UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES ESCUELA DE BIOLOGÍA Propagación in vitro de la orquídea “Phalaenopsis violacea” a través de la vara floral. Diana Carolina Rojas Riera Tesis de Grado presentada como requisito para la obtención del título de Bióloga. GUAYAQUIL-ECUADOR 2014 DIANA CAROLINA ROJAS RIERA © DERECHO DE AUTOR II DIRECTOR DE TESIS ______________________________ Ing. Carlos Rolando Aguirre III UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES ESCUELA DE BIOLOGÍA CALIFICACIÓN QUE OTORGA EL TRIBUNAL QUE RECIBE LA SUSTENTACIÓN Y DEFENSA DEL TRABAJO INDIVIDUAL DE TITULACIÓN: TESIS Propagación in vitro de la orquídea “Phalaenopsis violacea” a través de la vara floral. Diana Carolina Rojas Riera PREVIO A OBTENER EL TÍTULO DE BIOLÓGA Miembros del tribunal Calificación Números y Letras Blga. Mónica Armas Soto MSc. Presidente del tribunal ------------------------------------------- Dra. Gladys Rodríguez de Tazan Miembro del tribunal ------------------------------------------- Blgo. Francisco Cornejo Sotomayor Miembro del tribunal ------------------------------------------- SUSTENTACIÓN Y DEFENSA DEL TRABAJO INDIVIDUAL DE TITULACIÓN REALIZADA EN LA SALA DE MAESTRÍA DE LA FACULTAD. FECHA: -------------------------------------------------------------------------.- CERTIFICO Ab. José Solórzano Cabezas Secretario de la Facultad IV DEDICATORIA Con mucho cariño dedico las páginas de esta Tesis que refleja el esfuerzo de muchos años de espera, a todos quienes me apoyaron constantemente con palabras de aliento para culminar una meta más en mi vida. A mi padre Sr. Aníbal Rojas que mientras estuvo con vida siempre depositó su confianza en mí, a mi madre Sra. Marie Riera que siempre ha sido una amiga incondicional, quien día a día me brinda su fe, amor y perseverancia, para ser en un futuro alguien mejor. A mis hijos, mis abuelitas Sra. Leonor Vélez, Sra. María Amari, que con sus bendiciones siempre me dan seguridad, que sin el apoyo de ellos, quizás no hubiese podido escribir esta dedicatoria. Y al resto de mi familia que aun iniciando mi carrera aseguraban que ya sabían el resultado. V AGRADECIMIENTO A Dios por darme fortaleza cada día de mi vida. Debo expresar mi gratitud a las personas que hicieron posible la realización de ésta investigación: A la Dra. Gladys Rodríguez de Tazan, por la ayuda y paciencia brindada durante el desarrollo de la experimentación. Al Dr. Carlos García, que con sus excelentes conocimientos me trasmitió la seguridad tanto personal como científica, para la realización de mi tesis. A la empresa AGROVITROPARIS, dirigido por la Ing. Agr. Laura Parismoreno Rivas, por la oportunidad de realizar el ensayo. VI RESUMEN El presente trabajo tiene como objetivo desarrollar la micropropagación de Phalaenopsis violacea mediante las técnicas de cultivo en la vara floral. Para obtener la formación de cuerpos protocórmicos, iniciando con el procedimiento de desinfección con la utilización de hipoclorito de sodio al 4% y tween 20% (2 gotas/100 ml). Se utilizaron 4 tipos de tratamientos: A, B, C, D, de los cuales el D presentó el 10% de contaminación, mientras que en el B el 25%, en el C el 40% y en el A el 50%. Los primeros cuerpos protocórmicos fueron observados a las siete semanas del cultivo, se evaluó el crecimiento y supervivencia. Para el análisis estadístico se realizó un diseño completamente al azar, mediante un análisis de varianza y la prueba de tukey. Los resultados obtenidos en esta investigación confirman que sí es posible la micropropagación de las varas florales en Phalaenopsis violacea. En el tratamiento D que es el medio de cultivo Vancin & Went con adición de agua de coco, se obtuvo las respuestas más favorables, con un 90% de supervivencia de acuerdo a las siguientes mediciones: Longitud del brote (2.9 cm), número de hojas (5), longitud de la raíz (1.6 cm). Los resultados muestran que hay diferencias significativas entre los diferentes tratamientos y que estos influyen de manera positiva en el crecimiento de las plántulas, ayudando en el desarrollo de las hojas y raíces. Palabras claves.- Ácido naftalénacético (ANA); bencil aminopurina (BAP); in vitro; orquídea; Phalaenopsis violacea. VII ABSTRACT The aim of the present work is to develop the microspreading of Phalaenopsis violacea by culture techniques from flowers buds. In order to obtaining the formation of protocormic bodies, as beginning of disinfection have been used sodium hypochlorite 4% and Tween 20% (2 drops / 100 ml). Four types of treatments have been used: A, B, C, D, of which D showed 10% of pollution, while 25% in B, 40% in C and 50% in A. The first protocormic bodies have been observed at seventh week of growing, survival and growth have been evaluated. For the statistical analysis was performed a completely randomized design using analysis of variance and tukey's test. The results obtained in this research confirmed that microspreading floral rod is possible Phalaenopsis violacea. In treatment D, that is the culture media of growing of Vancin & Went with addition of coconut water, was obtained the most favorable response with 