Tesis Mariuxi 6 dic-2011.pdf

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
TESIS DE GRADO
PREVIA A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE
INGENIERO AGRÓNOMO
TEMA:
Identificación y evaluación de antagonistas del tizón temprano
(Alternaria solani) en tomate (Lycopersicon esculentum Mill)
AUTOR:
MARIUXI ROCIO MOLINA YAURE
Directora de tesis:
Ing. Agr. MSc. Leticia Vivas Vivas
MILAGRO - ECUADOR
2010 - 2011
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
La presente tesis de grado titulada “Identificación y evaluación de
antagonistas del tizón temprano (Alternaria solani) en tomate
(Lycopersicon esculentum Mill)” realizada por la Egda. MARIUXI
ROCIO MOLINA YAURE, bajo la dirección de la Ing. Agr. M.Sc.
Leticia Vivas Vivas ha sido aprobada y aceptada por el Tribunal de
Sustentación como requisito parcial para obtener el título de
INGENIERO AGRÓNOMO.
TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN
Q.F. MSc. Martha Mora Gutiérrez
Presidenta
Ing. Agr. MSc. Leticia Vivas Vivas
Examinadora Principal
Directora de Tesis
Ing. Agr. Valeriano Bustamante García
Examinador Principal
Ing. Agr. MC. Eison Valdivieso Freire
Examinador Alterno
Guayaquil – Ecuador
2010 – 2011
ii
DEDICATORIA
A Dios, por haberme dado la vida y gracias a la ayuda de Él he podido culminar una
etapa en mi vida universitaria.
A mi madre Mariana Esther Yaure M., por su esfuerzo y apoyo constante en
conseguir que pueda tener un futuro prometedor a mis hijos.
A mi padre Germán Favio Molina P. por su apoyo incondicional.
A mis hijos, David Joseph, Bryan Daniel y Daniela Mailyn, por darme las fuerzas
para seguir adelante.
A mi hermana Maritza y a mi sobrina Nallely, a mi familia y amigos en general que
de manera directa e indirectamente apoyaron para cumplir mi meta.
A la Ing. Leticia Vivas por su enseñanza, esfuerzo y dedicación que me ha brindado
para culminar mi tesis.
A todos mis profesores de la Universidad de Guayaquil Facultad de Ciencias
Agrarias que me han enseñado y educado para el futuro.
iii
AGRADECIMIENTO
La autora deja constancia de sus más sinceros agradecimientos a personas e
instituciones que brindaron su cooperación para que se realice este trabajo de
investigación.
Primeramente a Dios, a mi madre y a mis hijos.
A la Universidad de Guayaquil, especialmente a la Decana Dra. Martha Mora, al
Consejo Directivo, Profesores, Secretarias y Trabajadores de la Facultad de Ciencias
Agrarias.
Al Departamento Nacional de Protección Vegetal, Sección Fitopatología, de la
Estación Experimental del Litoral Sur “Dr. Enrique Ampuero Pareja” del Instituto
Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias INIAP.
De manera muy especial a la Ing. MSc. Leticia Vivas V. Directora del Proyecto FCI016 “Búsqueda de microorganismos antagonistas de fitopatógenos foliares en el cultivo de
tomate en las provincias de Guayas y Santa Elena” y Directora de Tesis, por sus
constantes consejos y motivación durante el transcurso del trabajo.
A los señores agricultores de campos hortícolas de las provincias del Guayas y Santa
Elena por dar las facilidades en la toma de muestras para el presente trabajo.
A la Dra. Carmen Triviño Colíder del DNPV Departamento Nacional de Protección
Vegetal de EELS, a la Ing. Agr. MSc. Myriam Arias Responsable de la Sección de
Entomología, a los Ing. Ángel Jinés y Eison Valdivieso.
A mis compañeros por brindarme su apoyo y colaboración a Diana Intriago, Rolando
Capuz, Héctor Reyes, Nelson Moreano, Diego Portalanza, Bertín Osorio, Alexandra
Tomalá, Sofía Gorotiza, Hugo Rivera, Pablo Zambrano, Sandra García, Sandra Mejía
Álvaro Manzano, Wladimir Jiménez, Elena Corozo, Alex Delgado, Cristián A, Don
Elvin León, Don Hugo Vaca, Don Rodolfo Veloz.
Y a todo el personal Técnico y Administrativo de la EELS del INIAP, por brindarme
su amistad y ayuda en todo lo que estuvo a su alcance.
iv
Las investigaciones, resultados,
conclusiones y recomendaciones del
presente trabajo, son de exclusiva
responsabilidad de la autora.
_______________________________
MARIUXI ROCIO MOLINA YAURE
Email:[email protected]
v
Índice
Contenido
I
II
Portada ………………………………………………………………
i
Página de aprobación………………………………………………..
ii
Dedicatoria…………………………………………………………..
iii
Agradecimiento……………………………………………………...
iv
Responsabilidad de la autora.……………………………………….
v
Índice General……………………………………………………….
vi
Índice de Cuadros……………………………………………………
ix
Índice de Figuras…………………………………………………….
x
Índice de Anexos…………………………………………………….
xii
INTRODUCCIÓN…………………………………………………..
1
Objetivo general………………………………………..........
2
Objetivo específicos…………………………………………
2
REVISION DE LITERATURA……………………………………..
3
A.
Principales enfermedades foliares del tomate…………..
3
Tizón temprano (Alternaria solani)…...…………………..
3
2. Mancha corynespora (Corynespora cassiicola)………….
4
3. Cenicilla (Oidiopsis sp = Leveillula taurica……………..
5
4.
Moho gris (Fulvia fulvum)……………………………….
6
Agentes biocontroladores…………………………….....
7
MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………...
9
3.1. Ubicación………………………………………………..
9
3.2. Factores estudiados………………….…………………..
9
3.3. Materiales…………………………………..……………
9
3.4. Fases de estudio y Manejo del Experimento……….........
9
a. Laboratorio…….……………………………………...
9
1.
B.
III
Página
Identificación de microorganismos antagonistas de A.
solani……………………….………………………….
9
Aislamiento de A. solani para pruebas de patogenicidad..
10
Confrontación de cepas hongos antagonistas de A.
solani…………………………………………………..
vi
10
Inhibición del tubo germinativo de A. solani por efecto
de cepas de hongos antagonistas………………………
10
Tratamientos.……………………………….…………
11
Cuadro 1………………………………………………
11
Diseño experimental…………………………………..
12
b. Invernadero…………………………………………..
12
Inoculación del fitopatógeno………………………...
12
Efecto de seis cepas de hongos antagonistas sobre A.
IV
solani………………………………………………...
13
Tratamientos y diseño experimental…………………
14
3.5. Variables registradas…………………………………..
14
a.
Microorganismos antagonistas…….………………..
14
b.
Inhibición del crecimiento micelial………………….
14
c.
Inhibición de tubos germinativos………...…………
14
d.
Incidencia y severidad………………………………
15
d.
Temperatura y humedad relativa……………………
15
RESULTADOS……………………………………………………..
16
4.1.
4.2.
Identificación de hongos antagonistas de Alternaria solani…
16
Cuadro 2……………………………………………………..
16
Pruebas de eficacia de seis cepas de hongos antagonistas de
A. solani……………………………………………………...
16
a. Laboratorio…………………………………………………..
16
Confrontación de seis cepas de hongos antagonistas………..
16
Cuadro 3……………………………………………………..
17
Porcentaje de germinación de las cepas de hongos
antagonistas y de A. solani…………………………………..
17
Cuadro 4……………………………………………………..
17
Figura 1………………………………………………………
18
Figura 2………………………………………………………
18
Inhibición de tubos germinativos y daños en esporas de A.
solani por efecto de antagonistas……………………………
19
Cuadro 5……………………………………………………..
19
Figura 3………………………………………………………
19
vii
b. Invernadero…………………………………………………..
20
Cuadro 6……………………………………………………..
20
Cuadro 7……………………………………………………..
21
4.3. Datos climáticos……………………………………………….
21
Cultivar Floradade…………………………………………...
21
Figura 4………………………………………………………
21
Cuadro 8……………………………………………………..
22
Figura 5………………………………………………………
23
Figura 6………………………………………………………
23
Figura 7……………………………………………………....
24
Figura 8………………………………………………………
24
Figura 9………………………………………………………
25
Figura 10……………………………………………………..
25
Figura 11……………………………………………………..
26
Cultivar Miramar…………………………………………….
26
Figura 12……………………………………………………..
26
Figura 13……………………………………………………..
27
Figura 14……………………………………………………..
27
Figura 15……………………………………………………..
28
Figura 16……………………………………………………..
28
V
DISCUSIÓN………………………………………………………...
29
VI
CONCLUSIONES.…………………………………………………
31
VII
RECOMENDACIONES………...………………………………….
32
VIII
RESUMEN………………………………………………………….
33
IX
SUMMARY…………………………………………………………
34
X
BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………
35
XI
ANEXO……………………………………………………………..
37
Anexo 1……………………………………………………..
38
Anexo 2……………………………………………………..
39
Anexo 3……………………………………………………..
39
Anexo 4……………………………………………………..
40
viii
Índice de Cuadros
Cuadro 1.
Identificación de hongos antagonistas de A. solani. 2011……..
11
Cuadro 2.
Confrontación de seis cepas de Trichoderma frente a Alternaria
solani en condiciones de laboratorio. INIAP, EELS, 2011……..
16
Porcentaje de germinación de seis antagonistas y de A. solani.
INIAP, EELS, 2011. …………………………………………..
17
Porcentaje esporas de A. solani sin daños al ser tratadas por
antagonistas en condiciones de laboratorio INIAP, EELS, 2011
17
Porcentaje de foliolos con A. solani en el cultivar Floradade en
condiciones de invernadero. INIAP, EELS, 2011. …………….
19
Porcentaje de foliolos con A. solani en el cultivar Miramar en
condiciones de invernadero. INIAP, EELS, 2011. ……….…….
