11.35_Urrutia Anaya color - Universidad Autónoma de Querétaro

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Pythium sp ,UN FITOPATÓGENO DE
INTERÉS AGRÍCOLA EN EL ESTADO DE QUERÉTARO
Urrutia Anaya, I; Pacheco Aguilar, J. R.
Laboratorio de Plantas y Biotecnología Agrícola. Facultad de Química
Universidad Autónoma de Querétaro
RESUMEN
En la producción agrícola, los hongos fitopatógenos originan importantes pérdidas económicas,
debido a problemas como el damping-off (“ahogamiento” y “marchitamiento”), causado por una
compleja asociación de hongos que incluyen los géneros de Phytophthora y Pythium. Este
último género ha sido aislado por técnicas basadas en sus requerimientos nutricionales y de
desarrollo. En el presente trabajo se obtuvo un inóculo a partir del fruto de chile (Capsicum
annuum) el cual sirvió como “cebo” para el desarrollo de Pythium, cultivándolo posteriormente
sobre placas de agar Jugo v8® modificado y agar harina de maíz, ambos medios suplementados
con antibióticos. Encontrando que en el medio de Jugo V8® se obtuvo un mejor desarrollo
debido a la presencia de componentes como los fitoesteroles y vitaminas que favorecieron el
desarrollo de estructuras reproductivas que son cruciales para la identificación de este tipo de
hongo.
INTRODUCCIÓN
A nivel mundial los hongos fitopatógenos originan grandes pérdidas en la producción de
hortalizas, plantas ornamentales y forestales. El ciclo de vida de los hongos fitopatógenos
transcurre entre las plantas hospederas y el suelo, por lo tanto, la supervivencia y patogenicidad
de los hongos depende de las condiciones ambientales (humedad y temperatura) y características
intrínsecas de las plantas (resistencia) (Agrios, 1996).
Pythium, es la causa del ahogamiento de las plántulas, la pudrición de la semilla, raíz y frutos
carnosos, además de otros órganos que se encuentran en contacto con el suelo (Agrios, 1996).
Pythium es un oomiceto clasificado dentro de la familia Pythiaceae, el cuál es excluido del grupo
de los hongos verdaderos e incluido en el reino cromista de acuerdo a una nueva clasificación
debido a que la mayor parte de su ciclo de vida es diploide mientras que los otros hongos son
haploides (Ko, 1998).
Cuando una planta es atacada por Pythium, las hifas penetran los tejidos por medio de celulasas,
y una vez que logran colonizar el tejido, forman estructuras reproductivas para generar oosporas.
Las oosporas se consideran estructuras de resistencia, que le permiten sobrevivir en el suelo hasta
volver a infectar una nueva planta. Se ha reportado que la presencia de fitoesteroles promueve el
desarrollo de oosporas (Ayers y Lumsden, 1975; Ko, 1998) por lo que son empleados para el
aislamiento y cultivo de este hongo en laboratorio. Las oosporas es el producto sexual de la
fusión de un oogonio y uno o varios anteridios. Algunos reportes sugieren que la reproducción de
Pythium es homotálica, es decir que no se requiere otro organismo para poder producir
estructuras reproductivas, sin embargo, también se han encontrado casos de reproducción
heterotalica (Ko, 2008).
Para el aislamiento e identificación de Pythium se han elaborado medios que permiten estimular
la formación de las estructuras anteriormente mencionadas para rápida identificación, ya que en
Pythium y Phytophthora la morfología de los esporangios es clave para su determinación
(Capavizas y col, 1980; Koneway, 1985; Jeffers y Martin, 1986; Ko, 2008). Por otro lado, para
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obtener un inóculo se han empleado frutos, hojas o semillas como “cebos” en recipientes con
suelo anegado, donde se sospecha la presencia de Pythium (Dhingra y Burton, 1995).