90% survival, according to the following measurements: length of shoot (2.9 cm), number of leaves (5), root length (1.6 cm). The results have demonstrated that there are significant differences among the several treatments and that those perform a positively influences on seedling growth, allowing in the development of leaves and roots. Keywords-. Acid naphthalene acetic (NAA); benzyl aminopurine (BAP); in vitro; orchidaceae; Phalaenopsis violacea. VIII TABLA DE CONTENIDO RESUMEN .................................................................................................................................. vii ABSTRACT ............................................................................................................................... viii LISTA DE GRÁFICOS ................................................................................................................ x LISTA DE TABLAS .................................................................................................................... xi LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................ xiii 1. INTRODUCCIÓN............................................................................................................ 1 2. ANTECEDENTES .......................................................................................................... 3 3. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................ 7 4. HIPÓTESIS ..................................................................................................................... 8 5. OBJETIVOS .................................................................................................................... 9 5.1. OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................... 9 5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 9 6. ÁREA DE ESTUDIO .................................................................................................... 10 7. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 11 7.1 UNIDAD DE OBSERVACIÓN.......................................................................................... 12 7.1.1. Procedimiento a realizar en el experimento: ..................................................... 12 7.2. DISEÑO EXPERIMENTAL Y PRUEBA DE RANGO MÚLTIPLE DE TUKEY ... 14 8. RESULTADOS.............................................................................................................. 16 8.1. ETAPA 0 – I INICIACIÓN: ............................................................................................... 16 8.2. ETAPA II MULTIPLICACIÓN:..................................................................................... 17 8.3. ETAPA III. CORRESPONDE AL ENRAIZAMIENTO: ............................................. 17 9. DISCUSIÓN .................................................................................................................. 24 10. CONCLUSIÓN .............................................................................................................. 25 11. RECOMENDACIONES ............................................................................................... 26 12. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................. 27 13. ANEXOS ........................................................................................................................ 31 IX LISTA DE GRÁFICOS Página Gráfico 1. Porcentaje de mortalidad………………………………………………..16 Gráfico 2. Comparaciones de longitudes de brotes en los tratamientos A, B, C y D………………………………………………………………………………………..19 Gráfico 3. Comparación de las medias del crecimiento de las hojas en los tratamientos A, B, C y D …………………………………………………………..…21 Gráfico 4. Medias de las longitudes de las raíces de los tratamientos A, B, C y D con relación a los meses…………………………………………………………….23 X LISTA DE TABLAS Página Tabla 1. Temperatura óptima de las orquídeas……………………………….…....4 Tabla 2. Longitud del brote en el tratamiento………………………………………18 Tabla 3. Análisis de varianza en la longitud del brote…………………………….18 Tabla 4. Número de hojas generadas de acuerdo a los tratamientos…………20 Tabla 5. Análisis de varianza en el número de hojas generadas……………….20 Tabla 6. Medias de la longitud de la raíz…………………………………………..22 Tabla 7. Análisis de varianza de la longitud de la raíz……………………………..22 Tabla 8. Medio de cultivo de Murashige & Skoog (ms, 1962), modificado………………………………………………………………………….....31 Tabla 9. Se usó la fórmula de Murashige & Skoog (ms, 1962) y está constituido de los siguientes reactivos químicos puros………………………………………..31 Tabla 10. Quelatos Murashige & Skoog (ms, 1962)……………………………...31 Tabla 11. Solución stock de vitaminas e inositol MS x 200………………….…..32 Tabla 12. Concentraciones de sacarosa……………………………………….….32 Tabla 13. Concentraciones de Phytagel……………………………………….….32 Tabla 14. Medios inicial (mg. Y g.)…………………………………………………33 XI Tabla 15. Control mensual del tratamiento A………………………………………35 Tabla 16. Control mensual del tratamiento B……………………………..…..…..36 Tabla 17. Control mensual del tratamiento C…………………………………..