20
Datos de temperatura y Humedad Relativa durante el estudio en
condiciones de invernadero. INIAP, EELS, 2011………………
21
Cuadro 3.
Cuadro 4.
Cuadro 5.
Cuadro 6.
Cuadro 7.
ix
Índice de Figuras
Figura 1.
Figura 2.
Figura 3.
Figura 4.
Figura 5.
Figura 6.
Figura 7.
Figura 8.
Figura 9.
Figura 10.
Interacción del porcentaje de germinación de seis cepas de
antagonistas en condiciones de laboratorio, INIAP, EELS,
2011.……………………………………………………………
18
Porcentaje de germinación de A. solani frente a seis cepas de
antagonistas en condiciones de laboratorio, INIAP, EELS,
2011……………………………………………………………
18
Porcentaje de esporas de A. solani deshidratadas por efecto de
seis cepas de antagonistas en condiciones de laboratorio,
INIAP, EELS, 2011.………………………………………….
19
Relación cuadrática de temperatura (A) y humedad relativa
(B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani
tratados con el antagonista cepa Pedro Carbo. INIAP, EELS,
2011. …......................................................................................
21
Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa
(B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani
tratados con el antagonista cepa Isidro Ayora. INIAP, EELS,
2011. …………………………………………………………...
23
Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa
(B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani
tratados con el antagonista cepa EELS, INIAP, EELS, 2011….
23
Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa
(B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani
tratados con el antagonista cepa Km 20. INIAP, EELS, 2011..
24
Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa
(B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani
tratados con el antagonista cepa El Azúcar, INIAP, EELS,
2011. …………………………………………………………..
24
Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa
(B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani
tratados con el antagonista cepa Río Verde, INIAP, EELS,
2011…………………………………………………………….
25
Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa
(B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani
tratados con Timorex, INIAP, EELS, 2011……………………
25
x
Figura 11.
Figura 12.
Figura 13.
Figura 14.
Figura 15.
Figura 16.
Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa
(B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani en el
testigo absoluto, INIAP, EELS, 2011………………………….
26
Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa
(B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani
tratados con el antagonista cepa Pedro Carbo, INIAP, EELS,
2011…………………………………………………………….
26
Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa
(B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani
tratados con el antagonista cepa Isidro Ayora, INIAP, EELS,
2011…………………………………………………………….
27
Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa
(B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani
tratados con el antagonista cepa EELS, INIAP, EELS,
2011……………………………………………………………
27
Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa
(B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani
tratados con el antagonista cepa Km 20, INIAP, EELS,
2011…………………………………………………………….
28
Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa
(B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani
tratados con Timorex y testigo absoluto, INIAP, EELS,
2011…………………………………………………………….
28
xi
Índice de Anexo
Anexo 1. Esquema de la disposición de los tratamientos……………………
36
Anexo 2. Confrontación del antagonista con A. solani……………………...
37
Anexo 3. Esporas germinadas y deshidratadas de A. solani…………………
37
Anexo 4. Identificación molecular de las cepas de antagonistas…………….
38
xii
I. INTRODUCCIÓN
El cultivo de tomate (Lycopersicon esculentum Mill) solanácea, originaria de
América, es una de las plantas más populares e importantes a nivel mundial, tanto
por su cultivo como por su consumo. En Ecuador existen alrededor de 2037 ha con
una producción de 43025 Tm (MAGAP-SIGAGRO e INEC, 2010).
Este cultivo es afectado por muchos ascomicetes y hongos imperfectos los cuales
ocasionan primariamente enfermedades del follaje de las plantas, pero algunas de
ellas afectan también las inflorescencias, tallos jóvenes, frutos e incluso raíces
(Agrios, 2004).
Entre los causales de enfermedades foliares en Guayas, Santa Elena y Manabí se
mencionan a Alternaria solani, Corynespora cassiicola, Oídium sp, entre otros, para
su manejo los productores utilizan agroquímicos de diferentes categorías
toxicológicas con frecuencias de dos y tres aplicaciones semanales e incluso en la
cosecha, lo que conlleva al aumento del costo de producción, afecciones en la salud
de personas que laboran en campo y de los consumidores, deterioro del ecosistema.
En la naturaleza existen microorganismos que reducen en forma natural el inóculo de
fitopatógenos como es el caso de hongos y bacterias antagonistas.
Estudios realizados en Costa Rica sobre el control microbiológico de
Phytophthora infestans en tomate, determinaron que de 137 aislamientos 32
mostraron efecto antagónico y redujeron significativamente del tamaño de la lesión
en condiciones de laboratorio, de los cuales se seleccionaron cinco los de mayor
potencial (Sánchez, Bustamante y Shattock, 1999). En condiciones de invernadero
los resultados mostraron que la cepa Trichoderma 069 y Penicillum 067 redujeron el
número de lesiones y área foliar afectada por planta con relación a los tratamientos
testigo (solo agua) y similar al uso de fungicida (Fernández - Larrea, 2001).
Capuz (2009) reportó que las cepas G-08 y SE-034 de Trichoderma asperellum
tuvieron efecto sobre la reducción de la severidad causada por Sclerotium rolfsii en
los cultivos de tomate, pimiento y sandía. Por otra parte, Cevallos (2010) mencionó
que al aplicar T. asperellum cepa G-08 redujo le severidad del complejo marchitez
del tomate.
1
Cepas de Bacillus spp y Pseudomonas fluorescens aisladas de campo fueron
evaluadas bajo condiciones de laboratorio por su antagonismo a Alternaria solani,
varias de ellas disminuyeron el crecimiento del tubo germinativo y el número de
ramificaciones del hongo. Algunos mostraron características de producir quitinaza
que puede degradar la pared celular del hongo (Okumoto y Bustamante, 1993).
Es importante destacar que la correcta identificación de antagonistas
y la
determinación de la eficacia de los mismos, se podrán incluirlas en programas de
manejo integrado de enfermedades foliares en el cultivo de tomate.
En base a lo expuesto el presente estudio tuvo los siguientes objetivos:
OBJETIVO GENERAL
Identificar microorganismos antagonistas eficientes para el manejo de
fitopatógenos foliares en cultivos hortícolas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Identificar microorganismos antagonistas que actúen en forma natural sobre
fitopatógenos foliares en el cultivo de tomate.
2. Realizar pruebas de eficacia de él o los antagonistas sobre fitopatógenos
foliares en condiciones de laboratorio e invernadero.
2
II. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. Principales enfermedades foliares del tomate
2.1.1.
Tizón temprano (Alternaria solani)
El tizón temprano (A. solani) afecta principalmente a las hojas, tallos, flores y
frutos, sus síntomas generalmente presentan afección foliar que aparece en forma de
manchas irregulares constituidas por anillos concéntricos (Okumoto, 1992).
A. solani a veces provoca daños en plántulas (chancros en el tallo), manchas
concéntricas, pequeñas de color pardo e irregulares, cloróticas en su periferia sobre el
foliolo, constituidas por anillos concéntricos que les confieren la apariencia de una
diana, foliolo viejo recubierto de manchas pardas redondeadas de origen de su
amarillamiento, sépalos necrosados, manchas cóncavas (deprimidas), situadas a nivel
del pedúnculo del fruto, pequeñas manchas pardas alargadas en el tallo aclarándose
en su centro (comienzo del ataque), manchas pardas en el raquis cuya parte central es
gris. Este hongo, parásito del follaje y de los frutos, ocasiona también en los tallos
manchas muy características. Son bien delimitadas, marrón oscuro y presentan
anillos finos y concéntricos (Blancard, 2005).
Los primeros síntomas en el follaje son pequeñas machas de color café a negro,
rodeado de un halo amarillo, que aparecen en las hojas bajeras o más viejas. Cuando
las lesiones miden aproximadamente 6 mm de diámetro se observan anillos
concéntricos que le dan un aspecto de tabla de tiro al blanco. La infección del fruto
ocurre generalmente en la base del pedúnculo y se pueden notar manchas hundidas,
oscuras y acartonadas. Estas manchas también presentan los anillos concéntricos
(Castaño, 1994).
Los síntomas en las hojas más viejas aparecen manchas de color café rodeadas
de zonas de color amarillo que crecen hasta 2 centímetros y muestran por lo general
el aspecto de un blanco de tiro; pueden cubrir toda la hoja volviéndola de un color
3
amarillo. Las plantas muy atacadas pueden perder todas sus hojas, exponiendo los
frutos a los rayos directos del sol, produciéndose escaldaduras. En los tallos se
presentan zonas necróticas de forma alargada (con anillos concéntricos), causando en
las plántulas lo que se denomina como “pudrición del collar”. Si la planta no muere,
permanece pequeña y su producción es muy reducida (Suquilanda, 2003).
El hongo también ataca al fruto, formando una depresión cerca al pedúnculo. La
infección se presenta durante periodos lluviosos y de alta humedad, aunque también
se ha observado que en periodos secos y cálidos se favorece su rápida expansión
(Suquilanda, 2003).
Por lo general, el color de las manchas foliares varía de café oscuro a negro, a
menudo son numerosas y cuando se extienden casi siempre forman anillos
concéntricos que adquieren la forma de un blanco. Por lo común, las hojas
senescentes de la parte inferior de la planta son atacadas en primer término, pero la
enfermedad asciende hacia la parte superior de aquélla y hace que las hojas afectadas
se tornen amarillas y senescentes, se desequen y debiliten o desprendan. En las ramas
y tallos de plantas de tomate, aparecen varias manchas oscuras, profundas y con
frecuencia en forma de blanco. A veces las lesiones del tallo en las plántulas forman
cancros que pueden extenderse, cubrir al tallo y matar a la planta (Agrios, 2004).
2.1.2.
Mancha corynespora (Corynespora cassiicola)
La sintomatología inicial consiste en pequeñas punteaduras en la superficie de
las hojas. Estas lesiones se van extendiendo gradualmente, haciéndose circulares y de
tonalidad marrón pálido. Las lesiones desarrollan halos amarillos llamativos de
forma individualizada. La coalescencia de dos o más lesiones en un foliolo puede dar
lugar al colapso rápido del tejido foliar, aunque este permanece unido al peciolo. En
foliolos altamente susceptibles las lesiones pueden llegar a ser tan numerosas que son
difíciles de contar (Blanquez, 2001).
