Tesis Propagación in vitro de la orquidea Phalaenopsis vilacea a través de la vara floral.pdf

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
ESCUELA DE BIOLOGÍA
Propagación in vitro de la orquídea
“Phalaenopsis violacea” a través de la vara floral.
Diana Carolina Rojas Riera
Tesis de Grado presentada como requisito para la
obtención del título de Bióloga.
GUAYAQUIL-ECUADOR
2014
DIANA CAROLINA ROJAS RIERA
© DERECHO DE AUTOR
II
DIRECTOR DE TESIS
______________________________
Ing. Carlos Rolando Aguirre
III
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
ESCUELA DE BIOLOGÍA
CALIFICACIÓN QUE OTORGA EL TRIBUNAL QUE RECIBE LA
SUSTENTACIÓN Y DEFENSA DEL TRABAJO INDIVIDUAL DE TITULACIÓN:
TESIS
Propagación in vitro de la orquídea
“Phalaenopsis violacea” a través de la vara floral.
Diana Carolina Rojas Riera
PREVIO A OBTENER EL TÍTULO DE BIOLÓGA
Miembros del tribunal
Calificación
Números y Letras
Blga. Mónica Armas Soto MSc.
Presidente del tribunal
-------------------------------------------
Dra. Gladys Rodríguez de Tazan
Miembro del tribunal
-------------------------------------------
Blgo. Francisco Cornejo Sotomayor
Miembro del tribunal
-------------------------------------------
SUSTENTACIÓN Y DEFENSA DEL TRABAJO INDIVIDUAL DE TITULACIÓN
REALIZADA EN LA SALA DE MAESTRÍA DE LA FACULTAD.
FECHA: -------------------------------------------------------------------------.- CERTIFICO
Ab. José Solórzano Cabezas
Secretario de la Facultad
IV
DEDICATORIA
Con mucho cariño dedico las páginas de esta Tesis que refleja el esfuerzo de
muchos años de espera, a todos quienes me apoyaron constantemente con
palabras de aliento para culminar una meta más en mi vida.
A mi padre Sr. Aníbal Rojas que mientras estuvo con vida siempre depositó su
confianza en mí, a mi madre Sra. Marie Riera que siempre ha sido una amiga
incondicional, quien día a día me brinda su fe, amor y perseverancia, para ser en
un futuro alguien mejor. A mis hijos, mis abuelitas Sra. Leonor Vélez, Sra. María
Amari, que con sus bendiciones siempre me dan seguridad, que sin el apoyo de
ellos, quizás no hubiese podido escribir esta dedicatoria.
Y al resto de mi familia que aun iniciando mi carrera aseguraban que ya sabían
el resultado.
V
AGRADECIMIENTO
A Dios por darme fortaleza cada día de mi vida.
Debo expresar mi gratitud a las personas que hicieron posible la realización de
ésta investigación:
A la Dra. Gladys Rodríguez de Tazan, por la ayuda y paciencia brindada durante
el desarrollo de la experimentación.
Al Dr. Carlos García, que con sus excelentes conocimientos me trasmitió la
seguridad tanto personal como científica, para la realización de mi tesis.
A la empresa AGROVITROPARIS, dirigido por la Ing. Agr. Laura Parismoreno
Rivas, por la oportunidad de realizar el ensayo.
VI
RESUMEN
El presente trabajo tiene como objetivo desarrollar la micropropagación de
Phalaenopsis violacea mediante las técnicas de cultivo en la vara floral. Para
obtener la formación de cuerpos protocórmicos, iniciando con el procedimiento
de desinfección con la utilización de hipoclorito de sodio al 4% y tween 20% (2
gotas/100 ml).
Se utilizaron 4 tipos de tratamientos: A, B, C, D, de los cuales el D presentó
el 10% de contaminación, mientras que en el B el 25%, en el C el 40% y en el A
el 50%. Los primeros cuerpos protocórmicos fueron observados a las siete
semanas del cultivo, se evaluó el crecimiento y supervivencia. Para el análisis
estadístico se realizó un diseño completamente al azar, mediante un análisis de
varianza y la prueba de tukey.
Los resultados obtenidos en esta investigación confirman que sí es
posible la micropropagación de las varas florales en Phalaenopsis violacea. En
el tratamiento D que es el medio de cultivo Vancin & Went con adición de agua
de coco, se obtuvo las respuestas más favorables, con un 90% de supervivencia
de acuerdo a las siguientes mediciones: Longitud del brote (2.9 cm), número de
hojas (5), longitud de la raíz (1.6 cm). Los resultados muestran que hay
diferencias significativas entre los diferentes tratamientos y que estos influyen de
manera positiva en el crecimiento de las plántulas, ayudando en el desarrollo de
las hojas y raíces.
Palabras claves.- Ácido naftalénacético (ANA); bencil aminopurina (BAP); in
vitro; orquídea; Phalaenopsis violacea.
VII
ABSTRACT
The aim of the present work is to develop the microspreading of
Phalaenopsis violacea by culture techniques from flowers buds. In order to
obtaining the formation of protocormic bodies, as beginning of disinfection have
been used sodium hypochlorite 4% and Tween 20% (2 drops / 100 ml).
Four types of treatments have been used: A, B, C, D, of which D showed
10% of pollution, while 25% in B, 40% in C and 50% in A. The first protocormic
bodies have been observed at seventh week of growing, survival and growth
have been evaluated. For the statistical analysis was performed a completely
randomized design using analysis of variance and tukey's test.
The results obtained in this research confirmed that microspreading floral
rod is possible Phalaenopsis violacea. In treatment D, that is the culture media of
growing of Vancin & Went with addition of coconut water, was obtained the most
favorable response with 90% survival, according to the following measurements:
length of shoot (2.9 cm), number of leaves (5), root length (1.6 cm). The results
have demonstrated that there are significant differences among the several
treatments and that those perform a positively influences on seedling growth,
allowing in the development of leaves and roots.
Keywords-. Acid naphthalene acetic (NAA); benzyl aminopurine (BAP); in vitro;
orchidaceae; Phalaenopsis violacea.
VIII
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN .................................................................................................................................. vii
ABSTRACT ............................................................................................................................... viii
LISTA DE GRÁFICOS ................................................................................................................ x
LISTA DE TABLAS .................................................................................................................... xi
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................ xiii
1.
INTRODUCCIÓN............................................................................................................ 1
2.
ANTECEDENTES .......................................................................................................... 3
3.
JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................ 7
4.
HIPÓTESIS ..................................................................................................................... 8
5.
OBJETIVOS .................................................................................................................... 9
5.1. OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................... 9
5.2.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 9
6.
ÁREA DE ESTUDIO .................................................................................................... 10
7.
MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 11
7.1 UNIDAD DE OBSERVACIÓN.......................................................................................... 12
7.1.1. Procedimiento a realizar en el experimento: ..................................................... 12
7.2.
DISEÑO EXPERIMENTAL Y PRUEBA DE RANGO MÚLTIPLE DE TUKEY ... 14
8.
RESULTADOS.............................................................................................................. 16
8.1. ETAPA 0 – I INICIACIÓN: ............................................................................................... 16
8.2.
ETAPA II MULTIPLICACIÓN:..................................................................................... 17
8.3.
ETAPA III. CORRESPONDE AL ENRAIZAMIENTO: ............................................. 17
9.
DISCUSIÓN .................................................................................................................. 24
10.
CONCLUSIÓN .............................................................................................................. 25
11.
RECOMENDACIONES ............................................................................................... 26
12.
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................. 27
13.
ANEXOS ........................................................................................................................ 31
IX
LISTA DE GRÁFICOS
Página
Gráfico 1. Porcentaje de mortalidad………………………………………………..16
Gráfico 2. Comparaciones de longitudes de brotes en los tratamientos A, B, C y
D………………………………………………………………………………………..19
Gráfico 3. Comparación de las medias del crecimiento de las hojas en los
tratamientos A, B, C y D …………………………………………………………..…21
Gráfico 4. Medias de las longitudes de las raíces de los tratamientos A, B, C y D
con relación a los meses…………………………………………………………….23
X
LISTA DE TABLAS
Página
Tabla 1. Temperatura óptima de las orquídeas……………………………….…....4
Tabla 2. Longitud del brote en el tratamiento………………………………………18
Tabla 3. Análisis de varianza en la longitud del brote…………………………….18
Tabla 4. Número de hojas generadas de acuerdo a los tratamientos…………20
Tabla 5. Análisis de varianza en el número de hojas generadas……………….20
Tabla 6. Medias de la longitud de la raíz…………………………………………..22
Tabla 7. Análisis de varianza de la longitud de la raíz……………………………..22
Tabla
8.
Medio
de
cultivo
de
Murashige
&
Skoog
(ms,
1962),
modificado………………………………………………………………………….....31
Tabla 9. Se usó la fórmula de Murashige & Skoog (ms, 1962) y está constituido
de los siguientes reactivos químicos puros………………………………………..31
Tabla 10. Quelatos Murashige & Skoog (ms, 1962)……………………………...31
Tabla 11. Solución stock de vitaminas e inositol MS x 200………………….…..32
Tabla 12. Concentraciones de sacarosa……………………………………….….32
Tabla 13. Concentraciones de Phytagel……………………………………….….32
Tabla 14. Medios inicial (mg. Y g.)…………………………………………………33
XI
Tabla 15. Control mensual del tratamiento A………………………………………35
Tabla 16. Control mensual del tratamiento B……………………………..…..…..36
Tabla 17. Control mensual del tratamiento C…………………………………..….37
Tabla 18. Control mensual del tratamiento D………………………………………38
XII
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Ubicación geográfica Laboratorio Agrovitroparis……………………….10
Figura 2. Cortando la vara de la planta madre de Phalaenopsis violacea……..39
Figura 3. Materiales para la desinfectación………………………………………..39
Figura 4. Eliminando puntas blancas………………………………………………40
Figura 5. Formulación de los medios de cultivo…………………………………..40
Figura 6. Medio inicial………………………………………………………………..41
Figura 7. Contaminación por hongos micelados…………………………………..41
Figura 8. El rompimiento de la latencia de los explantes e inducción del
crecimiento……………………………………………………………………………42
Figura 9. Cambio de medio………………………………………………………….42
Figura 10. Toma de datos……………………………………………………………43
Figura 11. Última toma de datos…………………………………………………….43
XIII
1. INTRODUCCIÓN
El Ecuador es reconocido por poseer una gran diversidad de orquídeas;
muchas de las especies que existen están en peligro de extinción. La
deforestación ha provocado serios daños especialmente en las poblaciones de
orquídeas epífitas, las cuales, al ser tan especializadas en su ecología, se ven
seriamente afectadas por los cambios ambientales (Placencia, 2010).
La familia de las orquídeas es el grupo más diverso y extenso de plantas con
flor que existe. La diversidad en tamaño, forma y color, especialmente de sus
flores, las convierten en un atractivo como plantas ornamentales, aunque
también se han utilizado como comestibles, aromatizantes y medicinales (Chase,
et al., 2003; Dressler, 1993).
Aunque las orquídeas producen millones de semillas, poseen bajos
porcentajes de germinación en condiciones naturales, el endospermo que rodea
al embrión es muy reducido o no existe; por lo tanto, las orquídeas han
desarrollado relaciones simbióticas con hongos que digieren la materia orgánica
y transfieren los carbohidratos al embrión (Arditti & Ernets, 1993). Por ello la
capacidad genética de las orquídeas de formar inter-genéricos ha resultado en
la creación de un sin número de híbridos artificiales, muchos de los cuales
adquieren precios elevados en el mercado.
Conociendo esta realidad la investigación tuvo la finalidad de contribuir con un
aporte científico, mediante series de técnicas alternativas en tejidos in vitro de la
orquídea Phalaenopsis violacea, produciendo altos niveles de multiplicación, en
períodos de tiempos cortos y además asegurando la sanidad del material.
1
La propagación in vitro se perfila como una opción para resolver problemas,
ayudando en la conservación de especies nativas, sirviendo como base para
investigaciones de orquídeas en la propagación in vitro, permitiendo dar posibles
soluciones y ayudar a impedir la pérdida masiva del material biológico.
2
2. ANTECEDENTES
El término se deriva de la palabra orchisse orquídea, esta es el origen
etimológico de la familia de las Orquídeas, se originó entre los años 370 a.C. y
285 a.C., cuando fue usada por primera vez por el filósofo Teofrasto, discípulo
de Platón y de Aristóteles, conocido como el Padre de la Botánica
(Sequeira,1980).