….37 Tabla 18. Control mensual del tratamiento D………………………………………38 XII LISTA DE FIGURAS Página Figura 1. Ubicación geográfica Laboratorio Agrovitroparis……………………….10 Figura 2. Cortando la vara de la planta madre de Phalaenopsis violacea……..39 Figura 3. Materiales para la desinfectación………………………………………..39 Figura 4. Eliminando puntas blancas………………………………………………40 Figura 5. Formulación de los medios de cultivo…………………………………..40 Figura 6. Medio inicial………………………………………………………………..41 Figura 7. Contaminación por hongos micelados…………………………………..41 Figura 8. El rompimiento de la latencia de los explantes e inducción del crecimiento……………………………………………………………………………42 Figura 9. Cambio de medio………………………………………………………….42 Figura 10. Toma de datos……………………………………………………………43 Figura 11. Última toma de datos…………………………………………………….43 XIII 1. INTRODUCCIÓN El Ecuador es reconocido por poseer una gran diversidad de orquídeas; muchas de las especies que existen están en peligro de extinción. La deforestación ha provocado serios daños especialmente en las poblaciones de orquídeas epífitas, las cuales, al ser tan especializadas en su ecología, se ven seriamente afectadas por los cambios ambientales (Placencia, 2010). La familia de las orquídeas es el grupo más diverso y extenso de plantas con flor que existe. La diversidad en tamaño, forma y color, especialmente de sus flores, las convierten en un atractivo como plantas ornamentales, aunque también se han utilizado como comestibles, aromatizantes y medicinales (Chase, et al., 2003; Dressler, 1993). Aunque las orquídeas producen millones de semillas, poseen bajos porcentajes de germinación en condiciones naturales, el endospermo que rodea al embrión es muy reducido o no existe; por lo tanto, las orquídeas han desarrollado relaciones simbióticas con hongos que digieren la materia orgánica y transfieren los carbohidratos al embrión (Arditti & Ernets, 1993). Por ello la capacidad genética de las orquídeas de formar inter-genéricos ha resultado en la creación de un sin número de híbridos artificiales, muchos de los cuales adquieren precios elevados en el mercado. Conociendo esta realidad la investigación tuvo la finalidad de contribuir con un aporte científico, mediante series de técnicas alternativas en tejidos in vitro de la orquídea Phalaenopsis violacea, produciendo altos niveles de multiplicación, en períodos de tiempos cortos y además asegurando la sanidad del material. 1 La propagación in vitro se perfila como una opción para resolver problemas, ayudando en la conservación de especies nativas, sirviendo como base para investigaciones de orquídeas en la propagación in vitro, permitiendo dar posibles soluciones y ayudar a impedir la pérdida masiva del material biológico. 2 2. ANTECEDENTES El término se deriva de la palabra orchisse orquídea, esta es el origen etimológico de la familia de las Orquídeas, se originó entre los años 370 a.C. y 285 a.C., cuando fue usada por primera vez por el filósofo Teofrasto, discípulo de Platón y de Aristóteles, conocido como el Padre de la Botánica (Sequeira,1980). Las orquídeas constituyen la familia más grande de las Angiospermas y por lo tanto la más diversa (Abdelnour & Muñoz, 1997). El número de especies fluctúa entre 17.000 y 35.000 especies conocidas, las cuales se agrupan en 650 a 900 géneros (Kuan & González, 1993). Murguía & Lee (2004) señalan que las orquídeas requieren una temperatura diurna de 55 a 90 ºF (13 a 32 ºC) y una temperatura nocturna de 50 a 70 ºF (10 a 21 ºC), dependiendo de sus necesidades particulares de cultivo. Se pueden dividir en tres categorías: de clima frío, intermedio y cálido. El cultivo in vitro se definió como cualquier procedimiento aséptico que comprenda la manipulación de plantas, órganos, tejidos o células que produzcan poblaciones de plántulas. La micropropagación clonal implica que cada una de las plántulas que se producen pueda crecer y ser fenotípica y genotípicamente idéntica a la planta original de la que se deriva (Krikorian, 1991). 3 Tabla 1. Temperatura óptima de las orquídeas Clima Orquídea Frío Cymbidium , Odontoglossum Templado Cattleyay algunas Oncidium Phalaenopsis y Vanda Cálido Temperatura diurna óptima 10ºC Temperatura nocturna óptima 10ºC 10 a 24ºC 13 a 16ºC 21 a 30ºC 18 a 21ºC Villalobos & Thorpe (1991) señalaron las siguientes ventajas del cultivo in vitro: a. Incremento acelerado del número de plantas derivadas por genotipo. b. Reducción del tiempo de multiplicación. c. Posibilidad de multiplicar grandes cantidades de plantas en una superficie reducida, a bajos costos y en un tiempo económicamente costeable. d. Mayor control sobre la sanidad del material que se propaga. e. Facilidad para transportar el material in vitro de un país a otro, con menos restricciones aduaneras. f. Posibilidad de multiplicar rápidamente una variedad de la cual sólo existan pocos individuos. Villalobos & Thorpe (1991) señalaron las siguientes desventajas del cultivo in vitro: 4 a. Requiere de implantación de una infraestructura y equipos costosos como la cámara de flujo laminar. b. El material químico empleado en la preparación de los medios de cultivo es costoso y poco disponible en el mercado local. c. No es posible instalar