Las lesiones en el tallo y en los peciolos son de color castaño y de forma oblonga
a elongada, recordando a aquellas que se producen en las hojas. Las lesiones
4
punteadas incrementan su tamaño rápidamente y pueden llegar a rodear el peciolo y
el tallo, acelerando el colapso de los foliolos. La necrosis de los foliolos y hojas suele
ocurrir de forma rápida, dando la apariencia de una muerte súbita, similar a la que
ocurre en el moteado bacteriano (Blanquez, 2001).
Las condiciones óptimas para el desarrollo de Corynespora es de 20 a 28 °C,
pero la infección se produce entre 16 a 32 °C. Para el control se deben realizar
tratamientos con fungicidas antes de presentarse los síntomas (Yánez, 2008).
2.1.3.
Cenicilla (Oidiopsis sp. = Leveillula taurica)
Los síntomas iniciales de Oidiopsis son lesiones de color verde claro a amarillo
intenso que aparecen en el haz, en el centro se desarrollan puntos necróticos a veces
con anillos concéntricos. En el envés de dichas lesiones se observa un crecimiento
de aspecto polvoriento que corresponde a las estructuras reproductivas del hongo.
Las hojas infectadas mueren pero rara vez caen de la planta. La temperatura óptima
para la incidencia de la cenicilla es de 26 °C acompañada de una humedad relativa
del 70 % (Paulus y Cornel, 2001).
En control preventivo y técnicas culturales como la eliminación de malezas,
restos de cultivo, utilización de variedades resistentes, trasplantes sanos y puede
practicarse el control químico con fungicidas (Yánez, 2008).
Los síntomas se presenta en forma semejante al mildiu polvoso, pero atacando el
haz y el envés de las hojas. Las hojas atacadas se ponen amarillas y se caen. Esta
enfermedad es más severa en épocas secas (Suquilanda, 2003).
Los síntomas causados por L. taurica son similares a la Oidiopsis sp. los tejidos
afectados se necrosan en el centro y muestra un vello blanco, manchas amarillas que
presentan a veces un punteado de color marrón claro que les confiere un aspecto
“sucio”, manchas amarillo pálidas cubierta de un discreto vello blanco, las manchas
de oídium mas angulares permanecen blancas., manchas amarillas más difusas que se
5
recubren de fructificaciones primeramente blancas y posteriormente oliváceas
(Blancard, 2005).
Los síntomas sobre los haces foliares se presentan manchas de tipo aceitoso muy
definidas, que luego se cubren de un polvillo muy fino de color amarillo que termina
por necrosar las hojas y defoliar a la planta, causando finalmente frutos muy
pequeños y un una baja sensible en la producción (Suquilanda, 2003).
2.1.4.
Moho gris (Fulvia fulvum)
Los síntomas del moho gris se presenta como manchas de color amarillo pálido
difusas, recubierto de fructificaciones pardo oliváceas del hongo, muy visible
primeramente blanco y posteriormente evolucionando a pardo oliváceo a fieltrado en
la cara inferior de las hojas, a menudo invisible siempre blanco cuando está presente,
las manchas de F. fulvum, más redondeadas, se colorean rápidamente de marrón
oscuro por sus fructificaciones, manchas amarillas más difusas que se recubren de
fructificaciones primeramente blancas y posteriormente oliváceas (Blancard, 2005).
El moho de la hoja puede ser una enfermedad seria en lugares donde el tomate se
cultiva bajo condiciones de alta humedad, como las siembras en invernadero.
Usualmente los síntomas solo ocurren en el follaje. Atacan primero las hojas más
viejas pero a medida que avanza la temporada ataca progresivamente en hojas más
jóvenes. El primer síntoma en las hojas es la aparición de un área de aspecto verde
pálido o amarillento con márgenes indefinidos en el haz.
A medida que avanza la enfermedad el tejido invadido se torna de color amarillo
obscuro, las hojas se arrugan, secan y caen prematuramente. La defoliación progresa
hacia la parte superior de la planta. En el envés de estas hojas, correspondiendo con
las áreas amarillas, se desarrollan un crecimiento verde oscuro de aspecto
aterciopelado, compuesto por las estructuras reproductivas del patógeno (Castaño,
1994).
6
2.2.
Agentes biocontroladores
Estudios realizados en Costa Rica sobre el control microbiológico de
Phytophthora infestans en tomate, determinaron que de 137 aislamientos 32
mostraron efecto antagónico y redujeron significativamente el tamaño de la lesión en
condiciones de laboratorio, de los cuales se seleccionaron cinco los de mayor
potencial (Sánchez, Bustamante y Shatottock, 1999). Posteriormente, se evaluaron
en condiciones de invernadero cuyos resultados mostraron que la cepa Trichoderma
069 y Penicillum 067 redujeron el número de lesiones y el área foliar afectada por
planta con relación a los tratamientos testigo (solo agua) y similar al uso de fungicida
(Fernández – Larrea, 2001).
Por otra parte, se menciona que el antagonista Trichoderma harzianum tiene
efecto sobre Rhizoctonia solani (Reyes et al; 2002).
Reportes sobre la actividad biocontroladora in Vitro de la cepa A34 de
Trichoderma harzianum sobre Sclerotium rolfsii en tomate se observó la eficacia
antagónica a partir de la ausencia de síntomas de
la enfermedad en plantas
protegidas (Okumoto y Bustamante, 1993).
Cepas de Bacillus spp y Pseudomonas fluorescens aisladas de campo fueron
evaluadas bajo condiciones de laboratorio por su antagonismo a Alternaria solani,
varias de ellas disminuyeron el crecimiento del tubo germinativo y el número de
ramificaciones. Algunos mostraron características de producir quitinaza que puede
degradar la pared celular del hongo (Okumoto y Bustamante, 1993).
En algunos casos Trichoderma actúa sobre algunos patógenos debido a su
capacidad de colonizar rápidamente el follaje; también puede colonizar
extensivamente una superficie foliar intacta (Fernández-Larrea, 2001).
El hongo Trichoderma harzianum, ha sido estudiado mundialmente por sus
excelentes características como biocontrolador de hongos del suelo, causantes de
enfermedades en los cultivos, por lo cual determinaron la efectividad de este hongo
7
para el control de marchitez en tomate, causada por Pythium, Rhizoctonia solani,
Fusarium (Perdomo et al., 2007).
El género Trichoderma está integrado por un gran número de cepas fúngicas que
actúan como agentes de control biológico y cuyas propiedades antagónicas se basan
en la activación de mecanismos muy diversos; el biocontrol por competencias como
la fungistasis, competencia por nutrientes, biofertilización y activación de los
mecanismos de defensa de las plantas, modificación de la rizósfera, antibiosis,
micoparasitismo, enzimas degradadoras de la pared celular como las quitinasas,
glucanasas y proteasas. Resistencia a los compuestos tóxicos pueden estar asociados
con la presencia de cepas de Trichoderma de los sistemas de transporte ABC (29);
por esta razón, los preparados de cepas de este hongo son muy eficientes en el
control de fitopatógenos varios (Benítez, et al., 2004).
Los microorganismos con capacidad de hidrolizar celulosas y glucano presentan
alto potencial como antagonistas de este género observaron la lisis de células
fungosas por enzimas u otros compuestos producidos por Trichoderma harzianum
(Sánchez, Bustamante y Shattock, 1998).
Por otra parte, Michel-Aceves et al (2008) mencionan que especies de
Trichoderma han demostrado su eficiencia en el control de fitopatógenos que atacan
partes aéreas y de la raíz de las plantas de tomate.
8
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Ubicación
La colección de material vegetativo con síntomas de enfermedad del cultivo de
tomate se realizó en campos de productores en las provincias de Guayas y Santa
Elena. El aislamiento, identificación a nivel de género y pruebas de patogenicidad y
eficacia se realizó en condiciones de laboratorio e invernadero del Departamento
Nacional de Protección Vegetal, Sección Fitopatología, de la Estación Experimental
del Litoral Sur “Dr. Enrique Ampuero Pareja” del Instituto Nacional Autónomo de
Investigaciones Agropecuarias INIAP, ubicada en el km. 26, al este de Guayaquil en
la vía Durán – Tambo, parroquia Virgen de Fátima, cantón Yaguachi, provincia del
Guayas. Sus coordenadas son 2º 15′ 15″latitud sur y 79° 38′ 40″longitud occidental y
a 17 msnm1/, con una pluviosidad de 1154.3 mm, temperatura media anual 26.5 ºC y
76.2 % de humedad relativa media anual2/.
3.2 Factores estudiados
Cepas del antagonista Trichoderma y el hongo fitopatógeno Alternaria solani
3.3 Materiales
Microscopio, higrotermógrafo, estufa, autoclave, cajas petri, matraces, vasos de
precipitación, pipetas, jeringa descartables, mascarilla y guantes desechables,
atomizadores manual, bandejas germinadoras, maceteros, cuadernos, marcadores,
lápiz, cinta Scott, parafilm, semillas de tomate, y los medios de cultivos Papa
dextrosa agar (PDA) y Agar agua (AA).
3.4. Fases de estudio y manejo del experimento
Este estudio tuvo dos fases: laboratorio e invernadero.
a. Laboratorio
Identificación de microorganismos antagonistas de A. solani.