Las orquídeas constituyen la familia más grande de las Angiospermas y por
lo tanto la más diversa (Abdelnour & Muñoz, 1997). El número de especies
fluctúa entre 17.000 y 35.000 especies conocidas, las cuales se agrupan en 650
a 900 géneros (Kuan & González, 1993).
Murguía & Lee (2004) señalan que las orquídeas requieren una temperatura
diurna de 55 a 90 ºF (13 a 32 ºC) y una temperatura nocturna de 50 a 70 ºF (10
a 21 ºC), dependiendo de sus necesidades particulares de cultivo. Se pueden
dividir en tres categorías: de clima frío, intermedio y cálido. El cultivo in vitro se
definió como cualquier procedimiento aséptico que comprenda la manipulación
de plantas, órganos, tejidos o células que produzcan poblaciones de plántulas.
La micropropagación clonal implica que cada una de las plántulas que se
producen pueda crecer y ser fenotípica y genotípicamente idéntica a la planta
original de la que se deriva (Krikorian, 1991).
3
Tabla 1. Temperatura óptima de las orquídeas
Clima
Orquídea
Frío
Cymbidium ,
Odontoglossum
Templado
Cattleyay
algunas
Oncidium
Phalaenopsis y
Vanda
Cálido
Temperatura
diurna óptima
10ºC
Temperatura
nocturna óptima
10ºC
10 a 24ºC
13 a 16ºC
21 a 30ºC
18 a 21ºC
Villalobos & Thorpe (1991) señalaron las siguientes ventajas del cultivo in
vitro:
a. Incremento acelerado del número de plantas derivadas por genotipo.
b. Reducción del tiempo de multiplicación.
c. Posibilidad de multiplicar grandes cantidades de plantas en una superficie
reducida, a bajos costos y en un tiempo económicamente costeable.
d. Mayor control sobre la sanidad del material que se propaga.
e. Facilidad para transportar el material in vitro de un país a otro, con menos
restricciones aduaneras.
f. Posibilidad de multiplicar rápidamente una variedad de la cual sólo existan
pocos individuos.
Villalobos & Thorpe (1991) señalaron las siguientes desventajas del
cultivo in vitro:
4
a. Requiere de implantación de una infraestructura y equipos costosos como la
cámara de flujo laminar.
b. El material químico empleado en la preparación de los medios de cultivo es
costoso y poco disponible en el mercado local.
c. No es posible instalar laboratorios in vitro donde no se cuenta con fluido
eléctrico o donde se presentan interrupciones periódicas.
d. Se requiere de personal de laboratorio especializado: biólogos, químicos,
fisiólogos, agrónomos.
Murashige (1974) encontró que era útil destacar la secuencia de eventos
asociados con la multiplicación de plantas mediante las técnicas de cultivo
aséptico, de la siguiente manera:
Etapa I. Iniciación o establecimiento (se establece el cultivo inicial o primario).
Etapa II. Multiplicación de brotes o multiplicación de plantas.
Etapa III. Corresponde al enraizamiento; tiene como objetivo producir una planta
autotrófica que pueda sobrevivir en las condiciones del trasplante al suelo.
Además de las anteriores, pueden considerarse otras dos etapas como parte
integral del procedimiento:
Etapa IV: Transferencia final a la etapa de medio ambiente.
Etapa 0. Etapa inicial, que comprende la selección de la planta madre y la
selección de una modalidad.
5
La micropropagación o propagación clonal, es una de las aplicaciones
más generalizadas del cultivo in vitro. A partir de un fragmento (explante) de una
planta
madre,
se
obtiene
una
descendencia
uniforme,
con
plantas
genéticamente idénticas, denominadas clones. El explante más usado para los
procesos de propagación in vitro son las yemas vegetativas de las plantas.
Morel (1974) utilizó tejido meristemático de yemas situadas en la base de
brotes jóvenes. Como medio de iniciación se sugieren varios medios de cultivo,
todos ellos líquidos:
a. Medio MS 1962 modificado conteniendo 0,1 mg/l de ANA, 0,2 mg/l de KIN y
15% (v/v) de agua de coco.
b. Otra modificación de medio MS 1962 enriquecido con 0,1 mg/l de ANA, 0,2
mg/l de KIN y 100 mg/l de caseína hidrolizada.
c. Medio de iniciación Lidemann et al. (1970) conteniendo 0,1 mg/l de ANA, 0,2
mg/l de KIN y 15% (v/v) de agua de coco, seguido de medio de mantenimiento
Lidemann et al. (1970), conteniendo 0,2 mg/l de A.N.A., 0,22 mg/l de KIN, 0,35
mg/l de ácido giberélico (AG3) y 15% de agua de coco y 100 mg/l de caseína
hidrolizada.
6
3. JUSTIFICACIÓN
Los híbridos de Phalaenopsis violacea tienen una gran importancia económica
a nivel mundial, como flor cortada y planta ornamental, debido a sus flores
vistosas y a la capacidad de adaptación a diferentes condiciones ambientales.
Las técnicas de cultivo in vitro resultan indispensables para mejorar la eficacia
germinativa, el crecimiento y desarrollo de orquídeas con fines comerciales e
investigativos.
El beneficio de la propagación es explorar el potencial de las yemas de
escapos florales de Phalaenopsis violacea, con flores senescentes sobre la
regeneración y multiplicación vegetativa, permitiendo la reproducción de una
planta individual notable por su rendimiento, resistencia, calidad y otras
condiciones favorables.
Ecuador es privilegiado por la diversidad de su hábitat, ecosistemas y cantidad
de recursos naturales; esto ha motivado a "un compromiso por la conservación
de las orquídeas”, con flores-enigmáticas y multicolores, sus olores que varían
indistintamente de la especie.
Es importante contar con un protocolo de propagación, que permita la
multiplicación asexual de las orquídeas; de esa manera se incrementaría la
expansión del comercio de estas flores a nivel mundial, sin riesgo para el
ecosistema.
7
4. HIPÓTESIS
HO: La orquídea Phalaenopsis violacea no muestra crecimiento in vitro,
estadísticamente significativo, en ninguno de los tratamientos.
HA: La orquídea Phalaenopsis violacea, muestra un crecimiento in vitro, que es
estadísticamente significativo al comparar los tratamientos mejorando la
sobrevivencia y crecimiento.
8
5. OBJETIVOS
5.1. OBJETIVO GENERAL
 Desarrollar la propagación de Phalaenopsis violacea mediante las
técnicas de cultivo en la yema floral.