laboratorios in vitro donde no se cuenta con fluido eléctrico o donde se presentan interrupciones periódicas. d. Se requiere de personal de laboratorio especializado: biólogos, químicos, fisiólogos, agrónomos. Murashige (1974) encontró que era útil destacar la secuencia de eventos asociados con la multiplicación de plantas mediante las técnicas de cultivo aséptico, de la siguiente manera: Etapa I. Iniciación o establecimiento (se establece el cultivo inicial o primario). Etapa II. Multiplicación de brotes o multiplicación de plantas. Etapa III. Corresponde al enraizamiento; tiene como objetivo producir una planta autotrófica que pueda sobrevivir en las condiciones del trasplante al suelo. Además de las anteriores, pueden considerarse otras dos etapas como parte integral del procedimiento: Etapa IV: Transferencia final a la etapa de medio ambiente. Etapa 0. Etapa inicial, que comprende la selección de la planta madre y la selección de una modalidad. 5 La micropropagación o propagación clonal, es una de las aplicaciones más generalizadas del cultivo in vitro. A partir de un fragmento (explante) de una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme, con plantas genéticamente idénticas, denominadas clones. El explante más usado para los procesos de propagación in vitro son las yemas vegetativas de las plantas. Morel (1974) utilizó tejido meristemático de yemas situadas en la base de brotes jóvenes. Como medio de iniciación se sugieren varios medios de cultivo, todos ellos líquidos: a. Medio MS 1962 modificado conteniendo 0,1 mg/l de ANA, 0,2 mg/l de KIN y 15% (v/v) de agua de coco. b. Otra modificación de medio MS 1962 enriquecido con 0,1 mg/l de ANA, 0,2 mg/l de KIN y 100 mg/l de caseína hidrolizada. c. Medio de iniciación Lidemann et al. (1970) conteniendo 0,1 mg/l de ANA, 0,2 mg/l de KIN y 15% (v/v) de agua de coco, seguido de medio de mantenimiento Lidemann et al. (1970), conteniendo 0,2 mg/l de A.N.A., 0,22 mg/l de KIN, 0,35 mg/l de ácido giberélico (AG3) y 15% de agua de coco y 100 mg/l de caseína hidrolizada. 6 3. JUSTIFICACIÓN Los híbridos de Phalaenopsis violacea tienen una gran importancia económica a nivel mundial, como flor cortada y planta ornamental, debido a sus flores vistosas y a la capacidad de adaptación a diferentes condiciones ambientales. Las técnicas de cultivo in vitro resultan indispensables para mejorar la eficacia germinativa, el crecimiento y desarrollo de orquídeas con fines comerciales e investigativos. El beneficio de la propagación es explorar el potencial de las yemas de escapos florales de Phalaenopsis violacea, con flores senescentes sobre la regeneración y multiplicación vegetativa, permitiendo la reproducción de una planta individual notable por su rendimiento, resistencia, calidad y otras condiciones favorables. Ecuador es privilegiado por la diversidad de su hábitat, ecosistemas y cantidad de recursos naturales; esto ha motivado a "un compromiso por la conservación de las orquídeas”, con flores-enigmáticas y multicolores, sus olores que varían indistintamente de la especie. Es importante contar con un protocolo de propagación, que permita la multiplicación asexual de las orquídeas; de esa manera se incrementaría la expansión del comercio de estas flores a nivel mundial, sin riesgo para el ecosistema. 7 4. HIPÓTESIS HO: La orquídea Phalaenopsis violacea no muestra crecimiento in vitro, estadísticamente significativo, en ninguno de los tratamientos. HA: La orquídea Phalaenopsis violacea, muestra un crecimiento in vitro, que es estadísticamente significativo al comparar los tratamientos mejorando la sobrevivencia y crecimiento. 8 5. OBJETIVOS 5.1. OBJETIVO GENERAL Desarrollar la propagación de Phalaenopsis violacea mediante las técnicas de cultivo en la yema floral. 5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Establecer un protocolo de desinfección efectivo para explantes Phalaenopsis violacea utilizando compuestos químicos fácilmente disponibles y económicamente accesibles. Determinar los medios de cultivo en cada tratamiento para multiplicación in vitro de orquídeas Phalaenopsis violacea. Determinar la capacidad de formación de cuerpos protocórmicos Phalaenopsis violacea en los medios de cultivo de introducción 9 6. ÁREA DE ESTUDIO Figura 1. Ubicación geográfica Laboratorio Agrovitroparis. Lugar en donde se llevó a cabo la investigación, el laboratorio de cultivos de tejidos in vitro de la empresa AGROVITROPARIS, cuya propietaria la Ing. Agr. Laura Parismoreno Rivas ubicado: Provincia: Guayas Cantón: Daule Dirección: Av.Piedrahita y Jaime Roldós, Mz. 434 Latitud Sur: 1º51' 37,77”S (613866.52 UTM)1/ Longitud Occidental: 79º 58'34.42”W (9794326.09 UTM) 1/ Lugar que se recolectó la muestra: Gualaceo (Provincia del Azuay). Empresa ECUAGENERA S.A. 10 La investigación se inició en el mes Octubre del 2013 y culminó en Mayo del año 2014. Siguiendo la fase de protocolo, durante los meses mencionados, el trabajo se llevó acabó en el laboratorio AGROVITROPARIS. 