En muestras procedentes de campos hortícolas de las provincias de
Guayas y Santa Elena se realizaron aislamientos de hojas sanas de tomate;
mismas que fueron lavadas y esterilizadas con una solución de hipoclorito de
9
sodio al 5% durante 5 minutos, se sembraron en medio de cultivo papa
dextrosa agar (PDA) y agar nutritivo (AN); éstas se incubaron a temperatura
ambiente y se observaron diariamente hasta que crecieron las colonias para su
respectiva identificación a nivel de género, para determinar la especie se
enviaron las muestras a un laboratorio especializado en secuenciación del
acido desoxirribonucleico (ADN). Para este propósito se emplearon el
método de CTAB modificado para la extracción del ADN, la identificación se
realizó sobre las secuencias espaciadoras internas transcritas del ADN
ribosomal (ITS1 e ITS2); se usaron secuencias del GenBank para comparar y
establecer los árboles filogenéticos.
Aislamiento de A. solani para pruebas de patogenicidad
En los mismos campos también se colectaron hojas con necrosis para
aislar al
fitopatógeno, purificarlo y multiplicarlo para las pruebas de
patogenicidad en laboratorio e invernadero. Estas muestras se sembraron en
PDA previa desinfección con hipoclorito de sodio.
Confrontación de cepas de hongos antagonistas de A. solani
Con las colonias puras del fitopatógeno y las cepas de Trichoderma se
procedió a efectuar la prueba de antagonismo in vitro. Se tomó un disco 5
mm de crecimiento micelial de ambos hongos, se procedió a colocarlo en un
extremo de la caja petri que contiene medio de cultivo PDA, luego se dejó en
incubación a temperatura ambiente. La evaluación se realizó cada 24 horas
hasta que el antagonista cubrió totalmente al fitopatógeno y consistió en
medir los diámetros mayor y menor del crecimiento micelial. Por
cada
antagonista se usaron diez cajas petri.
Inhibición del tubo germinativo de A. solani por efecto
de hongos
antagonistas
Con las cepas de Trichoderma en concentraciones de 1x106, 1x108 y
1x1010, se prepararon suspensiones con agar agua (AA) previamente
esterilizado, luego se colocaron en cajas petri; el tejido infectados por A.
solani se colocó en papel kraft para liberar los conidios. Después de 24 horas
10
se procedió a evaluar germinación y deformación de la espora de A. solani,
los datos fueron transformados a porcentaje.
Tratamientos
Los tratamientos para la confrontación de antagonistas y A. solani fueron
las seis cepas de los hongos seleccionados. De estas cepas se estudiaron tres
dosis sobre la germinación de A. solani lo que constituyó 18 tratamientos, se
incluyeron un testigo comercial y un absoluto que describen en el cuadro 1.
Cuadro 1. Detalle de los tratamientos en la prueba de laboratorio INIAP,
EELS, 2011.
No. Combinación Descripción
1
PC D1
Pedro Carbo 1 x 10-6
2
PC D2
Pedro Carbo 1 x 10-8
3
PC D3
Pedro Carbo 1 x 10-10
4
IA D1
Isidro Ayora 1 x 10-6
5
IA D2
Isidro Ayora 1 x 10-8
6
IA D3
Isidro Ayora 1 x 10-10
7
Km D1
Kilómetro 20 1 x 10-6
8
Km D2
Kilómetro 20 1 x 10-8
9
Km D3
Kilómetro 20 1 x 10-10
10
EELS D1
Estación Experimental Litoral Sur 1 x 10-6
11
EELS D2
Estación Experimental Litoral Sur 1 x 10-8
12
EELS D3
Estación Experimental Litoral Sur 1 x 10-10
13
EA D1
El Azúcar 1 x 10-6
14
EA D2
El Azúcar 1 x 10-8
15
EA D3
El Azúcar 1 x 10-10
16
RV D1
Río Verde 1 x 10-6
17
RV D2
Río Verde 1 x 10-8
18
RV D3
Río Verde 1 x 10-10
19
Timorex
Timorex (dosis comercial)
20
Testigo
Sin aplicación
11
Diseño experimental
Para la identificación de las cepas de hongos antagonistas se utilizó
estadísticas descriptivas como barras de frecuencias.
El porcentaje de germinación del antagonista y de A. solani se usó un
diseño completamente al azar con arreglo factorial A x B + 2. Se usaron cinco
repeticiones.
El esquema del Andeva fue el siguiente:
Fuente de variación
Grados de libertad
Total (tr-1)
99
Repeticiones (R-1)
4
Tratamientos (T-1)
19
Factor A (cepas antagonista) (C-1)
5
Factor B (Dosis antagonista) (B-1)
2
Interacción (C-1 x D-1)
10
Factorial vs. Testigos
2
Error experimental (T (r-1))
80
La comparación de las medias se realizó con la prueba de rangos múltiples
de
Duncan p = 0.05
b. Invernadero
Con los antagonistas se procedió a efectuar pruebas de invernadero.
Inoculación del fitopatógeno
Plántulas de tomate de los cultivares Miramar y Floradade de siete días
después del transplante fueron inoculadas con A. solani. Para este propósito
se realizó una suspensión de crecimiento micelial del hongo con agua
destilada estéril, ésta se asperjo con un atomizador manual, luego se
mantuvieron con humedad ambiental que para el efecto colocó un
humificador dos horas en la mañana y dos en la tarde.
12
Efecto de seis cepas de hongos antagonistas sobre A. solani
En macetas con capacidad de 8 kg de suelo se sembraron semillas de
tomate de los cultivares Miramar y Floradade, las que se inocularon con el
fitopatógeno y después de una semana se aplicó el antagonista. La dosis
utilizada en cada cultivar fue 1 x 1010 esporas por mililitro.
Para preparar la solución de los antagonistas se tomó crecimiento
micelial de cada uno de ellos y diluyó en agua destilada estéril y con la ayuda
de una cámara de Neubauer se contaron el número de esporas, luego se
formuló de acuerdo a la concentración requerida. Las aspersiones se
realizaron con los primeros síntomas visibles de la enfermedad y se aplicaron
con un atomizador manual.
Tratamientos y diseño experimental.
En el cultivar Floradade se evaluaron seis cepas de antagonistas y cada
una constituyó un tratamiento y se incluyeron dos testigos: un comercial
(Timorex) y un absoluto, lo que totalizó ocho tratamientos y fueron los
siguientes:
1. Cepa Pedro Carbo
2. Cepa Isidro Ayora
3. Cepa EELS
4. Cepa Km 20
5. Cepa Río Verde
6. Cepa El Azúcar
7. Testigo químico
8. Testigo absoluto
Se utilizó un Diseño Completamente al Azar con 5 unidades experimentales
(macetas). El esquema del análisis de varianza fue el siguiente:
Fuente de variación
Grados de libertad
Total
39
Tratamientos
7
Error experimental
32
Para la comparación de la medias se utilizaron la prueba de rangos múltiples de
Duncan p = 0.05
13
En el cultivar Miramar no se incluyeron las cepas El Azúcar y Río
Verde, debido a la escasa semilla y solo tuvo seis tratamientos incluidos los
testigos comercial y absoluto; se usaron 5 macetas por tratamiento. El
esquema del análisis de varianza fue el siguiente:
Fuente de variación
Grados de libertad
Total
30
Tratamientos
5
Error experimental
25
Para la comparación de la medias se utilizaron la prueba de rangos múltiples
de Duncan p = 0.05
Con los datos de temperatura y humedad relativa se hicieron
correlaciones con los porcentajes de foliolos afectados por A. solani en los
cultivares Floradade y Miramar.
3.5. Variables registradas
a. Microorganismos antagonistas.
Se registraron cada uno de los antagonistas en muestras
procedentes de campos productores de tomate en las provincias de
Guayas y Santa Elena.
b. Inhibición del crecimiento micelial
Se determinó el crecimiento micelial del fitopatógenos y del
antagonista cada 24 horas y se determinaron en porcentaje.
c. .Inhibición de tubos germinativos
A las 24 horas después de efectuar la liberación de las esporas se
contó el número de esporas y de ellas el número que germinaron. Esta
información se expresó en porcentaje.
14
d. Incidencia y severidad
En condiciones de invernadero se contaron el número de plantas
con síntomas de la enfermedad. Para severidad se utilizaron la escala
de Horsfall-Barratt modificada por Large (1996), donde:
0 = planta sana,
1 = 0 – 1 % de área foliar afectada,
2 = 1 – 3 %,
3 = 3 - 9 %,
4 = 9 – 24 %,
5 = 24 – 50 %
6 = 50 – 76 %,
7 = 76 – 91 %,
8 = 91 – 99 % del área foliar afectada y
9 = planta muerta.
e. Temperatura y humedad relativa
Se registraron la temperatura (ºC) y humedad relativa (%). Para
este propósito se instaló un Higrotermógrafo en el invernadero.
15
IV. RESULTADOS
4.1.
Identificación de hongos antagonistas de Alternaria solani
Mediante el análisis de secuencias de regiones ITS1 e ITS2 de los genes rRNA
(18S y 28S) las cepas de Isidro Ayora, El Azúcar y Río Verde fueron identificadas
como Trichoderma asperellum, la cepa Km 20 como Hypocrea lixii (teleomorfo de
Trichoderma harzianum); las cepas EELS y Pedro Carbo no fueron identificadas
(Cuadro 2) debido a la variabilidad en su secuencia (Anexo 4).
Cuadro 2. Identificación de hongos antagonistas de A. solani. 2011.
Cepa
Microorganismo identificado
Pedro Carbo (Guayas)
No identificada
Isidro Ayora (Guayas)
Trichoderma asperellum
EELS (Guayas)
No identificada
Km 20 (Guayas)
Hypocrea lixii (Teleomorfo de T. harzianum)
Río Verde (Santa Elena)
Trichoderma asperellum
El Azúcar (Santa Elena)
Trichoderma asperellum
4.2.
Pruebas de eficacia de seis cepas de hongos antagonistas de A. solani
a. Laboratorio
Confrontación de seis cepas de hongos antagonistas
Las seis cepas de hongos antagonistas confrontadas frente a A. solani,
todas mostraron su máximo crecimiento a las 48 horas de iniciado el estudio,
las cepas de mayor crecimiento fueron El Azúcar y EELS con 30,65 y 30,55
en su orden (Cuadro 3).