5.2.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Establecer un protocolo de desinfección efectivo para explantes
Phalaenopsis violacea utilizando compuestos químicos fácilmente
disponibles y económicamente accesibles.
 Determinar los medios de cultivo en cada tratamiento para multiplicación
in vitro de orquídeas Phalaenopsis violacea.
 Determinar la capacidad de formación de cuerpos protocórmicos
Phalaenopsis violacea en los medios de cultivo de introducción
9
6. ÁREA DE ESTUDIO
Figura 1. Ubicación geográfica Laboratorio Agrovitroparis.
Lugar en donde se llevó a cabo la investigación, el laboratorio de cultivos
de tejidos in vitro de la empresa AGROVITROPARIS, cuya propietaria la Ing. Agr.
Laura Parismoreno Rivas ubicado:
Provincia:
Guayas
Cantón:
Daule
Dirección:
Av.Piedrahita y Jaime Roldós, Mz. 434
Latitud Sur:
1º51' 37,77”S (613866.52 UTM)1/
Longitud Occidental:
79º 58'34.42”W (9794326.09 UTM) 1/
Lugar que se recolectó la muestra: Gualaceo (Provincia del Azuay). Empresa
ECUAGENERA S.A.
10
La investigación se inició en el mes Octubre del 2013 y culminó en Mayo del
año 2014. Siguiendo la fase de protocolo, durante los meses mencionados, el
trabajo se llevó acabó en el laboratorio AGROVITROPARIS.
7. MATERIALES Y MÉTODOS
Hoja de bisturí.
Papel kraf.
Caja petri.
Papel aluminio.
Cámara vertical.
Marcador permanente.
Estereoscopio.
Tween 20.
Balanza de precisión.
Cloro.
Aguja.
Bicloruro de mercurio.
Medio de cultivo MS.
Phyton.
Agua destilada estéril.
Frascos de 200 ml.
Alcohol al 75%.
Refrigeradora.
Gradilla.
Autoclave.
Micropipeta.
Tubo de ensayo.
Agitador magnético.
Mechero de alcohol.
Tirillas de tornasol.
Lámparas UBV
Regla graduada
11
En la Investigación todos los instrumentos empleados fueron esterilizados en la
autoclave a 121 ºC y 15 libras de presión.
7.1 UNIDAD DE OBSERVACIÓN
Los frascos para el inicio fueron sellados con una lámina de aluminio,
envuelto en plástico transparente, en donde se dispensó 20 ml de los medios de
cultivos.
7.1.1. Procedimiento a realizar en el experimento:
Etapa 0 (día 1): El material vegetal de inicio fue las varas florales extraídas
de plantas madres de Phalaenopsis de un vivero ubicado en Gualaceo Provincia
del Azuay de propiedad de la Empresa ECUAGENERA. Las plantas madres
fueron seleccionadas por su buen aspecto físico, por su sanidad y buena calidad
para la exportación y fueron trasladadas hasta el laboratorio.
Etapa I (desde el día 1 hasta el día 30): Se siguió el proceso de
desinfección y disección descrito por Arditti (1977): Se cortaron los escapos, se
procedió lavar con agua corriente y jabón líquido por 20 minutos seleccionando
en segmentos con aproximadamente de 1 cm, y se desinfectaron con una
solución de hipoclorito de sodio (0.525% v/v) adicionada con 15 ml de Tween 20
por cada 1000 ml de solución, por 20 minutos. Se desinfectaron de nuevo con
hipoclorito de sodio (0.2625% v/v) con Tween 20 por 15 minutos en agitación.
Luego se lavaron tres veces con agua destilada estéril.
Establecimiento de parámetros físicos: Los explantes obtenidos fueron de
acuerdo a la técnica de Knudson,1921: Cultivados en un cuarto a una
temperatura de 24 ± 2 ºC, un fotoperiodo de 16 horas luz, 8 horas de oscuridad
12
controlada con un tiempo y una intensidad lumínica de 2500-3000 lux provista
por fluorescentes de luz blanca.
Inducción de explantes: Una vez desinfectados los explantes, procedimos
a colocarlos sobre un papel estéril, luego eliminamos las puntas blancas y
sumergimos las microestacas en una solución de cisteína estéril, para finalmente
secar en papel estéril y sembrarlos en los respectivos tratamientos. En el
momento de la siembra, la boca del frasco debe estar cerca del mechero de
alcohol, para evitar posibles infecciones, los frascos se sellaron con rolopac y los
identificamos (fecha de siembra, generación y tratamiento) rotulando con un
marcador permanente. Posteriormente se sembró uno en cada frasco con medio
de cultivo, A, B, C, D.
La formulación química se puso en cada frasco en esta etapa como indica la
tabla 14.
A. White, 1934.
B. White, Y MS (plátano licuado, carbón activado).
C. Murashige & Skoog, (MS) 1962 (plátano licuado, agua de coco).
D. Vacin & Went, 1949 (agua de coco).
Etapa II (desde el día 30 hasta los 90 días): En esta fase los brotes
manifestaron un enverdecimiento y aumento de tamaño. Había contaminaciones
de hongos presentes y ocasionando la pérdida de numerosos explantes.
13
Se notaron un engrosamiento en la cuarta semana, dentro de la cámara se
procedió a realizar el primer cambio de medio de cultivo, de esa manera evitar la
contaminación posterior muerte del tejido.
Etapa III (desde el día 91 hasta el día 120): En esta etapa continuó el
crecimiento de los brotes y realizamos la toma de datos con cada uno de los
tratamientos sobrevividos para evaluar las variables las que determinaron la
eficacia de cada tratamiento, induciéndoles químicamente a producir órganos
(hojas, raíces).
7.2.
DISEÑO EXPERIMENTAL Y PRUEBA DE RANGO MÚLTIPLE DE
TUKEY
Para el análisis estadístico, se utilizó un diseño completamente al azar, y la
prueba de Tukey para ver si existen diferencias estadísticas significativas entre
los tratamientos.
F.V.
Tratamiento
S.C.
nT12+nT22+
nT32…
G.L.
n-1
C.M.
S.C.Trat/G.L.
Trat
Error
S.C.Total+S
.C.Trata
n12+n22+n32Fc
n-k
S.C.E/G.L.E
Total
Tukey = Ft x √
G.L.T+
G.L.E
𝐶.𝑀.𝐸
𝑅
Características del experimento
Número de tratamientos: 4
14
Fc
C.M.Trat/C.
