TEXTO - ¿Cuál es la naturaleza molecular de las mutaciones?

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Mutación, reparación, y recombinación
TEXTO
Preguntas clave
- ¿Cuál es la naturaleza molecular de las mutaciones?
- ¿Cuáles son las bases de la mutación inducida frente a la mutación espontánea?
- ¿Qué son los mecanismos de reparación biológica?
- ¿Qué enfermedades genéticas humanas están causadas por mutaciones en los mecanismos
de reparación?
- ¿Cómo ha aprovechado la evolución las rutas de reparación de procesos celulares
normales como la recombinación meiótica?
Esquema
15.1 Las consecuencias fenotípicas de las mutaciones en el DNA
15.2 Las bases moleculares de las mutaciones espontáneas
15.3 Las bases moleculares de las mutaciones inducidas
15.4 Mecanismos de reparación biológica
15.5 El mecanismo del entrecruzamiento meiótico
15.6 Cáncer: una consecuencia fenotípica importante de la mutación
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Una joven paciente desarrolla un gran número de pequeñas manchas parecidas a pecas,
crecimiento precanceroso de piel y tiene una sensibilidad extrema a la luz solar (Figura 151). Se lee la historia familiar y a la paciente se le diagnostica una enfermedad autosómica
recesiva llamada xeroderma pigmentosum. A lo largo de su vida, será propensa a
desarrollar cánceres de piel pigmentada. ¿Cómo se pueden entender los muchos efectos que
ejerce la mutación de xeroderma pigmentosum? Las mutaciones que generan el fenotipo de
xeroderma pigmentosum se pueden dar en varios genes distintos. En una persona no
enferma, cada uno de estos genes contribuye al proceso bioquímico de la célula que
responde ante un daño químico en el DNA y repara estos daños antes de que tenga lugar la
formación
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de una nueva mutación. Posteriormente en este capítulo, se podrá ver como las mutaciones
en los sistemas de reparación conllevarán a enfermedades genéticas como el xeroderma
pigmentosum.
Las personas que padecen xeroderma pigmentosum son un ejemplo de individuos
con variantes genéticas que muestran diferencias fenotípicas en uno o más caracteres
particulares. Debido a que la genética es el estudio de las diferencias heredadas, el análisis
genético no sería posible sin variantes. Los capítulos anteriores incluyen muchos análisis de
la herencia de estas variantes; ahora, se considerará su origen. ¿Cómo surgen las variantes
genéticas?
Dos son los procesos principales responsables de la variación genética: mutación y
recombinación. Como se pudo ver, la mutación es un cambio en la secuencia de DNA de
un gen. La mutación es especialmente significativa ya que es la fuente primordial del
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cambio evolutivo; nuevos alelos surgen en todos los organismos, algunos espontáneamente
y otros como resultado de la exposición a la radiación o a sustancias químicas del ambiente.
Los nuevos alelos producidos por mutación se convierten en la materia prima de un
segundo nivel de variación, llevado a cabo por la recombinación. Como sugiere su propio
nombre, la recombinación es el resultado de un proceso celular que causa que los alelos de
los diferentes genes se agrupen en nuevas combinaciones (véase Capítulo 4). Usando una
analogía, la mutación produce nuevos juegos de cartas, y entonces la recombinación los
baraja y reparte a manos diferentes.
En el ambiente celular, las moléculas de DNA no son absolutamente estables; cada
par de bases en una doble hélice de DNA tiene una cierta probabilidad de mutar. Como
veremos, el término mutación informa sobre una extensa variedad de diferentes tipos de
cambios. Estos cambios abarcan desde simples intercambios de un par de bases por otro,
hasta la desaparición de un cromosoma completo. En el capítulo 16, se consideraran
cambios debidos a mutaciones que afectan a cromosomas completos o a largos fragmentos
cromosómicos. El presente capítulo se centrará en los procesos mutacionales que tienen
lugar dentro de genes individuales. A estos sucesos se les denomina mutaciones génicas.