16
Cuadro 3. Confrontación de seis cepas de Trichoderma frente a Alternaria
solani en condiciones de laboratorio. INIAP, EELS, 2011.
Tiempo
Horas
Pedro Carbo Isidro Ayora
EELS
KM 20
Río Verde
Anta Alter
Anta Alter
Anta Alter
Anta Alter
24
5,80
6,23
4,30
0,25 14,10
0,00
48
21,48
3,05 23,38
3,13 30,55
2,20 26,30
72
21,48
2,83 24,00
2,68 21,25
96
20,75
2,65 20,33
120
8,50
0,90
El Azúcar
Anta
Alter
Anta
Alter
9,85
1,40
6,25
1,25
3,70 26,05
4,05 30,65
3,35
3,20 22,40
3,95 23,95
4,20 26,85
4,30
1,73 16,80
2,45 13,25
2,25 10,80
2,15 10,75
1,10
5,95
0,83 11,55
1,10
0,60 11,75
1,75
0,75
Total 78,01 11,33 79,89
Anta = Antagonista
Alter = Alternaria
9,70 84,45
9,20 85,00 10,50 82,40 13,55 83,10 10,75
1,90
1,33
8,95
8,60
Porcentaje de germinación de las cepas de hongos antagonista y de A.
solani
En cepa Km 20 tuvo el mayor porcentaje de germinación del antagonista
en las tres dosis, seguido de la cepa EELS en las dos dosis 1 x10-8 y 1 x 10 -10,
los menores valores fueron para las cepas río Verde y El Azúcar.
Los menores porcentajes de esporas de A. solani germinada fueron en las
cepas EELS y Río Verde (Cuadro 4).
Cuadro 4. Porcentaje de germinación de seis antagonistas y de A. solani.
INIAP, EELS, 2011.
Porcentaje de germinación
Antagonistas
Alternaria solani
-6
-8
-10
10
10
10
10-6
10-8
10-10
Cepas
Pedro Carbo
Isidro Ayora
Km 20
EELS
El Azúcar
Río Verde
Timorex*
Testigo
absoluto**
C. V. (%)
60,00
22,00
100,00
65,00
8,33
24,71
86,00
47,00
100,00
97,00
15,79
26,07
1,13
*solo se usó la dosis comercial
**sin aplicación
17
54,00
98,00
100,00
100,00
28,20
23,13
14,90
15.00
37,16
15,25
27,86
10,82
40,00
20,00
37,60
15,00
26,11
10,25
50
85
3,02
40,00
20,00
38,20
15,00
26,40
18,89
Las interacciones entre las cepas y dosis muestran que, la cepa Km 20 en
las tres dosis tuvieron el mayor porcentaje de germinación e igual a las dosis
mayores de la cepa EELS (Figura 1).
Figura 1. Interacción del porcentaje de germinación de seis cepas de
antagonistas en condiciones de laboratorio, INIAP, EELS, 2011.
Las interacciones entre cepas y la germinación de esporas A. solani
muestran que la cepa Km 20 en las tres dosis tuvo los valores más altos; los
menor es porcentajes de germinación fue con la cepa Río Verde en las dosis
más bajas (Figura 2).
Figura 2. Porcentaje de germinación de A. solani frente a seis cepas de
antagonistas en condiciones de laboratorio, INIAP, EELS, 2011.
18
Inhibición de tubos germinativos y daños en esporas de A. solani por
efecto de los antagonistas.
El efecto de las cepas del antagonistas sobre las esporas de A. solani no
mostraron interacción entre las dosis, solamente entre cepas, por lo que se
analizaron entre ellas tomando a las dosis como repeticiones. La cepa de El
Azúcar fue la de
menor efecto con 43,76% de esporas sin daños y
estadísticamente diferente; las cepas Pedro Carbo e Isidro ayora tuvieron los
menores valores y fueron iguales entre sí (Cuadro 5).
Cuadro 5. Porcentaje de esporas de A. solani sin daños al ser tratadas por
antagonistas en condiciones de laboratorio. INIAP, EELS, 2011.
Cepas
Pedro Carbo
Isidro Ayora
EELS
Km 20
El Azúcar
Río verde
C.V. (%)
1x 10
6
4,65
1,45
2,90
0,00
31,19
8,33
Dosis
1x 10 8
1x 1010
Promedio
100,00
85,00
100,00
63,00
73,89
92,52
0,00
20,00
15,00
46,00
26,19
13,33
34,88 b1/
35,48 b
39,30 ab
36,33 ab
43,76 a
38,06 ab
12,12
1/
Cifras de las columnas con la (s) misma (s) letra (s) son iguales estadísticamente de
acuerdo a la prueba de rangos múltiples de Duncan P=0,05
El efecto de las cepas de antagonistas y sus dosis sobre esporas de A.
solani deshidratadas mostraron interacciones. Las cepas Isidro Ayora y Río
Verde tuvieron los mayores porcentajes de esporas deshidratadas (Figura 3).
Figura 3. Porcentaje de esporas de A. solani deshidratadas por efecto de seis
cepas de antagonistas en condiciones de laboratorio, INIAP, EELS,
2011.
19
b. Invernadero
El efecto de seis cepas de hongos antagonistas de A. solani en el
cultivar Floradade muestran un comportamiento variable durante la
evaluación; en las cepas El Azúcar y Río Verde aunque se notó reducción
del porcentaje de foliolos infectados, tuvieron los mayores valores, en la
primera con 10,77%, la segunda con 9,33 fue igual estadísticamente al
testigo absoluto. Las cepas de menor valor fueron la cepa Pedro Carbo
con 2,94% diferente de las demás, seguida de la cepa EELS con 3,12%
igualmente diferente estadísticamente. Los mayores porcentajes fueron
con las cepas de El Azúcar, Río Verde y el testigo absoluto siendo estos
dos últimos iguales entre (Cuadro 6).
Cuadro 6. Porcentaje de foliolos con A. solani en el cultivar Floradade
en condiciones de invernadero. INIAP, EELS, 2011.
Fechas
Pedro Isidro
EELS
Carbo Ayora
Cepas
Km
El
Río
Timorex Testigo
20 Azúcar Verde
14-jun 3,09
6,27
2,97
2,73
24,02
18,62
2,43
6,16
21-jun 1,94
3,76
3,53
4,44
7,10
7,48
2,45
5,30
28-jun 2,45
3,78
3,64
4,19
5,98
6,31
2,10
6,10
05-jul
4,26
2,74
2,36
3,20
5,98
4,91
12,23
19,60
Media
2,94 g
4,14 d
3,12 f
3,64 e 10,77 a
9,33b
4,80 c
9,29b
C.V.
2,19 %
1/
Cifras de las columnas con la (s) misma (s) letra (s) son iguales estadísticamente de
acuerdo a la prueba de rangos múltiples de Duncan P=0,05
En efecto de cuatro cepas de antagonistas de A. solani en el cultivar
Miramar durante las evaluaciones muestran reducción del porcentaje de
foliolos afectados por el patógeno. En el porcentaje promedio general se
observa diferencias significativas entre tratamientos, siendo las cepas de
Pedro Carbo e Isidro Ayora la de mayor valor con 10,68 y 10,43% en su
orden, mismas que fueron iguales estadísticamente entre sí; la cepa EELS
con 7,10 y el tratamiento testigo comercial con 7,54 tuvieron los menores
valores e iguales entre sí (Cuadro 7).
20
Cuadro 7. Porcentaje de foliolos con A. solani en el cultivar Miramar en
condiciones de invernadero. INIAP, EELS, 2011.
Fechas
14-jun-11
21-jun-11
28-jun-11
05-jul-11
Promedio
C.V.
Pedro
Carbo
21,71
5,15
4,61
10,26
10,43 a
4,26%
Cepas
EELS
Km 20
Isidro
Ayora
23,94
5,63
5,08
8,08
10,68 a
22,30
2,79
3,00
0,33
7,10 c
Timorex
Testigo
20,13
2,34
2,11
5,60
7,54 c
21,24
2,48
3,08
8,28
8,77 b
25,29
3,60
4,32
2,81
9,01 b
1/
Cifras de las columnas con las misma letra son iguales estadísticamente de acuerdo a la
prueba de rangos múltiples de Duncan P=0,05
4.3.
Datos climáticos
Los promedios de temperatura mínima durante el experimento fluctuaron
entre 19,92 y 28,00 ºC y la máxima 29,67 y 42,42 ºC; la humedad relativa
mínima 29,71 y la máxima 69,64% (Cuadro 8). La ecuación de la regresión
entre los tratamientos de los cultivares Floradade y Miramar con las variables
de temperatura y humedad relativa mostraron en la mayoría significancia.
Cultivar Floradade
La cepa Pedro Carbo con la temperatura mínima (Figura
4A) y la
humedad relativa (Figura 4B) tuvieron efecto sobre el incremento del
porcentaje de foliolos infectados por A. solani; los valores de la relación
cuadrática fueron r2 = 1 y r2=-0,98, en su orden.
14
y = 588,01 - 50,41 + 1,08
r2 = 1,00
12
y = 917,68 - 31,09 + 0,26
r2 = 0,98
12
% foliolos afectados por A. solani
% foliolos afectados por A. solani
14
10
8
6
4
A
2
10
8
6
4
2
B
0
0
-2
22
23
24
25
26
27
Temperatura mínima (ºC)
54
56
58
60
62
64
66
68
Humedad Relativa (%)
Figura 4. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B)
con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el
antagonista cepa Pedro Carbo. INIAP, EELS, 2011.
21
Cuadro 8. Datos de temperatura y Humedad Relativa durante el estudio en
condiciones de invernadero. INIAP, EELS, 2011.