M.E
Ft 0.01
G.L.Trata;
G.L.E
Número de repeticiones: 20
Cálculo de porcentaje de contaminación
𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑜𝑠
∗ 100
𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠
15
8. RESULTADOS
Los datos obtenidos de las variables (longitud del brote, número de hojas y
longitud de la raíz), para cada uno de los tratamientos se evaluaron.
8.1. ETAPA 0 – I INICIACIÓN:
En Octubre y Noviembre se inició la fase de introducción se contaron los
explantes contaminadas, tomándose en cuenta con signos de hongos, bacterias
y levaduras.
La supervivencia de los escapos o explante en el tratamientos D fueron
del 90%, mientras el tratamiento B 75%, tratamiento C 60% y el tratamiento A
50%.
PORCENTAJE DE MORTALIDAD
50%
45%
40%
35%
30%
25%
50%
20%
40%
15%
25%
10%
5%
10%
0%
TRATAMIENTO A
TRATAMIENTO B
TRATAMIENTO C
TRATAMIENTO D
Gráfico 1. Porcentaje de Mortalidad
De los resultados obtenidos de porcentaje de mortalidad, se puede
señalar que el tratamiento D presentó el 10% lo que indica que la utilización de
16
la agua de coco en el medio es favorable ya que es estéril, mientras que en el
tratamiento B es el 25%, en el tratamiento C el 40% y en el A el 50% por la
adición de banano, por lo cual se incrementaba el número de tubos
contaminados. Básicamente, la contaminación fue causada por hongos, pues se
evidenció la presencia de micelio.
8.2.
ETAPA II MULTIPLICACIÓN:
Se notaron un enverdecimiento en el mes de Diciembre y aumento de tamaño.
En esta etapa fue complicada, debido a la alta contaminación en especial de
hongos presentes, ocasionando la pérdida de numerosos explantes. Luego de
estar libre de contaminación, dentro de la cámara se procedió a realizar el 1er
cambio de medio de cultivo.
8.3.
ETAPA III. CORRESPONDE AL ENRAIZAMIENTO:
En esta etapa en el mes de Diciembre continuaron los brotes, se tomaron los
datos con cada uno de los tratamientos sobrevividos para evaluar las variables
para determinar la eficacia de cada tratamiento. En los tratamientos, se
consideraron los datos de acuerdo a la tabla 15, 16, 17, 18, tomando como
referencia las medias para las respectivas comparaciones.
17
Tabla 2. Longitud del brote.
Tratamiento
A
B
C
D
Diciembre
1.5
1.8
0.9
5.7
Enero
2.2
3.2
2.5
6.3
Febrero
3.3
6.4
4.7
12.2
Marzo
4.5
8.8
6.2
30.6
Abril
5.6 11.7
7.7
39.6
Mayo
6.9 17.4
9
40
∑Total
24
49.3
31
134.4
X̅
4
8,22 5.17
Meses
22.4
Tabla 3. Análisis de varianza en la longitud del brote.
F.V.
S.C.
G.L.
C.M.
Fc
Ft 0.01
Tratamiento
1235.58
3
4111.86
39.79**
4.94
Error
207.17
20
10.35
Total
1442.75
23
Prueba de rango múltiple de Tukey
D&B
22.4 - 8.22
14.18 > 7.93
D&C
22.4 - 5.17
17.23 > 7.93
D&A
22.4 – 4
18,4 > 7.93
B&C
8.22 - 5.17
3.05 < 7.93
B&A
8.22 – 4
4.22 < 7.93
C &A
5.17 – 4
1.17 < 7.93
18
Tukey = 4.94 x √
10.35
4.94 x 1.60 = 7.93
4
De acuerdo a la prueba de tukey (0.01), hay diferencia altamente
significativa entre los tratamientos.
Los tratamientos A, tratamiento B y tratamiento C son iguales
estadísticamente entre sí, a diferencia del tratamiento D.
Comparación de longitud del brote
22,4
22
20
Longitud del brote
18
16
14
12
10
8,22
8
6
5,17
4
4
2
0
TRATAMIENTO A
TRATAMIENTO B
TRATAMIENTO C
TRATAMIENTO D
Gráfico 2. Comparaciones de longitudes de brotes en los tratamientos A, B, C y
D.
De acuerdo al gráfico 2. en el tratamiento A hay un crecimiento de 4 cm,
y el tratamiento C de un 5.17 cm no hay diferencias en su crecimiento, ya que no
fueron medios adecuados para desarrollo, mientras en el tratamiento D hay una
mayor longitud de un 22.4 cm y el tratamiento B de 8.22 cm, como indica la tabla
2. Sus medios fueron favorables con la adición de compuestos orgánicos, por la
presencia de azúcares, magnesio y fosfatos.
19
Tabla 4. Número de hojas generadas de acuerdo a los tratamientos
Tratamiento
A
B
C
D
Enero
1
3
1
5
Febrero
1
3
1
5
Marzo
1
3
1
5
Abril
1
3
1
5
Mayo
1
3
1
5
∑Total
5
15
5
25
X̅
1
3
1
5
Meses
Tabla 5. Análisis de varianza en el número de hojas generadas.
F.V.
S.C.
G.L.
C.M.
Fc
Ft 0.05
Tratamiento
55
3
18.33
2.35 n.s
3.24
Error
125
16
7.8
Total
180
19
De acuerdo a la tabla 5. no hay significancias entre los tratamientos A, B,
C, D, estadísticamente iguales.
20
Comparación de las medias del crecimiento de las hojas
5
5
4,5
Número de hojas
4
3,5
3
3
2,5
2
1,5
1
1
1
0,5
0
TRATAMIENTO A
TRATAMIENTO B
TRATAMIENTO C
TRATAMIENTO D
Gráfico 3. Comparación de las medias del crecimiento de las hojas en los
tratamientos A, B, C y D.
En el gráfico 3. no presenta diferencias entre los tratamientos, en relación
a la media; en comparación del tratamiento D con un 5 cm como indica la tabla
4. Generando 6 hojas, en oposición con el tratamiento A que tuvo 1 cm de su
media, con 2 hojas.
21
Tabla 6. Longitud de la raíz.
Tratamiento
A
B
C
D
Enero
1.0
1.5
0.9
10.5
Febrero
2.0
6.5
2.8
13.5
Marzo
3.1
7.1
3.2
16.8
Abril
3.5
8.7
4.2
20.3
Mayo
∑Total
X̅
4.5 11.9 5.3 25.5
14.1 35.7 16.4 86.6
2.82 5.95 3.28 17.32
Meses
Tabla 7. Análisis de varianza en la longitud de la raíz.
