de moluscos bivalvos crudos expendidos en el mercado municipal Pedro Pablo Gómez, mediante la metodología Compact Dry Vp, obteniendo un resultado presuntivo para V. parahaemolyticus en 20 muestras, por crecimiento de colonias verdes. Analizando los factores que inciden en el desarrollo de la bacteria, podemos determinar que el factor principal es la temperatura a la que se exponen los moluscos, en la incorrecta recolección y almacenamiento. Como medidas correctivas para un menor desarrollo de V. parahaemolyticus en los moluscos; se recomienda, que los expendedores del mercado Pedro Pablo Gómez, conserven la adecuada cadena de frio de (7 a 10°C.) y no los comercialicen al medio ambiente como es usual. También evitar el expendio de los moluscos en los meses más cálidos del año, pues se crea el medio propicio para su desarrollo. Se pudo comprobar que los locales del mercado no cumplen con las reglas requeridas para la conservación del producto marino, considerando las muestras analizadas no aptas para el consumo humano. 30 7.2. RECOMENDACIONES Deben tomarse medidas estratégicas para regular la distribución y venta de estos productos en los mercados, sobre todo porque estos lugares es donde concurre la mayor parte de la población a adquirirlos y si no son cocinados adecuadamente, pueden llegar a causar graves problemas de salud. Entre las recomendaciones para prevenir dichas infecciones están: No consumir mariscos curtidos o mal cocidos. Evitar ingerir éstos alimentos en lugares populosos, como mercados que no cuentan con hábitos de higiene necesario para el expendio de los mariscos. Tener en cuenta que el limón no mata al V. parahaemolyticus, ya que la bacteria necesita un tiempo de cocción de 15 minutos a 70°C. Mantener los mariscos refrigerados y separados de otros alimentos. Comprar y consumir los mariscos en lugares autorizados. Lavarse siempre las manos antes de cocinar y después de ir al baño. Recordar que el jugo de limón no cuece los alimentos. 31 8. BIBLIOGRAFÍA Anderson, M. (2000). Microbiología Alimentaria: Metodología Analítica párrafo Alimentos y Bebidas. Madrid: Díaz de Santos. Pág 15, 20/06/14. Anderson, M. (2005). Enfermedades de origen alimentario: su prevención. Madrid: Díaz de Santos. Pág 3, 21/06/14. Bachmann, B. L. (2003). Evaluation mikrobiologischer Methoden.Obtenido de: https://www.qmtishop.de/product_pdf/compact_dry_span.pdf. Pág 2, 21/03/15. Becton, E. (2013). INSTRUCCIONES DE USO – MEDIOS EN PLACAS LISTO PARA USAR. Obtenido de: http://www.bd.com/europe/regulatory/assets/ifu/hb/ce/pa/es-pa254432.pdf. Pág 2, 22/06/14. Baron, E. (2013). TCBS Agar – Medios en placas listo para usar. Obtenido de: http://www.bd.com/europe/regulatory/assets/ifu/hb/ce/pa/es-pa 254432.pdf - Pág 22 - 24, 21/06/14. Baron, M. (2010). Vibrio/Brucela. 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