SEMANAS
TEMPERATURA (ºC)
HUMEDAD RELATIVA (%)
máxima
Mínima
media
máxima
mínima
media
2 - 9 abril
29,07
19,92
24,50
63,42
29,71
46,57
10 - 16 abril
40,79
27,29
34,04
89,29
42,57
65,93
17 - 23 abril
40,86
27,21
34,04
77,71
36,43
57,07
24 - 30 abril
39,50
28,00
33,75
60,29
44,57
52,43
1 - 7 mayo
41,93
27,71
34,82
60,00
37,57
48,79
8 - 14 mayo
39,64
27,36
33,50
60,43
40,71
50,57
15 - 21 mayo
41,79
26,43
34,11
63,00
35,57
49,29
22 - 28 mayo
42,42
25,86
34,14
64,43
33,57
49,00
29 mayo - 4 de junio
38,14
26,21
31,18
67,00
45,43
56,21
5 junio - 11 junio
37,29
22,29
31,57
68,86
41,29
55,07
12 - 18 junio
33,46
24,25
28,86
55,00
71,00
63,00
19 - 25 junio
29,64
22,50
26,07
62,29
49,86
56,07
26 junio - 2 julio
33,64
26,43
30,04
73,00
59,43
66,21
3 - 9 julio
35,42
25,93
30,68
73,71
53,43
53,57
10 - 16 julio
31,64
25,64
28,64
75,57
63,71
69,64
17 - 23 julio
34,57
26,50
30,54
75,29
58,43
66,86
24 - 30 julio
33,14
25,79
29,46
76,43
57,14
66,79
31 julio - 6 agosto
33,50
24,64
29,07
78,00
56,14
67,07
7 - 13 agosto
34,71
25,71
30,21
76,28
49,57
62,93
14 - 20 agosto
34,86
25,00
29,93
76,43
49,00
62,71
21 - 27 agosto
28 agosto - 3
septiembre
33,64
25,00
29,61
72,86
47,43
60,14
34,29
24,50
29,39
77,29
51,57
64,43
Media general
35,10
24,68
29,94
68,72
45,40
56,60
La cepa Isidro Ayora muestra un comportamiento similar tanto con la
temperatura mínima (Figura
5A) y humedad relativa (Figura 5B) sobre el
22
incremento de los porcentajes de foliolos infectados por A. solani. Los valores
de la relación cuadrática fueron r2=0,99 y 0,97, respectivamente.
25
22
y = 943,76 - 80,18 + 1,71
r2 = 0,99
18
% foliolos afectados por A. solani
% foliolos afectados por A. solani
20
16
14
12
10
8
6
A
4
y = 1372,84 - 46,30 + 0,39
R2 = 0,97
20
15
10
5
0
B
2
22
23
24
25
26
54
27
56
58
Temperatura mínima (ºC)
60
62
64
66
68
Humedad Relativa (%)
Figura 5. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con
el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el
antagonista cepa Isidro Ayora. INIAP, EELS, 2011.
La cepa EELS en las dos variables climáticas mostró disminución en el
porcentaje de foliolos afectados por A. solani; la temperatura superior a 23 ºC
(Figura 6A) y más de 56 % tiende a decrecer la enfermedad (Figura 6B); los
valores de la relación fueron r2=0,51 y 0,56 en su orden.
25
y = 1043,22 - 82,30 + 1,62
r2 = 0,51
20
% foliolos afectados por A. solani
% foliolos afectados por A. solani
25
15
10
A
5
0
y = 1016,62 - 32,30 + 0,26
r2 = 0,56
20
15
10
B
5
0
-5
-5
22
23
24
25
26
27
Temperatura mínima (ºC)
54
56
58
60
62
64
66
68
Humedad Relativa (%)
Figura 6. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con
el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el
antagonista cepa. EELS, INIAP, 2011.
La cepa Km 20 mostró disminución del porcentaje de foliolos infectados por
A. solani a 24 ºC (Figura 7A), similar comportamiento la humedad relativa con
más de 58 % (Figura 7B); los valores de la relación cuadrática fueron r2= 0,50 y
0,57 respectivamente.
23
30
y = 1287,82 - 102,36 + 2,03
r2 = 0,50
25
% foliolos afectados por A. solani
%foliolos afectados por A. solani
30
20
15
A
10
5
0
25
y = 1300,33 - 41,65 + 0,33
r2 = 0,57
20
15
B
10
5
0
-5
-5
22
23
24
25
26
54
27
56
58
Temperatura mínima (ºC)
60
62
64
66
68
Humedad Relativa (%)
Figura 7. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B)
con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el
antagonista cepa Km 20. INIAP, EELS, 2011.
La cepa El Azúcar con temperaturas entre 24 y 25 ºC muestran los mayores
porcentajes de foliolos infectados por A. solani (Figura 8A), mientras que la
humedad relativa fue 60 a 62 % (Figura 8B); los valores de la relación
cuadrática fueron r2=0,91 y 0,77 en su orden.
26,0
26,0
% foliolos afectados por A. solani
25,6
% foliolos afectados por A. solani
y = - 148,55 + 14,18 - 0,20
r2 = 0,91
25,8
25,4
25,2
25,0
24,8
24,6
24,4
A
24,2
y = - 144,60 + 5,57 - 0,05
r2 = 0,77
25,5
25,0
24,5
B
24,0
24,0
23,8
23,5
22
23
24
25
26
27
54
Temperatura mínima (ºC)
56
58
60
62
64
66
68
Humedad Relativa (%)
Figura 8. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con
el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el
antagonista cepa El Azúcar, INIAP, EELS, 2011.
La cepa Río Verde con temperaturas superior a 25 ºC y humedad relativa
superior a 62 % tiende a decrecer el porcentaje de foliolos infectados por A.
solani, los valores de la relación cuadrática fueron r2=0,47 y 057 en su orden
(Figura 9 A y B).
24
66
66
y = - 727,26 + 63,54 - 1,27
r2 = 0,47
64
% foliolos afectados por A. solani
% foliolos afectados por A. solani
64
62
60
58
A
56
54
52
y = -777,84 + 27,25 - 0,22
r2 = 0,57
62
60
58
56
B
54
52
50
50
22
23
24
25
26
27
54
56
58
Temperatura mínima (ºC)
60
62
64
66
Humedad Relativa (%)
Figura 9. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con
el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el
antagonista cepa Río Verde, INIAP, EELS, 2011.
El testigo químico tanto con la temperatura y humedad relativa (Figura 10
A y B) tuvieron el mismo comportamiento con respeto a la disminución de los
porcentajes de foliolos infectados por A. solani; los valores de la relación fueron
r2=0,40 y 0,53 en su orden. El testigo absoluto mostró el mismo comportamiento
(Figura 11 A y B) y los valores de la relación cuadrática fueron r2=0,43 y 0,58
respectivamente.
25
y = 1275,63 - 103,04 + 2,08
r2 = 0,40
20
% foliolos afectados por A. solani
% foliolos afectados por A. solani
25
15
10
5
0
A
y = 1446,60 - 47,12 + 0,38
r2 = 0,53
20
15
10
5
0
B
-5
22
23
24
25
26
27
Temperatura mínima (ºC)
54
56
58
60
62
64
66
68
Humedad Relativa (%)
Figura 10. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con
el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con Timorex
INIAP, EELS, 2011.
25
68
25
y = 1506,47 - 122,34 + 2,48
r2 = 0,43
20
% foliolos afectados por A. solani
% foliolos afectados por A. solani
25
15
10
5
A
0
y = 1726,90 - 56,49 + 0,46
r2 = 0,58
20
15
10
5
0
B
-5
22
23
24
25
26
27
54
56
58
Temperatura mínima (ºC)
60
62
64
66
68
Humedad Relativa (%)
Figura 11. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con
el porcentaje de foliolos afectados por A. solani en el testigo absoluto,
INIAP, EELS, 2011.
Cultivar Miramar
La cepa Pedro Carbo con temperatura superior a 25 ºC mostró incremento
del porcentaje de foliolos infectados por A. solani (Figura 12A), igualmente con
la humedad relativa mayor a 62 % (Figura 12B); los valores de la relación
cuadrática fueron r2= 0,94 y 0,99, en su orden.
4,5
y = 223,74 - 18,54 + 0,39
r2 = 0,94
4,0
% foliolos afectados por A. solani
% foliolos afectados por A. solani
4,5
3,5
3,0
2,5
2,0
A
1,5
y = 280,39 - 9,31 + 0,08
r2 = 0,99
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
B
1,0
22
23
24
25
26
27
Temperatura mínima (oC)
54
56
58
60
62
64
66
68
Humedad Relativa (%)
Figura 12. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con
el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el
antagonista cepa Pedro Carbo, INIAP, EELS, 2011.
La cepa Isidro Ayora con temperatura superior a 24 ºC disminuyó el
porcentaje de foliolos infectados por A. solani (Figura 13A), igualmente con la
humedad relativa alta (Figura 13B); los valores de la relación cuadrática fueron
r2=0,61 y 0,62 en su orden.
26
6,5
6,0
% foliolos afectados por A. solani
5,5
y = 68,85 - 1,94 + 0,01
r2 = 0,62
6,0
y = 94.61 - 6,89 + 0,13
r2 = 0,61
5,0
4,5
4,0
3,5
A
5,5
5,0
4,5
4,0
B
3,5
3,0
3,0
2,5
2,5
22
23
24
25
26
27
54
56
58
Temperatura mínima (oC)
60
62
64
66
68
Humedad Relativa (%)
Figura 13. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B)
con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el
antagonista cepa Isidro Ayora, INIAP, EELS, 2011.
La cepa EELS cuando la temperatura y humedad relativa son mayores a
º
24 C y 60 % en su orden disminuyen del porcentaje de foliolos infectados
por A. solani (Figura 14A y B); Los valores de la relación cuadrática fueron
r2= 0,84 y 0,94 respectivamente.
4,2
3,8
y = - 143,31 + 4,93 - 0,04
r2 = 0,94
4,0
% foliolos afectados por A. solani
3,6
% foliolos afectados por A. solani
% de foliolos afectados por A. solani
6,5
3,4
y= -99,20 + 8,65 - 0,18
r2 = 0,84
3,2
3,0
A
2,8
2,6
2,4
3,8
3,6
3,4
3,2
B
3,0
2,8
2,6
2,4
2,2
2,2
22
23
24
25
26
27
Temperatura mínima (ºC)
54
56
58
60
62
64
66
68
Humedad Relativa (%)
Figura 14. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B)
con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el
antagonista cepa EELS, INIAP, EELS, 2011.