F.V.
Tratamiento
Error
Total
S.C.
G.L.
C.M.
Fc
680.97
3
266.99
20.09 **
212.66
16
13.29
893.63
19
Prueba de rango múltiple de Tukey
Ft 0.01
3.24
D&B
17.32 - 5.95
11.73 > 5.89
D&C
17.32 – 3.28
14.04 > 5.89
D&A
17.32 – 2.82
14.5 5.89
B&C
5.95 – 3.28
2.67 < 5.89
B&A
5.95 - 2.82
3.13 < 5.89
C&A
3.28 – 2.82
0.46 < 5.89
2.82
5.95
3.28
17.32
A
B
C
D
22
Tukey = 3.24 x √
13.29
3.24 x 1.82= 5.89
4
Los tratamientos A, tratamiento B y tratamiento C son iguales
estadísticamente entre sí, por lo tanto el tratamiento D es superior de acuerdo a
la prueba de Tukey (0.01).
Comparación de las longuitudes de las raíces.
17,32
18
16
Longitud de la raíz
14
12
10
8
5,95
6
4
3,28
2,82
2
0
TRATAMIENTO A
TRATAMIENTO B
TRATAMIENTO C
TRATAMIENTO D
Gráfico 4. Medias de las longitudes de las raíces de los tratamientos A, B, C y
D con relación a los meses.
De acuerdo a la tabla 6. El tratamiento A tienen una media de 2.82 con una
longitud de 0.5 cm; en cambio el tratamiento D tiene una media de 17.32 y una
longitud de 1.6 cm, tuvo mayor crecimiento con la adición del agua de coco que
fue beneficioso para el medio.
23
9. DISCUSIÓN
El trabajo realizado por Pierik (1990), la contaminación del medio y la mala
desinfección fue de 60%, provocaron la muerte de los explantes de Cymbidium
sp., debido a la deficiente capacidad de absorción de nutrientes, esto sucedió en
los tratamientos A con 50% y C 40% Phalaenopsis violacea (grafico 1, figura 7).
Pierik (1990) y Arditti & Ernets (1993), consideraron la etapa I lo cual
observaron mayor imbibición; en el tratamiento D presento hinchamiento
pronunciado y una coloración verde pálida. La adición del agua de coco permite
mayor fuerza en el crecimiento (Vacin & Went, 1949) siendo una respuesta
favorable se pudo observar en el tratamiento D (figura 8).
Durante la etapa III, las longitudes de los brotes (TB) con la el uso extractos
de frutas en los tratamientos A fue 4 cm y C de 5.17 cm, a diferencia de Stancato
(2008) dio como resultado una longitud de 20.2 cm (tablas 2 – 3).
Los tratamientos que no contienen componentes orgánicos muestran tallas
bajas en las formaciones de plántulas (figura 8), por lo tanto, se observaron los
mejores resultados al agregar al medio de cultivo agua de coco, esto confirma lo
dicho por Nongrum et al. (2007) y Abbas et al. (2011), quienes concluyeron que
la adición de coco al medio de cultivo ejerce un efecto benéfico en la germinación
y el desarrollo de tejidos celulares.
24
10. CONCLUSIÓN
La mejor respuesta se obtuvo en los tratamientos B (plátano licuado y carbón
activado) y D (agua de coco) observándose el crecimiento de las yemas, con la
formación de las primeras hojas en la mayoría de los explantes también la
aparición de raíces vigorosas, debido a que agua de coco es un medio muy
completo.
El método utilizado en el presente trabajo demuestra la posibilidad de obtener
plantas de Phalaenopsis violacea a partir de inflorescencia senescentes
cultivadas. Lo importante es la obtención de plantas completas y trasferidas a
condiciones de campo en un período de 6 meses.
El uso de componentes orgánicos como el plátano no fue favorable por lo
tanto, hubo mayor oxidación y contaminación.
25
11. RECOMENDACIONES
 Realizar estudio con las fases de micropropagación y acondicionamiento
ex- vitro de la orquídea Phalaenopsis violacea.
 Utilización de compuestos orgánicos en los medios.
 Desinfección en el manejo de compuestos orgánicos (frutas).
26
12. BIBLIOGRAFÍA
Abbas, B., F. Heningtyas, & B. Amriati. 2011. In vitro seeds germination and
plantlets
development
of
Grammatophyllum
scriptum
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of
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John
Waley&
Sons,
Inc.25-86,199-240p.
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Dressler, R. 1993. Field guide to the orchids of Costa Rica and Panama. New
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San Jose, Costa Rica. Instituto nacional de aprendizaje. pp 1-16, 47-53,
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Knudson, L. 1921. La Germinación no Simbiótica de las Semillas de orquídeas.
Bol. Soc. Esp. Hist. Nat. 21:250-260
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Mroginski. Cali, Colombia CIAT (Centro Internacional de agricultura). pp
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Ed. Por Withner C. New York, United States of America. John Wiley and
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Physiology. 25:135-166.
Murschige, T. & F. Skoog. 1962. A revised médium for rapid growth and Biossays
with tobacco tissue cultures.Physiol Plant 15:473-497.
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www.funprover.org/agroentorno/enero/pdfs/orquídeas.pdf.
Nongrum, L., S. Kumaria & P. Tandon. 2007. The influence of in vitro media on
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Vacin, E. & F. Went. 1949. Some pH changes in nutrient solution. Botanic. Gaz.
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White, P. 1934. Potentially unlimited growth of excised tomato root tips in a liquid
medium. Plant Physiol. 9:585-600.
30
13. ANEXOS
Tabla 8. Medio de cultivo de Murashige & Skoog (ms, 1962), modificado.
Macronutrientes
Reactivo
NH4NO3
KNO3
CaCl2. 2H2O
Nitrato de amonio
Nitrato de potasio
Cloruro de calcio
Fosfato de potasio
monobásico
Sulfato de magnesio
KH2PO4
Mg SO4·7H2O
Concentración mg/L
1.0650.00
1.900.00
332.02
170.00
80.70
Tabla 9. Se usó la fórmula de Murashige & Skoog (ms, 1962) y está constituido
de los siguientes reactivos químicos puros.