7. MATERIALES Y MÉTODOS Hoja de bisturí. Papel kraf. Caja petri. Papel aluminio. Cámara vertical. Marcador permanente. Estereoscopio. Tween 20. Balanza de precisión. Cloro. Aguja. Bicloruro de mercurio. Medio de cultivo MS. Phyton. Agua destilada estéril. Frascos de 200 ml. Alcohol al 75%. Refrigeradora. Gradilla. Autoclave. Micropipeta. Tubo de ensayo. Agitador magnético. Mechero de alcohol. Tirillas de tornasol. Lámparas UBV Regla graduada 11 En la Investigación todos los instrumentos empleados fueron esterilizados en la autoclave a 121 ºC y 15 libras de presión. 7.1 UNIDAD DE OBSERVACIÓN Los frascos para el inicio fueron sellados con una lámina de aluminio, envuelto en plástico transparente, en donde se dispensó 20 ml de los medios de cultivos. 7.1.1. Procedimiento a realizar en el experimento: Etapa 0 (día 1): El material vegetal de inicio fue las varas florales extraídas de plantas madres de Phalaenopsis de un vivero ubicado en Gualaceo Provincia del Azuay de propiedad de la Empresa ECUAGENERA. Las plantas madres fueron seleccionadas por su buen aspecto físico, por su sanidad y buena calidad para la exportación y fueron trasladadas hasta el laboratorio. Etapa I (desde el día 1 hasta el día 30): Se siguió el proceso de desinfección y disección descrito por Arditti (1977): Se cortaron los escapos, se procedió lavar con agua corriente y jabón líquido por 20 minutos seleccionando en segmentos con aproximadamente de 1 cm, y se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio (0.525% v/v) adicionada con 15 ml de Tween 20 por cada 1000 ml de solución, por 20 minutos. Se desinfectaron de nuevo con hipoclorito de sodio (0.2625% v/v) con Tween 20 por 15 minutos en agitación. Luego se lavaron tres veces con agua destilada estéril. Establecimiento de parámetros físicos: Los explantes obtenidos fueron de acuerdo a la técnica de Knudson,1921: Cultivados en un cuarto a una temperatura de 24 ± 2 ºC, un fotoperiodo de 16 horas luz, 8 horas de oscuridad 12 controlada con un tiempo y una intensidad lumínica de 2500-3000 lux provista por fluorescentes de luz blanca. Inducción de explantes: Una vez desinfectados los explantes, procedimos a colocarlos sobre un papel estéril, luego eliminamos las puntas blancas y sumergimos las microestacas en una solución de cisteína estéril, para finalmente secar en papel estéril y sembrarlos en los respectivos tratamientos. En el momento de la siembra, la boca del frasco debe estar cerca del mechero de alcohol, para evitar posibles infecciones, los frascos se sellaron con rolopac y los identificamos (fecha de siembra, generación y tratamiento) rotulando con un marcador permanente. Posteriormente se sembró uno en cada frasco con medio de cultivo, A, B, C, D. La formulación química se puso en cada frasco en esta etapa como indica la tabla 14. A. White, 1934. B. White, Y MS (plátano licuado, carbón activado). C. Murashige & Skoog, (MS) 1962 (plátano licuado, agua de coco). D. Vacin & Went, 1949 (agua de coco). Etapa II (desde el día 30 hasta los 90 días): En esta fase los brotes manifestaron un enverdecimiento y aumento de tamaño. Había contaminaciones de hongos presentes y ocasionando la pérdida de numerosos explantes. 13 Se notaron un engrosamiento en la cuarta semana, dentro de la cámara se procedió a realizar el primer cambio de medio de cultivo, de esa manera evitar la contaminación posterior muerte del tejido. Etapa III (desde el día 91 hasta el día 120): En esta etapa continuó el crecimiento de los brotes y realizamos la toma de datos con cada uno de los tratamientos sobrevividos para evaluar las variables las que determinaron la eficacia de cada tratamiento, induciéndoles químicamente a producir órganos (hojas, raíces). 7.2. DISEÑO EXPERIMENTAL Y PRUEBA DE RANGO MÚLTIPLE DE TUKEY Para el análisis estadístico, se utilizó un diseño completamente al azar, y la prueba de Tukey para ver si existen diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos. F.V. Tratamiento S.C. nT12+nT22+ nT32… G.L. n-1 C.M. S.C.Trat/G.L. Trat Error S.C.Total+S .C.Trata n12+n22+n32Fc n-k S.C.E/G.L.E Total Tukey = Ft x √ G.L.T+ G.L.E 𝐶.𝑀.𝐸 𝑅 Características del experimento Número de tratamientos: 4 14 Fc C.M.Trat/C. M.E Ft 0.01 G.L.Trata; G.L.E Número de repeticiones: 20 Cálculo de porcentaje de contaminación 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑜𝑠 ∗ 100 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 15 8. RESULTADOS Los datos obtenidos de las variables (longitud del brote, número de hojas y longitud de la raíz), para cada uno de los tratamientos se evaluaron. 8.1. ETAPA 0 – I INICIACIÓN: En Octubre y Noviembre se inició la fase de introducción se contaron los explantes contaminadas, tomándose en cuenta con signos de hongos, bacterias y levaduras. La supervivencia de los escapos o explante en el tratamientos D fueron del 90%, mientras el tratamiento B 75%, tratamiento C 60% y el tratamiento A 50%. PORCENTAJE DE MORTALIDAD 50% 45% 40% 35% 30% 25% 50% 20% 40% 15% 25% 10% 5% 10% 0% TRATAMIENTO A TRATAMIENTO B TRATAMIENTO C TRATAMIENTO D Gráfico 1. Porcentaje de Mortalidad De los resultados obtenidos de porcentaje de mortalidad, se puede señalar que el tratamiento D presentó el 10% lo que indica que la utilización de 16 la agua de coco en el medio es favorable ya que es estéril, mientras que en el tratamiento B es el 25%, en el tratamiento C el 40% y en el A el 50% por la adición de banano, por lo cual se incrementaba el número de tubos contaminados. Básicamente, la contaminación fue causada por hongos, pues se evidenció la presencia de micelio. 