La cepa Km 20 con temperatura mayor a 24 ºC y humedad relativa mayor
a 60 % muestran disminución del porcentaje de foliolos infectados por A.
solani,
los valores de la relación cuadrática fueron r2= 0,61 y 0,79
respectivamente (Figura 15A y B).
27
5,5
5,0
% foliolos afectados por A. solani
% foliolos afectados por A. solani
y = -180,13 + 15,19 -0,31
r2 = 0,62
4,5
4,0
3,5
3,0
A
y = 214,82 + 7,25 -0,06
r2 = 79
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
B
2,5
2,5
22
23
24
25
26
54
27
56
58
Temperatura mínima (ºC)
60
62
64
66
68
Humedad Relativa (%)
Figura 15. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B)
con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el
antagonista cepa Km 20, INIAP, EELS, 2011.
Los testigos químico (Figura 16A y B) y absoluto (Figura 16 C y D) en
el cultivar Miramar tanto con la temperatura y humedad relativa mostraron el
mismo comportamiento con respeto a la disminución de los porcentajes de
foliolos infectados.
25
y = 942,26 -74,48 + 1,48
r2 = 0,42
25
% foliolos afectados por A. solani
% foliolos afectados por A. solani
30
20
15
A
10
5
y = 306,16 - 10,95 + 0,10
r2 = 0,97
20
15
B
10
5
0
0
22
23
24
25
26
27
40
45
Temperatura mínima (ºC)
20
55
60
20
18
18
y = 502,49 - 38,75 + 0,75
r2 = 0,45
16
% foliolos afectados por A, solani
% foliolos afectados por A. solani
50
Humedad Relativa (%)
14
12
10
8
C
6
y = 504,64 - 15,72 + 0,12
r2 = 0,49
16
14
12
10
D
8
6
4
4
22
23
24
25
26
27
Temperatura mínima (ºC)
54
56
58
60
62
64
66
68
Humedad Relativa (%)
Figura 16. Relación cuadrática de la temperatura y humedad relativa con el
porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con Timorex
(A y B) y Testigo absoluto (C y D), INIAP, EELS, 2011.
28
V. DISCUSIÓN
Identificación de antagonistas de A. solani
La identificación de T. asperellum en tres muestras de follaje de tomate en
campos de Guayas y Santa Elena indican que esta especie está presente en forma
nativa, pues coincide con los resultados de Capuz (2009) quien la reporta en
muestras de suelo cultivado con tomate, pimiento y sandía; aisladas a partir de
muestras de la rizósfera en campos hortícolas de estas dos provincias. Con
respecto a Hypocrea lixii (teleomorfo de T. harzianum) en Ecuador hasta ahora
no existe ningún reporte de ésta especie como antagonista de Alternaria solani
en el cultivo de tomate; en México los estudios de Aceves et al. (2008)
mencionan que en aislados de suelos se identificaron varias especies de
Trichoderma entre ellas T. harzianum, T. longibrachiatum y T. koningii, mismas
que fueron seleccionadas por su efecto antagónico contra A. solani.
Pruebas de eficacia antagonistas
La inhibición del crecimiento micelial de A. solani fue aproximadamente en
un relación 8:1 con respecto al antagonista, sin embargo, las cepas EELS y Km
20 fueron las de mayor crecimiento numérico; resultados similares obtuvieron
Michel-Aceves et al. (2008). El mayor crecimiento micelial de la cepa Km 20
con respecto a las demás por tratarse de T. harzianum coincide con lo reportado
por Torres, Iannacone y Gómez (2008); además, mencionan que esta especie fue
similar a T. viride a las 120 horas.
Con respecto al porcentaje de esporas de A. solani deshidratadas por efecto
de seis cepas antagonistas muestran que la Río Verde en las tres dosis evaluadas
tuvo el mismo comportamiento, seguido de la cepa Isidro Ayora con las dos
primeras dosis, posiblemente se deba al efecto de micoparasitismo o de
antibiosis, pues, Torres, Iannacone y Gómez (2008) mencionan que ciertas
especies de Trichoderma ejercen sobre el patógeno tres tipos fundamentales
como son competencia directa por espacio y nutrientes, producción de
metabolitos antibióticos de naturaleza volátil o no y parasitismo directo.
29
En condiciones de invernadero la cepa km 20 que es Hypocrea lixii
(teleomorfo de T. harzianum) que tuvo un mejor resultado con respecto al
porcentaje de foliolos afectados por A. solani, similar respuesta obtuvieron
Torres, Iannacone y Gómez (2008) quienes reportan que Trichoderma harzianum
fue más eficiente que las otras tres especies de Trichoderma debido que redujo la
severidad de la enfermedad.
En cuanto a la temperatura si bien, donde se efectuó el estudio la
temperaturas fluctuaron entre 24 y 35 °C, el análisis de la relación entre el
porcentaje de foliolos infectados por A. solani, muestran en los dos cultivares
similar comportamiento, pues la temperatura favorable para este patógeno es de
24 °C; mientras que óptima para el crecimiento de especies de Trichoderma
fluctúan entre 25 a 30 °C, como lo reportan Torres, Iannacone y Gómez (2008).
30
VI.
1.
CONCLUSIONES
Se identificaron en hojas de tomate a Hypocrea lixii que corresponde al
teleomorfo de T. harzianum en la muestra del km 20 y Trichoderma
asperellum de muestras de tomate de Isidro Ayora en la provincia de Guayas,
este último también en El Azúcar y Río Verde en Santa Elena; en las
muestras de Pedro
Carbo y EELS no se pudieron identificar debido a
posibles mezclas.
2.
En pruebas de antagonismo las cepas km 20 y EELS tuvieron el mejor efecto
sobre crecimiento micelial de A. solani, así como el mayor porcentaje de
germinación de las esporas.
3.
El daño más evidente de los hongos antagonistas sobre esporas de A. solani
fue la deshidratación lo que no le permitió una germinación normal
especialmente con la cepa Río Verde.
4.
En invernadero el cultivar Floradade los menores porcentajes de foliolos
infectados por A. solani fueron en los tratamientos con las cepas de
antagonistas de Pedro Carbo y EELS y el mayor con la de El Azúcar.
5.
En el cultivar Miramar los menores porcentajes de foliolos afectados por A.
solani fueron en los tratamientos EELS y testigo comercial.
6.
Las condiciones de temperatura y humedad relativa favorables para el
desarrollo de la enfermedad estuvieron entre 24 a 26 °C y 60 %.
31
VII.
RECOMENDACIONES
En base a los resultados se recomienda:
1. Realizar muestreos en otras áreas productoras de hortalizas para determinar si
existen otras cepas nativas con efecto antagónico sobre Alternaria solani.
2. Evaluar en condiciones de campo estas cepas de hongos antagonistas para
determinar dosis, frecuencias y épocas de aplicación.
32
VIII.
RESUMEN
El tizón temprano Alternaria solani en el cultivo de tomate es uno de los problemas
fitosanitarios de importancia, para su manejo los productores utilizan productos
químicos cuyos efectos repercuten en la salud de las personas y del ecosistema, por
lo que la búsqueda de agentes biocontroladores eficaces es necesaria. El presente
estudio tuvo los siguientes objetivos: 1) Identificar microorganismos antagonistas
que actúen en forma natural sobre fitopatógenos foliares en el cultivo de tomate y
2) realizar pruebas de eficacia de él o los antagonistas sobre fitopatógenos foliares
en condiciones de laboratorio e invernadero.
El muestreo se realizó en campos de productores de las provincias de Guayas y
Santa Elena. La identificación de los antagonistas se realizó mediante el método de
CTAB modificado para la extracción del ADN, se emplearon secuencias
espaciadoras interna transcritas del ADN ribosomal (ITS 1 e ITS2). Se identificó a
Trichoderma asperellum en las cepas Isidro Ayora, Río Verde y El Azúcar;
Hypocrea lixii en la Km 20, las cepas Pedro Carbo y EELS no fueron identificadas.
La prueba de patogenicidad consistió en confrontar micelio de A. solani y las cepas
de antagonistas, se evaluaron cada 24 horas hasta 120 horas. Las seis cepas
mostraron su máximo crecimientos a las 48 horas de iniciado el estudio, se
destacaron El Azúcar y EELS como las de mayor crecimiento.
Para determinar el efecto de las seis cepas de hongos antagonistas se utilizaron las
dosis 1x106, 1x108 y 1x1010 conidios/ml sobre la germinación de conidios de A.
solani, los tratamientos fueron tres dosis y seis cepas y dos testigos (químico y
absoluto) lo que totalizó 20, para el análisis de varianza se uso un DCA con arreglo
factorial A X B + 2. Se usaron cinco unidades experimentales. Las cepas EELS y
Río Verde tuvieron el mejor efecto sobre la germinación de A. solani, igualmente
los muestra la interacción; mientras que la inhibición de los tubos germinativos y
deshidratación de esporas fue con la cepa Río Verde.
En invernadero se usaron seis y cuatro cepas de antagonistas y dos testigos en los
cultivares Floradade y Miramar, totalizando ocho y seis tratamientos en su orden.
En Floradade los menores porcentajes de foliolos infectados por A. solani fueron
con las cepas Pedro Carbo y EELS y en Miramar la cepa EELS y testigo comercial.
La temperatura y humedad relativa favorable para el desarrollo de la enfermedad
fluctuó entre 24 y 26 ºC y 60% de humedad relativa.
33
IX. SUMMARY
The early blight of tomatoes Alternaria solani is one of the main phytosanitarian
problems, for its management the producers use chemical products that affect
people’s and ecosystem’s health, so the search of biocontrol agents is necessary. The
present research had the following objectives: 1) Identify microorganisms’
antagonists that will act in a natural form on phytopathogens of leaves in the tomato
crop and 2) Testing the efficacy of it or the antagonists on phytopathogens of leaves
in a laboratory or greenhouse conditions.