Reactivos
KI
Yoduro de potasio
Concentración en
mg/L
0.83
H3BO3
Ácido bórico
6.20
MnSO4.4H2O
Sulfato de magnesio
22.30
ZnSO4. 7H2O
Sulfato de zinc
8.60
Na2MoO4. 2H2O
Molibdato de sodio
0.25
CuSO4. 5H2O
Sulfato de cúprico
0.025
CoCl2. 6H2O
Cloruro de cobalto
0.025
Tabla 10. Quelatos Murashige & Skoog (ms, 1962).
Reactivos
FeSO4 .7H2O
Sulfato ferroso
Na2EDTA. 2H2O
Ácido Etilen-diaminotetraacético-disodio
31
Concentración en g/L
5.57
7.45
Tabla 11. Solución stock de vitaminas e inositol MS x 200 ml.
Vitaminas
Reactivos
C6H12O6
Mio- inositol
(Vitamina B8)
C12H17N4OS+
Tiamina HCL
(Vitamina B1)
C21H27N7O14P2
Acido nicotínico
(Vitamina B3)
C10H16N2O3S
Biotina (Vitamina
B7)
C18H32CaN2O1
Pantotenato de
0
calcio (Vitamina B5)
C8H11NO3
Piridoxina HCL
(Vitamina B6)
Concentració
n mg/L
100.00
1.00
1.00
0.01
1.00
1.00
Tabla 12. Concentraciones de sacarosa.
Nombre
Sacarosa (Azúcar)
C12H22O11
Tabla 13. Concentraciones de Phytagel.
Nombres
Phytagel
Concentración
en g/L
C6H12O6 + sphingomonas elodea
1.5
32
Tabla 14. Medios inicial (mg. Y g.).
Nombre
Formula
química
Ca3 (P04)2
MgS04.7H2
0
KN03
Fosfato de calcio
Sulfato de
magnesio
Nitrato de
potasio
Fosfato de
KH2P04
potasio
monobasico
Fe(C4H406)3
Sulfato de
MnS04.4H2
Manganeso
0
tetrahidratado
Nitrato de calcio Ca(N03)2.4
H20
Dihidrógeno
NaH2S04
fosfato de sodio
fosfato de sodio NaH2P04.H
dibásico
20
Cloruro de
KCL
potasio
Vitaminas Morel
Sacarosa
C12H22O1
1
Ácido cítrico
C6H8O7
Carbón activado
BAP (inicio) solución liquida
ANA solución liquida
Thidiazurón
TDZ
Cysteína
C3H7NO2S
Macroelementos
MS
Microelementos
Ms
Ácido etilenNa2EDTA.
diamino2H2O
tetracéticodisodio
Plátano licuado
Agua de coco
Tratamiento
A
X
737,5 mg
Tratamiento
B
X
737,5 mg
Tratamiento
C
X
X
Tratamiento
D
200 mg
250 mg
80,0 mg
80,0 mg
X
525 mg
X
X
X
250 mg
X
X
X
X
X
X
28 mg
7.5 mg
288,0 mg
288,0 mg
X
x
200,0 mg
200,0 mg
19,0 mg
19,0 mg
X
x
65,0 mg
65,0 mg
X
x
10ml
20 g
10ml
20 g
10ml
20 g
40 g
125 mg
X
0.5 ml
4 ml
1 mg
0,25 mg
X
125 mg
1g
0.5 ml
4 ml
0,5 mg/
0,25 mg
X
125 mg
X
0.5 ml
4 ml
1 mg/l
0,25,mg
100 ml
125 mg
x
0.5 ml
x
x
0,25 mg
x
1 ml
1ml
1 ml
x
5 ml
5ml
5 ml
x
X
X
X
X
40 g/l
200 ml
x
200 ml
33
x
Sulfato de
(NH4)2
amonio
SO4
Phytagel
Ph
X
X
X
500 ml
1,5 g/lL
5
1,5 g/l
5
1,5 g/l
5
1,5 g/l
5
34
Tabla 15. Control mensual del tratamiento A.
Repeticiones
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
XIV
XV
XVI
XVII
XVIII
XIX
XX
30/1 30/11/2
0/20
013
13
Contaminación
1
-
1
-
1
1
1
-
1
-
1
1
1
1
-
30/12/2
013
30/01/2014
Meses
27/02/2014
30/03/2014
30/04/2014
30/05/2014
LB
LB
NH
LR
LB
NH
LR
LB
NH
LR
LB
NH
LR
LB
NH
LR
0.1
0.2
0.1
0.2
0.2
0.1
0.2
0.2
0.1
0.1
-
0.2
0.3
0.2
0.2
0.2
0.2
0.3
0.2
0.2
0.2
-
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
-
0.1
01
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
-
0.3
0.3
0.4
0.3
0.3
0.3
0.4
0.3
0.3
0.4
-
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
-
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
-
0.4
0.4
0.5
0.5
0.5
0.4
0.5
0.4
0.4
0.5
-
1
1
1
1
1
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
-
0.6
0.5
0.6
0.6
0.6
0.5
0.6
0.5
0.5
0.6
-
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
-
0.4
0.3
0.3
0.4
0.4
0.3
0.4
0.3
0.3
0.4
-
0.7
0.6
0.7
0.8
0.7
0.6
0.7
0.6
0.6
0.9
-
1
-
0.5
0.4
0.4
0.5
0.5
0.4
0.5
0.4
0.4
0.5
-
35
1
1
2
2
-
1
1
1
1
1
2
2
-
Tabla 16. Control mensual del tratamiento B.