8.2. ETAPA II MULTIPLICACIÓN: Se notaron un enverdecimiento en el mes de Diciembre y aumento de tamaño. En esta etapa fue complicada, debido a la alta contaminación en especial de hongos presentes, ocasionando la pérdida de numerosos explantes. Luego de estar libre de contaminación, dentro de la cámara se procedió a realizar el 1er cambio de medio de cultivo. 8.3. ETAPA III. CORRESPONDE AL ENRAIZAMIENTO: En esta etapa en el mes de Diciembre continuaron los brotes, se tomaron los datos con cada uno de los tratamientos sobrevividos para evaluar las variables para determinar la eficacia de cada tratamiento. En los tratamientos, se consideraron los datos de acuerdo a la tabla 15, 16, 17, 18, tomando como referencia las medias para las respectivas comparaciones. 17 Tabla 2. Longitud del brote. Tratamiento A B C D Diciembre 1.5 1.8 0.9 5.7 Enero 2.2 3.2 2.5 6.3 Febrero 3.3 6.4 4.7 12.2 Marzo 4.5 8.8 6.2 30.6 Abril 5.6 11.7 7.7 39.6 Mayo 6.9 17.4 9 40 ∑Total 24 49.3 31 134.4 X̅ 4 8,22 5.17 Meses 22.4 Tabla 3. Análisis de varianza en la longitud del brote. F.V. S.C. G.L. C.M. Fc Ft 0.01 Tratamiento 1235.58 3 4111.86 39.79** 4.94 Error 207.17 20 10.35 Total 1442.75 23 Prueba de rango múltiple de Tukey D&B 22.4 - 8.22 14.18 > 7.93 D&C 22.4 - 5.17 17.23 > 7.93 D&A 22.4 – 4 18,4 > 7.93 B&C 8.22 - 5.17 3.05 < 7.93 B&A 8.22 – 4 4.22 < 7.93 C &A 5.17 – 4 1.17 < 7.93 18 Tukey = 4.94 x √ 10.35 4.94 x 1.60 = 7.93 4 De acuerdo a la prueba de tukey (0.01), hay diferencia altamente significativa entre los tratamientos. Los tratamientos A, tratamiento B y tratamiento C son iguales estadísticamente entre sí, a diferencia del tratamiento D. Comparación de longitud del brote 22,4 22 20 Longitud del brote 18 16 14 12 10 8,22 8 6 5,17 4 4 2 0 TRATAMIENTO A TRATAMIENTO B TRATAMIENTO C TRATAMIENTO D Gráfico 2. Comparaciones de longitudes de brotes en los tratamientos A, B, C y D. De acuerdo al gráfico 2. en el tratamiento A hay un crecimiento de 4 cm, y el tratamiento C de un 5.17 cm no hay diferencias en su crecimiento, ya que no fueron medios adecuados para desarrollo, mientras en el tratamiento D hay una mayor longitud de un 22.4 cm y el tratamiento B de 8.22 cm, como indica la tabla 2. Sus medios fueron favorables con la adición de compuestos orgánicos, por la presencia de azúcares, magnesio y fosfatos. 19 Tabla 4. Número de hojas generadas de acuerdo a los tratamientos Tratamiento A B C D Enero 1 3 1 5 Febrero 1 3 1 5 Marzo 1 3 1 5 Abril 1 3 1 5 Mayo 1 3 1 5 ∑Total 5 15 5 25 X̅ 1 3 1 5 Meses Tabla 5. Análisis de varianza en el número de hojas generadas. F.V. S.C. G.L. C.M. Fc Ft 0.05 Tratamiento 55 3 18.33 2.35 n.s 3.24 Error 125 16 7.8 Total 180 19 De acuerdo a la tabla 5. no hay significancias entre los tratamientos A, B, C, D, estadísticamente iguales. 20 Comparación de las medias del crecimiento de las hojas 5 5 4,5 Número de hojas 4 3,5 3 3 2,5 2 1,5 1 1 1 0,5 0 TRATAMIENTO A TRATAMIENTO B TRATAMIENTO C TRATAMIENTO D Gráfico 3. Comparación de las medias del crecimiento de las hojas en los tratamientos A, B, C y D. En el gráfico 3. no presenta diferencias entre los tratamientos, en relación a la media; en comparación del tratamiento D con un 5 cm como indica la tabla 4. Generando 6 hojas, en oposición con el tratamiento A que tuvo 1 cm de su media, con 2 hojas. 21 Tabla 6. Longitud de la raíz. Tratamiento A B C D Enero 1.0 1.5 0.9 10.5 Febrero 2.0 6.5 2.8 13.5 Marzo 3.1 7.1 3.2 16.8 Abril 3.5 8.7 4.2 20.3 Mayo ∑Total X̅ 4.5 11.9 5.3 25.5 14.1 35.7 16.4 86.6 2.82 5.95 3.28 17.32 Meses Tabla 7. Análisis de varianza en la longitud de la raíz. F.V. Tratamiento Error Total S.C. G.L. C.M. Fc 680.97 3 266.99 20.09 ** 212.66 16 13.29 893.63 19 Prueba de rango múltiple de Tukey Ft 0.01 3.24 D&B 17.32 - 5.95 11.73 > 5.89 D&C 17.32 – 3.28 14.04 > 5.89 D&A 17.32 – 2.82 14.5 5.89 B&C 5.95 – 3.28 2.67 < 5.89 B&A 5.95 - 2.82 3.13 < 5.89 C&A 3.28 – 2.82 0.46 < 5.89 2.82 5.95 3.28 17.32 A B C D 22 Tukey = 3.24 x √ 13.29 3.24 x 1.82= 5.89 4 Los tratamientos A, tratamiento B y tratamiento C son iguales estadísticamente entre sí, por lo tanto el tratamiento D es superior de acuerdo a la prueba de Tukey (0.01). Comparación de las longuitudes de las raíces. 17,32 18 16 Longitud de la raíz 14 12 10 8 5,95 6 4 3,28 2,82 2 0 TRATAMIENTO A TRATAMIENTO B TRATAMIENTO C TRATAMIENTO D Gráfico 4. Medias de las longitudes de las raíces de los tratamientos A, B, C y D con relación a los meses. De acuerdo a la tabla 6. El tratamiento A tienen una media de 2.82 con una longitud de 0.5 cm; en cambio el tratamiento D tiene una media de 17.32 y una longitud de 1.6 cm, tuvo mayor crecimiento con la adición del agua de coco que fue beneficioso para el medio. 