Benemérita Universidad Autónoma de Puebla Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas
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Benemérita Universidad Autónoma de Puebla Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas Posgrado en Microbiología ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DEL GENE aaT1 QUE CODIFICA UNA AMINO TRANSFERASA INVOLUCRADA EN LA BIOSÍNTESIS DE ÁCIDO INDOL ACÉTICO EN Azospirillum brasilense SP7 TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS (MMICROBIOLOGÍA) CON OPCIÓN EN: BIOQUÍMICA Y GENÉTICA MICROBIANA PRESENTA: QBP. JULIO GUERRERO CASTRO DIRECTORA DE TESIS D. en C. BEATRIZ EUGENIA BACA PUEBLA, PUE. FEBRERO DE 2011. ÍNDICE AGRADECIMIENTOS…III ÍNDICE…IV Lista de Figuras…VII Lista de Tablas…X Abreviatuas…XI RESUMEN…1 INTRODUCCIÓN…2 Rizosfera…2 Azospirillum…5 Especies del género Azospirillum…/8 Interacción bacteria-planta hospedera…8 Pelos radiculares…9 Deformación de la raíz…9 Formación de raíces laterales y adventicias…111 Colonización de Azospirillum…11 Fitohormonas…14 Auxinas…16 Vías de síntesis del AIA en bacterias…18 Vía del ácido indol-3-pirúvic o (IP Ya)…20 Vía del indol-3-acetonitrilo (IAN)…21 Vía de la triptamina (TAM)…21 Vía de la indol-3-acetamina (IAM)…21 ANTECEDENTES…23 JUSTIFICACIÓN…29 OBJETIVOS…29 General…29 Específicos…29 ESQUEMA DE TRABAJO…30 MATERIALES Y MÉTODOS…32 Cepas, plásmidos, medios y condiciones de cultivo…34 Expresión del gene aat1 en vida libre…34 Cuantificación de proteínas totales…35 Metodología del ADN recombinante…35 Diseño de iniciadores…36 Extensión por Empalme-Sobrelapamiento (SOE)…36 Obtención de los exudados radiculares…38 Determinación del número más probable…39 Expresión del gene aat1 en asociación con la planta…39 RESULTADOS…41 Expresión del gene aat1 en vida libre…41 Expresión del gene aat1 en asociación con la planta (trigo)…45 Identificación del Fragmento de Lectura Abierta aat2…47 Amplificación por PCR de la región aat2…47 Análisis bioinformático de la secuencia parcial aat2…49 Generación de un sitio Kpnl en la secuencia parcial de aat2…53 Verificación de la dirección los plásmidos Pjgc-a y Pjgc-b…60 DISCUSIÓN…62 CONCLUSIONES…72 PERSPECTIVAS…73 ANEXOS…74 BIBLIOGRAFÍA…90 INTRODUCCIÓN Las bacterias sostienen la vida de nuestro planeta (Kerr 1997; Pace 1996; Pace 1997; Strom 2008), sin embargo sólo se conoce alrededor del 1% de su diversidad (Amann et al., 1995; Cárdenas & Tiedje 2008; Curtis et al., 2002), algunas resultan benéficas y la mayoría de estas son usadas con fines biotecnológicos (Broadbent et al., 2003; Chemier et al., 2009), agrícolas (Bloemberg & Lugtemberg, 2001), biomédicos (Morales-García et al., 2007), ecológicos (Straight & Kolter, 2009) y de biorremediación (Paul et al., 2005; Ramos et al., 2005). Un ejemplo, son las bacterias que promueven el crecimiento de las plantas a través de diferentes mecanismos, entre los que se incluyen la Fijación Biológica de Nitrógeno (FBN), el aumento de disponibilidad de nutrientes en la rizósfera, la influencia positiva en la morfología y tamaño de las raíces de la planta (por ejemplo la producción de fitohormonas), inducción de la resistencia a enfermedad por patógenos (Yasuda et al.,2009) , el control biológico y la potenciación de otras simbiosis benéficas planta-microorganismo (Lugtemberg & Kamilova, 2009; Lucy et al., 2004, Vessey, 2003). En general las bacterias que expresan estos mecanismos son conocidas como rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR, por sus siglas en inglés). La mayoría de las PGPRs habitan en la rizosfera interaccionando con las raíces de las plantas y/o con otros microorganismos. Rizosfera El témino rizosfera fue descrito por Lorwnz Hiltner en 1904 como parte del suelo influenciado por la raíces de las plantas (HILTNER, 1904). La rizodeposición describe la transferencia total de carbono de las raíces de las plantas al suelo y comprende a los exudados (pequeñas moléculas), secreciones (macromoléculas como las enzimas), lisados de células muertas y mucigel. La rizodeposición promueve la abundancia microbiana y actividades en la rizosfera, por lo tanto puede ser descrita como el hábitad microbiano más activo de la tierra (Nurdman et al., 2000; Dobbelaere & Okon, 2007; HARTMANN ET AL., 2008; Lucy et al., 2004; Smalla et al., 2006). La rizosfera es un sistema abierto altamente dinámico con cambios especiales y temporales de factores bióticos (cambios fisiológicos y morfológicos del sistema radicular) y abióticos (lluvia, sequías,irrigación). La rizosfera es a menudo representada como un cilindro de suelo de radio determinado alrededor de la raíz trazando un límite entre la rizosfera y el suelo a granel (Hinsinger et al., 2005). A través de la rizodeposición se sugiere que las raíces pueden regular la comunidad microbiana del suelo y sus alrededores, algunas especies bacterianas viven en la rizosfera y al interior de las raíces pueden afectar el crecimiento tanto de manera positiva como negativa (Burdman et al., 2000; Dobbelaere & Okon, 2007; Lucy et al., 2004; Steenhoudt & Vandeleyden, 2000). En un sentido más amplio, la rizosfera se puede considerar como la porción de suelo en la que están las raíces de las plantas, ya que es una zona donde se dan toda una serie de relaciones físicas y químicas que afectan a la estructura del suelo y a los organismos que viven en él, proporcionándole diferentes propiedades tal como se muestra en la figura 1.