MATERIALES Y MÉTODOS
Para la obtención del inóculo de Pythium, se emplearon frutos de chile (Capsicum annuum) como
“cebo”, colocándolos en una charola que contenía suelo humedecido a saturación (Dhingra y
Burton, 1995), hasta observar crecimiento de micelio en el fruto. El aislamiento se llevo a cabo
empleando los medios de cultivo agar Jugo v8® y agar harina de maíz (Atlas, 2005)
suplementados con los antibióticos siguientes: pimaricina 10 mg l-1, vancomicina 200 mg l-1,
pentanitroclorobenceno (PCNB) 100 mg l-1 y rosa de bengala 5 mg l-1 (Capavizas y col, 1980;
Koneway, 1985; Jeffers y Martin, 1986). El agar Jugo v8® se preparó de acuerdo a Atlas (2005),
y contenía por litro de medio: jugo V8 352 ml, CaCO3 5 g, CaCl2 100 mg, Fitoesterol 30 mg,
tiamina 1 mg y triptófano 20 mg. Las placas fueron mantenidas a 30°C hasta observar el
crecimiento de micelio y desarrollo de estructuras.
RESULTADOS
Después de tres semanas, los frutos de chile mostraron crecimiento de micelio, de donde se
obtuvo un inóculo (fig. 1), el cual fue sembrado en cajas con medio agar Jugo v8® y agar harina
de maíz. El crecimiento fue distinto en cada uno de los medios, por un lado en el medio agar
harina de maíz el micelio no tuvo crecimiento aéreo ya que creció entre el agar y sólo una
porción aérea de este se presentó en el centro de la caja petri donde se sembró el inoculo (fig. 2),
mientras que en el medio de Jugo V8® se presentó un abundante crecimiento miceliar (fig. 3)
saturando la caja petri.
Fig. 1. “cebos” de fruto de chile (C. annuum) con
crecimiento de Pythium sp.
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Fig. 3. Crecimiento de Pythium sp. en agar
Fig. 2. Crecimiento de Pythium sp. sobre agar harina de maíz.
I) Crecimiento de micelio entre el agar. II) Parte aérea del Jugo V8®
micelio.
De acuerdo a la morfología de Pythium, éste se caracteriza por que en las estructuras sexuales, el
anteridio rodea al oogonio (paraginio) y de acuerdo con las observaciones al microscopio se pudo
identificar que en el medio agar harina de maíz no se desarrollaron estructuras reproductivas, sólo
se observaron esporangios inmaduros; mientras que en el agar de Jugo V8® se pudieron observar
estructuras reproductivas y formación de oosporas perfectamente distinguibles, sin embargo, no
se encontraron zoosporas, ya que de acuerdo con Ko (2008) no necesariamente se producen
zoosporas cuando hay producción de oosporas. En general se puede observar parte del ciclo de
vida de Pythium en los medios de cultivo (Fig. 4).
Fig. 4. Secuencia en el desarrollo de estructuras reproductivas de Pythium sp. en los medios agar harina de maíz y
Jugo V8®.
I) Esporangióforo, II) Esporangióforo, III) Oogonio, IV) Oosfera, V) Anteridio, VI) Oospora.
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CONCLUSIONES
1.- Con este método se pudo obtener un aislado de Pythium proveniente de suelo, posible
patógeno de chile.
2.- El medio Jugo V8® enriquecido con fitoesteroles y vitaminas resulto óptimo para un mejor
crecimiento y desarrollo de estructuras de una fase del ciclo de vida de Pythium, que permitieron
su identificación.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Agrios, G. N. Fitopatología. Noriega Editores. México, D. F, 1996
Atlas, R. M. Media for Environmental Microbiology. Taylor and Francis ed. Boca ratón, Florida,
2005
Ayers, W. A. y Lumsden, R. D. Factors Affecting Prpduction and Germination of Oospores of
Three Pythium Species. Phytopathology. 65, 1094-1100, 1975
Conway, K. E. Selective medium for isolation of Pythium spp. from soil. Plant Disease 69, 393395, 1985
Dhingra, O. D y Burton, J. Basic Plant Pathology Methods. CRC press, Cleveland, Ohio, 1995
Jeffers, S. N. y Martin, S. B. Comparision of two media selective for Phytophthora and Pythium
species. Plant disease 70, 1038-1043, 1986
Ko, W. Chemical stimulation of sexual reproduction in Phytophthora and Pythium. Bot. Bull.
Acad. Sin. 39, 81-86, 1998
Papavizas, G. C., Bowers, J. H. y Johnson, S, A., “Selective isolation of Phytophthora capsici
from soils. Phytopathology 71, 129-133, 1981
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