23 9. DISCUSIÓN El trabajo realizado por Pierik (1990), la contaminación del medio y la mala desinfección fue de 60%, provocaron la muerte de los explantes de Cymbidium sp., debido a la deficiente capacidad de absorción de nutrientes, esto sucedió en los tratamientos A con 50% y C 40% Phalaenopsis violacea (grafico 1, figura 7). Pierik (1990) y Arditti & Ernets (1993), consideraron la etapa I lo cual observaron mayor imbibición; en el tratamiento D presento hinchamiento pronunciado y una coloración verde pálida. La adición del agua de coco permite mayor fuerza en el crecimiento (Vacin & Went, 1949) siendo una respuesta favorable se pudo observar en el tratamiento D (figura 8). Durante la etapa III, las longitudes de los brotes (TB) con la el uso extractos de frutas en los tratamientos A fue 4 cm y C de 5.17 cm, a diferencia de Stancato (2008) dio como resultado una longitud de 20.2 cm (tablas 2 – 3). Los tratamientos que no contienen componentes orgánicos muestran tallas bajas en las formaciones de plántulas (figura 8), por lo tanto, se observaron los mejores resultados al agregar al medio de cultivo agua de coco, esto confirma lo dicho por Nongrum et al. (2007) y Abbas et al. (2011), quienes concluyeron que la adición de coco al medio de cultivo ejerce un efecto benéfico en la germinación y el desarrollo de tejidos celulares. 24 10. CONCLUSIÓN La mejor respuesta se obtuvo en los tratamientos B (plátano licuado y carbón activado) y D (agua de coco) observándose el crecimiento de las yemas, con la formación de las primeras hojas en la mayoría de los explantes también la aparición de raíces vigorosas, debido a que agua de coco es un medio muy completo. El método utilizado en el presente trabajo demuestra la posibilidad de obtener plantas de Phalaenopsis violacea a partir de inflorescencia senescentes cultivadas. Lo importante es la obtención de plantas completas y trasferidas a condiciones de campo en un período de 6 meses. El uso de componentes orgánicos como el plátano no fue favorable por lo tanto, hubo mayor oxidación y contaminación. 25 11. RECOMENDACIONES Realizar estudio con las fases de micropropagación y acondicionamiento ex- vitro de la orquídea Phalaenopsis violacea. Utilización de compuestos orgánicos en los medios. Desinfección en el manejo de compuestos orgánicos (frutas). 26 12. BIBLIOGRAFÍA Abbas, B., F. Heningtyas, & B. Amriati. 2011. In vitro seeds germination and plantlets development of Grammatophyllum scriptum Lindl. (Orchidaceae). International Research Journal of Plant Science. 2 (5): 154-159. Abdelnour, A. & A. Muñoz. 1997. 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Medio de cultivo de Murashige & Skoog (ms, 1962), modificado. Macronutrientes Reactivo NH4NO3 KNO3 CaCl2. 2H2O Nitrato de amonio Nitrato de potasio Cloruro de calcio Fosfato de potasio monobásico Sulfato de magnesio KH2PO4 Mg SO4·7H2O Concentración mg/L 1.0650.00 1.900.00 332.02 170.00 80.70 Tabla 9. Se usó la fórmula de Murashige & Skoog (ms, 1962) y está constituido de los siguientes reactivos químicos puros. Reactivos KI Yoduro de potasio Concentración en mg/L 0.83 H3BO3 Ácido bórico 6.20 MnSO4.4H2O Sulfato de magnesio 22.30 ZnSO4. 7H2O Sulfato de zinc 8.60 Na2MoO4. 2H2O Molibdato de sodio 0.25 CuSO4. 5H2O Sulfato de cúprico 0.025 CoCl2. 6H2O Cloruro de cobalto 0.025 Tabla 10. Quelatos Murashige & Skoog (ms, 1962). Reactivos FeSO4 .7H2O Sulfato ferroso Na2EDTA. 2H2O Ácido Etilen-diaminotetraacético-disodio 31 Concentración en g/L 5.57 7.45 Tabla 11. Solución stock de vitaminas e inositol MS x 200 ml. Vitaminas Reactivos C6H12O6 Mio- inositol (Vitamina B8) C12H17N4OS+ Tiamina HCL (Vitamina B1) C21H27N7O14P2 Acido nicotínico (Vitamina B3) C10H16N2O3S Biotina (Vitamina B7) C18H32CaN2O1 Pantotenato de 0 calcio (Vitamina B5) C8H11NO3 Piridoxina HCL (Vitamina B6) Concentració n mg/L 100.00 1.00 1.00 0.01 1.00 1.00 Tabla 12. Concentraciones de sacarosa. Nombre Sacarosa (Azúcar) C12H22O11 Tabla 13. Concentraciones de Phytagel. Nombres Phytagel Concentración en g/L C6H12O6 + sphingomonas elodea 1.5 32 Tabla 14. Medios inicial (mg. Y g.). Nombre Formula química Ca3 (P04)2 MgS04.7H2 0 KN03 Fosfato de calcio Sulfato de magnesio Nitrato de potasio Fosfato de KH2P04 potasio monobasico Fe(C4H406)3 Sulfato de MnS04.4H2 Manganeso 0 tetrahidratado Nitrato de calcio Ca(N03)2.4 H20 Dihidrógeno NaH2S04 fosfato de sodio fosfato de sodio NaH2P04.H dibásico 20 Cloruro de KCL potasio Vitaminas Morel Sacarosa C12H22O1 1 Ácido cítrico C6H8O7 Carbón activado BAP (inicio) solución liquida ANA solución liquida Thidiazurón TDZ Cysteína C3H7NO2S Macroelementos MS Microelementos Ms Ácido etilenNa2EDTA. diamino2H2O tetracéticodisodio Plátano licuado Agua de coco Tratamiento A X 737,5 mg Tratamiento B X 737,5 mg Tratamiento C X X Tratamiento D 200 mg 250 mg 80,0 mg 80,0 mg X 525 mg X X X 250 mg X X X X X X 28 mg 7.5 mg 288,0 mg 288,0 mg X x 200,0 mg 200,0 mg 19,0 mg 19,0 mg X x 65,0 mg 65,0 mg X x 10ml 20 g 10ml 20 g 10ml 20 g 40 g 125 mg X 0.5 ml 4 ml 1 mg 0,25 mg X 125 mg 1g 0.5 ml 4 ml 0,5 mg/ 0,25 mg X 125 mg X 0.5 ml 4 ml 1 mg/l 0,25,mg 100 ml 125 mg x 0.5 ml x x 0,25 mg x 1 ml 1ml 1 ml x 5 ml 5ml 5 ml x X X X X 40 g/l 200 ml x 200 ml 33 x Sulfato de (NH4)2 amonio SO4 Phytagel Ph X X X 500 ml 1,5 g/lL 5 1,5 g/l 