Repeticiones
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
XIV
XV
XVI
XVII
XVIII
XIX
XX
30/1 30/11/2
0/20
013
13
Contaminación
1
-
1
1
-
1
1
-
30/12/20
13
30/01/2014
Meses
27/02/2014
30/03/2014
30/04/2014
30/05/2014
LB
LB
NH
LR
LB
NH
LR
LB
NH
LR
LB
NH
LR
LB
NH
LR
0.1
0.1
0.2
0.1
0.1
0.2
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.2
0.1
0.1
0.3
0.2
0.3
0.2
0.2
0.3
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.3
0.2
0.2
3
2
4
3
2
2
2
3
3
4
3
2
1
2
4
0.1
0.1
0.1
0.2
0.1
0.2
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.5
0.4
0.5
0.5
0.5
0.5
0.4
0.6
0.5
0.4
0.5
03
0.4
0.6
0.5
3
2
4
3
2
2
2
3
3
4
3
2
1
2
4
0.2
0.3
0.2
0.3
0.3
0.3
0.2
0.2
0.2
0.2
0.3
0.2
0.3
0.3
0.3
0.6
0.7
0.8
0.6
0.7
0.6
0.5
0.8
0.7
0.6
0.7
0.5
0.6
0.8
0.7
3
2
4
3
2
2
2
3
3
4
3
2
1
2
4
0.3
0.5
0.3
0.5
0.4
0.5
0.4
0.3
0.3
0.4
0.5
0.3
0.6
0.4
0.5
1
0.9
1
0.8
0.9
0.8
0.7
1
0.9
1
0.9
0.6
0.8
1
1.1
3
2
4
3
2
2
2
3
3
4
3
2
1
2
4
0.5
0.6
0.4
0.6
0.5
0.6
0.6
0.5
0.6
0.6
0.7
0.6
0.7
0.5
0.7
1
1.2
1.3
1.5
1.4
1.5
1.2
1.4
1.3
1.5
1.1
1.4
1.3
1.2
1.5
3
2
4
3
2
2
2
3
3
4
3
2
1
2
4
0.7
0.8
0.6
0.8
0.7
0.8
0.9
0.7
0.8
0.9
0.9
0.8
0.9
0.7
0.9
36
Tabla 17. Control mensual del tratamiento C.
Repeticiones
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
XIV
XV
XVI
XVII
XVIII
XIX
XX
30/1 30/11/2
0/20
013
13
Contaminación
1
-
1
1
1
1
1
-
1
1
-
30/12/2
013
30/01/2014
Meses
27/02/2014
30/03/2014
30/04/2014
30/05/2014
LB
LB
NH
LR
LB
NH
LR
LB
NH
LR
LB
NH
LR
LB
NH
LR
0
0.1
0.1
0
0.1
0.1
0
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
-
0.2
0.3
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
-
1
1
1
2
1
2
1
1
1
1
1
2
-
0
0.1
0
0.1
0.1
0.1
0
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
-
0.4
0.5
0.3
0.3
0.4
0.3
0.4
0.5
0.4
0.3
0.4
0.5
-
1
1
1
2
1
2
1
1
1
1
1
1
-
0.2
0.3
0.2
0.3
0.2
0.2
0.2
0.3
0.2
0.2
0.3
0.2
-
0.4
0.6
0.5
0.4
0.5
0.4
0.5
0.6
0.5
0.5
0.6
0.7
-
1
1
1
2
1
2
1
1
1
1
1
2
-
0.2
0.4
0.2
0.3
0.3
0.2
0.3
0.4
0.2
0.3
0.3
0.3
-
0.6
0.7
0.5
0.5
0.6
0.6
0.7
0.7
0.6
0.7
0.7
0.8
-
1
1
1
2
1
2
1
1
1
1
1
2
-
0.3
0.4
0.2
0.3
0.3
0.3
0.5
0.5
0.3
0.4
0.4
0.4
-
0.8
0.8
0.6
0.7
0.7
0.7
0.8
0.8
0.7
0.8
0.8
0.8
-
1
1
1
2
1
2
1
1
1
1
1
2
-
0.4
0.5
0.3
0.5
0.4
0.5
0.6
0.6
0.3
0.4
0.4
0.4
-
37
Tabla 18. Control mensual del tratamiento D.
Repeticion
es
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
XIV
XV
XVI
XVII
XVIII
XIX
XX
30/10 30/11/
/2013
2013
Contaminación
1
1
Meses
27/02/2014
30/12/2
013
LB
30/01/2014
LB
NH
LR
LB
NH
LR
LB
NH
LR
LB
NH
LR
LB
NH
LR
0.3
0.4
0.3
0.2
0.3
0.2
0.2
0.4
0.3
0.2
0.4
0.3
0.3
0.5
0.4
0.3
0.4
0.3
3
3
3
4
5
3
5
3
6
4
5
4
6
4
6
4
5
5
3
3
3
4
5
3
5
3
6
4
5
4
6
4
6
4
5
5
0.6
0.7
0.5
0.7
0.5
0.5
0.6
0.7
0.5
0.4
0.6
0.5
0.7
0.7
0.5
0.6
0.7
0.5
1
1.2
1.3
1.5
1.2
1.3
1.4
1.5
1.2
1.6
1.3
1.5
1.2
1.5
1.6
1.5
1.2
2.5
3
3
3
4
5
3
5
3
6
4
5
4
6
4
6
4
5
5
0.7
0.8
0.7
0.9
0.7
0.6
0.8
0.8
0.7
0.6
0.8
0.7
0.8
0.9
0.6
0.8
0.8
0.8
1.5
1.6
1.6
1.8
1.7
1.8
1.9
1.7
1.5
1.7
1.6
1.2
1.7
1.9
2
1.8
1.6
2.
3
3
3
4
5
3
5
3
6
4
5
4
6
4
6
4
5
5
0.9
1
0.8
1
1
0.8
1
0.9
0.9
0.8
1
0.9
1
1
0.8
1
1
1
1.8
3
3
3
4
5
3
5
3
6
4
5
4
6
4
6
4
5
5
1
1.1
1.1
1.2
1.1
1
1.2
1
1
1
1.3
1
1.2
1.3
1
1.3
1.2
1.3
2.1
2.3
2.2
2.6
2.3
2.4
2.6
2.7
2.8
2.8
2.5
2.6
2.4
2.6
2.6
2.9
2.7
2.9
3
3
3
4
5
3
5
3
6
4
5
4
6
4
6
4
5
5
1.4
1.3
1.2
1.3
1.4
1.2
1.5
1.5
1.4
1.6
1.5
1.4
1.5
1.6
1.3
1.4
1.4
1.6
38
30/03/2014
30/04/2014
1.9
1.9
2.4
2
2.1
2.3
2.3
2.5
2.6
2.3
1.9
2
2.3
2.4
2
2.4
2.5
30/05/2014
Figura 2. Cortando la vara de la planta madre Phalaenopsis violacea.
Figura 3. Materiales para la desinfectación.
39
Figura 4. Eliminando puntas blancas.
Figura 5. Formulación de los medios de cultivo.
40
Figura 6. Medio inicial.
Figura 7. Contaminación por hongos micelados.
41
Figura 8. El rompimiento de la latencia de los explantes e inducción del
crecimiento
Figura 9. Cambio de medio.
42
Figura 10. Toma de datos
Figura 11. Última toma de datos.
43