The sampling was performed in producing fields of Guayas and Santa Elena
province. The identification of the antagonists was realized through CTAB method
modified for the extraction of DNA, were used internal transcribed spacer sequences
of ribosomal DNA (ITS 1 e ITS2). Trichoderma asperellum in the Isidro Ayora, Río
Verde and El Azúcar strains was identified; Hypocrea lixii in the 20km, the Pedro
Carbo and EELS strains were not identified.
The pathogenicity test consisted in confront mycelium of A. solani and the
antagonists strains; they were evaluated every 24 hours to 120 hours. The six strains
showed their maximum growths on the 48 hours and El Azúcar and EELS were
highlighted as the fastest.
To determine the effect of the six antagonist strains, the doses 1x106, 1x108,
1x1010 conidia/ml on the conidia germination of A. solani were used, the treatments
were three doses, six strains, and two controls (chemical and absolute) that totalized
20, for the variance analysis was used an DCA with A X B + 2 factorial arrangement.
There were used five experimental units. The EELS and Rio Verde strains had the
best effect on the A. solani germination, also shows the interaction, whereas
inhibition of germ tubes and spore dehydration was with the Rio Verde strain.
In the greenhouse were used six and four antagonist strains and two controls in the
Floradade and Miramar crops, totalizing eight and six treatments in their order. In
Floradade the minor percentages of infested leaves by A. solani were Pedro Carbo
and EELS strains, and in Miramar the EELS strain and the comercial control. The
temperature and the relative moisture favorable for the disease development ranged
between 24 and 26°C and 60% of the relative moisture.
34
X. BIBLIOGRAFÍA
AGRIOS, G. N. 2004. Fitopatología. México. Limusa S.A. p 358.
BENITEZ, T.; RINCÓN, A.; LIMÓN, M.; CODÓN, A. 2004. Mecanismos de
Biocontrol de cepas de Trichoderma. Rev. International Microbiology. V.7 n.4.
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diciembre del 2011.
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36
ANEXO
37
Anexo 1. Esquema de la disposición de los tratamientos
38
Anexo 2. Confrontación de antagonistas vs. Alternaria solani in vitro. 2011
Anexo 3. Esporas normales (A) y deshidratadas (B) de Alternaria solani por efecto
de hongos antagonistas en condiciones de invernadero. 2011.
B
A
39
Anexo 4. Identificación molecular de las cepas de antagonistas
Guayaquil, 29 de noviembre del 2011
Ing. Leticia Vivas
INIAP - Estación Experimental Boliche
DIRECCIÓN: Km 26 Vía Durán -Tambo
Mariuxi Molina
Estudiante de la Universidad de Guayaquil
Objeto: Identificación molecular en 6 cepas de hongos.
1- Extracción del ADN cromosómico.
2- Amplificación mediante PCR de diferentes regiones genómicas, dependiendo de la naturaleza del
agente a identificar. Para la identificación de hongos, se trabajo sobre las secuencias espaciadoras
internas transcritas del ADN ribosomal (ITS1 y ITS2).
3- Purificación de los amplicones
4- Secuenciación
5- Análisis de las secuencias en bancos de datos (GenBank, EMBL etc…), mediante alineamiento de
homología usando el BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), alineamiento y árbol filogenético
mediante el programa MEGA4 y CLUSTALW.
6- Entrega del informe.
Por medio de la presente, le hago entrega del informe correspondiente al análisis molecular para la
identificación de las cepas hongos entregadas.
Agradeciendo por su interés en nuestros servicios, quedo de Ud., para cualquier información adicional
que se requiera.
Atentamente,
Emmerik Motte, Ph.D.
Director de Investigación
Conceptazul S.A. Cdla. Vernaza Norte, Mz. 10, V. 34, Box 09 02 142 A, G UAYAQUIL – ECUADOR
Telefax: (593 04) 2 284 066 - 2 284 615 / email: [email protected]
40
Identificación molecular de cepas de Hongos
Objetivo.
Identificación molecular de 6 cepas de hongos aislados en el INIAP- Estación experimental Boliche,
correspondiente a un trabajo de Tesis con la Facultad de Biología de la Universidad de Guayaquil.
Metodología.
Cepas.
Fueron entregadas por el INIAP las cepas de hongos INI-AZ (El Azúcar), INI-EELS, INI-IA, INI-KM
(Km200), INI-PC, INI-RV (Río Verde).
Extracción de ADN.
Para las cepas bacterianas obtenidas se procedió a extraer su ADN genómico mediante los protocolo
para bacterias “TENS” y .para hongos se empleo el método de CTAB modificado permitiendo así la
extracción del ADN correspondiente.
Amplificación por PCR.
Para la identificación de hongos, se trabajo sobre las secuencias espaciadoras internas transcritas del
ADN ribosomal (ITS1 y ITS2).
Secuenciación y análisis de secuencias.
Las secuencias fueron purificadas mediante el Wizard PCR Clean Up System de Promega y enviadas
a secuenciar. El alineamiento de las secuencias se realizó empleando el software online Blast (Basic
Local Alignment Search Tool), se determinó la homología mediante comparación de las secuencias en
el GenBank, y se desarrollo la construcción de arboles filogenéticos de acuerdo a la homología
mediante el programa Mega 4 y CLUSTALW.
Resultados.
Las secuencias amplificadas presentaron fragmentos con su respectivo en tamaño.
Secuenciación.
Los productos de las regiones ITS amplificados para cada hongo fueron secuenciados y analizados en
los bancos de datos, obteniéndose los siguientes resultados:
Análisis de las cepas de hongos.
Analizando las secuencias de las regiones ITS1 e ITS2 de los genes rRNA (18S y 28S) se identifico
como Trichoderma asperellum las cepas AZ, IA y RV. La cepa RV sin embargo solo presento 92% de
identidad y a que la secuencia obtenida no era pura, lo cual indica que la muestra poseía más de un
tipo de hongo. La cepa KM fue identificada como Hypocrea lixii (teleomorfa de Trichoderma
harzianum). Las cepas EELS y PC no pudieron ser identificadas ya que las secuencias presentaron
demasiada variabilidad a lo largo de la secuencia, producto de una mezcla de cepas en la muestra.
Secuencias obtenidas con las diferentes cepas de Hongos:
>INI-AZ-ITS
CTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTAGGGGCCGGCACCCG
TGTGAGGGGTCCCGATCCCCAACGCCGATCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAA
ATGACGCTCGGACAGGCATCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAA
AGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTNATCGCATTTCGCTGC
GTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTGAAAGTTTTGATTCATTTT
GAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAAGAAATACGTCCGCGAGGGGACTACAGAAAGA
GTTTGGTTGGTTCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGG
CGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTG
TAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGA
41
INI-EELS-ITS
No interpretable…
>INI-IA-ITS
GAAACTTGGNTGTTTTACGGANGTGGGCGCGCCACGCTCCCGGTGCGAGTTGTG
CAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTAGGGGCCG
GCACCCGTGTGAGGGGTCCGATCCCCAACGCCGATCCCCCGGAGGGGTTCGAGG
GTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGAGCAATGT
GCGTTCAAAGATTCNATGATTCACTGAATTCTGCAATTACATTACTTATCGCATT
TCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGA
TTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAAGAAATACGTCCGCGAGGGGACTAC
GAAAGAGTTTGGTTGGTTCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTGCGACGCA
CCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTGGGTTTG
GGAGTTGTAAACTCGGTAAGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGA
>INI-KM-ITS
CATTTCAGANAGTTGGGTGTTTTACGGACGTGGACGCGCCGCGCTCCCGGTGCG
AGTTGTGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTC
GGGGCCGGCACCCGTGTGAGGGTCCCGATCCCCAACGCCGATCCCCCGGAGGGG
TTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGC
GCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCGCAATTCACATTACTTA
TCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAA
GTTTTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAGAAATACGTCCGCGAGGG
ACTACAGAAAGAGTTTGGTTGGTTCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTGC
GACGCACCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTG
GGTTTGGGAGTTGTAAACTGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGA
>INI-RV-ITS
No interpretable
42
>INI-RV-ITS
AGGTCACTTTCNGAANGTTGGTTGNTTTACGGACGTGGACGCGCCGCGCNNNANTTCCGA
GTTGTGCCNCTACTGCGCAGGAGAGGTTGCCGCTATACCGCCACTGTATTTANGGGCCGG
CACCCGTTGAGGGGTCCCTATCCCCCTCCCCGATCNCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAC
TGACGCTCGGACAGGTTTGCCCGCCAGAATACTGGNGGTCGCNATGTGCNTTCAAAGATT
CGATGATTCACTGATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGA
TGCCNGAACCAAGAGATCCGTTGTTCAAACTTTTGATTCCTTTTGAATTTTTGCTCAGAGC
TGTAAAGAAATANGTCCGNAGGGGACTACAGAAAGAGTTTGGTTGGTTCCTCCGGCGGG
CGCCTGGTTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGGGCGTGATCCCGCCGAGGCAACAGTTTGG
TAACGTTCACATTGNGTTTGGGAGTTGTAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCT
ACGGA
Dendrograma filogenético producto del alineamiento de las secuencias
Conclusiones
Los resultados permitieron identificar a Trichoderma asperellum como cepa dominante de las
muestras entregadas, con una alta homología entre AZ y KM, y una variante correspondiente a la cepa
IA. La cepa RV fue identificada como Hypocrea lixii asociado con Trichoderma harzianum. Las
secuencias KM y AZ comparten 99% de similitud, y a su vez tienen un 98% y 91% de similitud con
IA y RV respectivamente. IA y RV comparten un 94% de similitud.
Cdla. Vernaza Norte, Mz. 10, V. 34, Box 09 02 142 A, G UAYAQUIL – ECUADOR Telefax: (593 04) 2
284 066 - 2 284 615 / email: [email protected]
43