5 1,5 g/l 5 1,5 g/l 5 34 Tabla 15. Control mensual del tratamiento A. Repeticiones I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XX 30/1 30/11/2 0/20 013 13 Contaminación 1 - 1 - 1 1 1 - 1 - 1 1 1 1 - 30/12/2 013 30/01/2014 Meses 27/02/2014 30/03/2014 30/04/2014 30/05/2014 LB LB NH LR LB NH LR LB NH LR LB NH LR LB NH LR 0.1 0.2 0.1 0.2 0.2 0.1 0.2 0.2 0.1 0.1 - 0.2 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 0.2 0.2 0.2 - 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 - 0.1 01 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 - 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 - 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 - 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 - 0.4 0.4 0.5 0.5 0.5 0.4 0.5 0.4 0.4 0.5 - 1 1 1 1 1 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 - 0.6 0.5 0.6 0.6 0.6 0.5 0.6 0.5 0.5 0.6 - 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 - 0.4 0.3 0.3 0.4 0.4 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 - 0.7 0.6 0.7 0.8 0.7 0.6 0.7 0.6 0.6 0.9 - 1 - 0.5 0.4 0.4 0.5 0.5 0.4 0.5 0.4 0.4 0.5 - 35 1 1 2 2 - 1 1 1 1 1 2 2 - Tabla 16. Control mensual del tratamiento B. Repeticiones I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XX 30/1 30/11/2 0/20 013 13 Contaminación 1 - 1 1 - 1 1 - 30/12/20 13 30/01/2014 Meses 27/02/2014 30/03/2014 30/04/2014 30/05/2014 LB LB NH LR LB NH LR LB NH LR LB NH LR LB NH LR 0.1 0.1 0.2 0.1 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2 0.1 0.1 0.3 0.2 0.3 0.2 0.2 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 0.2 0.2 3 2 4 3 2 2 2 3 3 4 3 2 1 2 4 0.1 0.1 0.1 0.2 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.5 0.4 0.5 0.5 0.5 0.5 0.4 0.6 0.5 0.4 0.5 03 0.4 0.6 0.5 3 2 4 3 2 2 2 3 3 4 3 2 1 2 4 0.2 0.3 0.2 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 0.2 0.3 0.3 0.3 0.6 0.7 0.8 0.6 0.7 0.6 0.5 0.8 0.7 0.6 0.7 0.5 0.6 0.8 0.7 3 2 4 3 2 2 2 3 3 4 3 2 1 2 4 0.3 0.5 0.3 0.5 0.4 0.5 0.4 0.3 0.3 0.4 0.5 0.3 0.6 0.4 0.5 1 0.9 1 0.8 0.9 0.8 0.7 1 0.9 1 0.9 0.6 0.8 1 1.1 3 2 4 3 2 2 2 3 3 4 3 2 1 2 4 0.5 0.6 0.4 0.6 0.5 0.6 0.6 0.5 0.6 0.6 0.7 0.6 0.7 0.5 0.7 1 1.2 1.3 1.5 1.4 1.5 1.2 1.4 1.3 1.5 1.1 1.4 1.3 1.2 1.5 3 2 4 3 2 2 2 3 3 4 3 2 1 2 4 0.7 0.8 0.6 0.8 0.7 0.8 0.9 0.7 0.8 0.9 0.9 0.8 0.9 0.7 0.9 36 Tabla 17. Control mensual del tratamiento C. Repeticiones I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XX 30/1 30/11/2 0/20 013 13 Contaminación 1 - 1 1 1 1 1 - 1 1 - 30/12/2 013 30/01/2014 Meses 27/02/2014 30/03/2014 30/04/2014 30/05/2014 LB LB NH LR LB NH LR LB NH LR LB NH LR LB NH LR 0 0.1 0.1 0 0.1 0.1 0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 - 0.2 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 - 1 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1 2 - 0 0.1 0 0.1 0.1 0.1 0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 - 0.4 0.5 0.3 0.3 0.4 0.3 0.4 0.5 0.4 0.3 0.4 0.5 - 1 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 - 0.2 0.3 0.2 0.3 0.2 0.2 0.2 0.3 0.2 0.2 0.3 0.2 - 0.4 0.6 0.5 0.4 0.5 0.4 0.5 0.6 0.5 0.5 0.6 0.7 - 1 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1 2 - 0.2 0.4 0.2 0.3 0.3 0.2 0.3 0.4 0.2 0.3 0.3 0.3 - 0.6 0.7 0.5 0.5 0.6 0.6 0.7 0.7 0.6 0.7 0.7 0.8 - 1 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1 2 - 0.3 0.4 0.2 0.3 0.3 0.3 0.5 0.5 0.3 0.4 0.4 0.4 - 0.8 0.8 0.6 0.7 0.7 0.7 0.8 0.8 0.7 0.8 0.8 0.8 - 1 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1 2 - 0.4 0.5 0.3 0.5 0.4 0.5 0.6 0.6 0.3 0.4 0.4 0.4 - 37 Tabla 18. Control mensual del tratamiento D. Repeticion es I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XX 30/10 30/11/ /2013 2013 Contaminación 1 1 Meses 27/02/2014 30/12/2 013 LB 30/01/2014 LB NH LR LB NH LR LB NH LR LB NH LR LB NH LR 0.3 0.4 0.3 0.2 0.3 0.2 0.2 0.4 0.3 0.2 0.4 0.3 0.3 0.5 0.4 0.3 0.4 0.3 3 3 3 4 5 3 5 3 6 4 5 4 6 4 6 4 5 5 3 3 3 4 5 3 5 3 6 4 5 4 6 4 6 4 5 5 0.6 0.7 0.5 0.7 0.5 0.5 0.6 0.7 0.5 0.4 0.6 0.5 0.7 0.7 0.5 0.6 0.7 0.5 1 1.2 1.3 1.5 1.2 1.3 1.4 1.5 1.2 1.6 1.3 1.5 1.2 1.5 1.6 1.5 1.2 2.5 3 3 3 4 5 3 5 3 6 4 5 4 6 4 6 4 5 5 0.7 0.8 0.7 0.9 0.7 0.6 0.8 0.8 0.7 0.6 0.8 0.7 0.8 0.9 0.6 0.8 0.8 0.8 1.5 1.6 1.6 1.8 1.7 1.8 1.9 1.7 1.5 1.7 1.6 1.2 1.7 1.9 2 1.8 1.6 2. 3 3 3 4 5 3 5 3 6 4 5 4 6 4 6 4 5 5 0.9 1 0.8 1 1 0.8 1 0.9 0.9 0.8 1 0.9 1 1 0.8 1 1 1 1.8 3 3 3 4 5 3 5 3 6 4 5 4 6 4 6 4 5 5 1 1.1 1.1 1.2 1.1 1 1.2 1 1 1 1.3 1 1.2 1.3 1 1.3 1.2 1.3 2.1 2.3 2.2 2.6 2.3 2.4 2.6 2.7 2.8 2.8 2.5 2.6 2.4 2.6 2.6 2.9 2.7 2.9 3 3 3 4 5 3 5 3 6 4 5 4 6 4 6 4 5 5 1.4 1.3 1.2 1.3 1.4 1.2 1.5 1.5 1.4 1.6 1.5 1.4 1.5 1.6 1.3 1.4 1.4 1.6 38 30/03/2014 30/04/2014 1.9 1.9 2.4 2 2.1 2.3 2.3 2.5 2.6 2.3 1.9 2 2.3 2.4 2 2.4 2.5 30/05/2014 Figura 2. Cortando la vara de la planta madre Phalaenopsis violacea. Figura 3. Materiales para la desinfectación. 39 Figura 4. Eliminando puntas blancas. Figura 5. Formulación de los medios de cultivo. 40 Figura 6. Medio inicial. Figura 7. Contaminación por hongos micelados. 41 Figura 8. El rompimiento de la latencia de los explantes e inducción del crecimiento Figura 9. Cambio de medio. 42 Figura 10. Toma de datos Figura 11. Última toma de datos. 43