Las células han desarrollado sofisticados sistemas para identificar y reparar el DNA
dañado, previniendo de ese modo la formación de mutaciones. Se podría examinar el DNA
como si estuviera sujeto a una dinámica de tira y afloja entre los procesos químicos que
dañan el DNA y forman nuevas mutaciones y los procesos de reparación celular que
constantemente controlan el DNA para detectar estos daños y corregirlos. Sin embargo, este
tira y afloja no es tan sencillo. Como se mencionó anteriormente, las mutaciones
proporcionan la materia prima para la evolución, así la introducción de mutaciones a un
nivel bajo debe ser tolerado. Se verá como la replicación del DNA y los sistemas de
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reparación pueden en efecto introducir mutaciones. Otros mecanismos convierten las
mutaciones potencialmente devastadoras (como una rotura de doble cadena) en mutaciones
que pueden afectar a un solo producto génico.
Se verá que los tipos de daño del DNA potencialmente más graves, una rotura de doble
cadena, es también un paso intermedio en el proceso normal de recombinación de una
célula durante el entrecruzamiento meiótico. De esta manera, se puede establecer un
paralelismo entre la mutación y la recombinación a dos niveles. Primero, como se
mencionó anteriormente, la mutación y la recombinación son las mayores fuentes de
variación. Segundo, los mecanismos de reparación y recombinación de DNA tienen algunas
características en común, incluyendo el uso de algunas de las mismas proteínas. Por esta
razón, primero se explorarán los mecanismos de reparación de DNA y después estos se
compararán con los mecanismos de recombinación de DNA.
15.1 Las consecuencias fenotípicas de las mutaciones en el DNA
El término mutación puntual típicamente se refiere a la alteración de único par de bases
del DNA o a un número pequeño de pares de bases adyacentes. En esta sección, se
considerarán los efectos de semejantes cambios a nivel fenotípico. Las mutaciones
puntuales se clasifican en términos moleculares en la Figura 15-2, que muestra los
principales tipos de cambios del DNA y sus efectos en la función proteica cuando ocurre en
la región codificadora de la proteína de un gen.
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Tipos de mutaciones puntuales
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Los dos principales tipos de mutaciones puntuales en el DNA son las sustituciones de bases
y la inserción o deleción de bases. Las sustituciones de bases son mutaciones en las que un
par de bases es sustituido por otro. Las sustituciones de bases se pueden dividir en dos
subtipos: transiciones y transversiones. Para describir estos subtipos, se contempla como
una mutación altera la secuencia en una cadena de DNA (en la otra cadena ocurrirán los
cambios complementarios). Una transición es una sustitución de una base por otra base de
la misma categoría química. Una purina se sustituye por una purina (A por G o G por A) o
bien una pirimidina se sustituye por una pirimidina (C por T o T por C). Una transversión
es lo contrario; la sustitución de una base de una categoría química por una base de otra.
Una pirimidina se sustituye por una purina (C por A, C por G, T por A, o T por G) o bien
una purina se sustituye por una pirimidina (A por C, A por T, G por C, o G por T). Para
describir los mismos cambios en el nivel del DNA de doble cadena, se representan los dos
miembros de un par de bases en el mismo lugar relativo. De esta manera, un ejemplo de
transición es G · C
A · T; uno de transversión es G · C
A · T. Las mutaciones de
inserción o deleción son de hecho inserciones o deleciones de pares de nucleótidos; no
obstante, por convención se les llama inserción o deleción de pares de bases.
Colectivamente, se usa el término mutaciones indel (por inserción-deleción). De entre ellas,
la mutación más simple es la adición o deleción de un único par de bases. Las mutaciones
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a veces surgen a través de adiciones o deleciones simultáneas de múltiples pares de bases a
la vez. Como se podrá ver más adelante en este capítulo, los mecanismos que
selectivamente producen algún tipo de adición o deleción de múltiples pares de bases son la
causa de algunas enfermedades genéticas humanas.
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Las consecuencias moleculares de la mutación puntual en la región codificadora
¿Cuáles son las consecuencias funcionales de estos diferentes tipos de mutaciones
puntuales? Primero, considere que pasa cuando una mutación surge en la parte codificadora
del polipéptido de un gen. Para sustituciones de una sola base, hay varios posibles
resultados, pero todos son consecuencia directa de dos aspectos del código genético: la
degeneración del código y la existencia de codones de terminación de la traducción (véase
la Figura 15-2).

Mutaciones sinónimas. La mutación cambia un codón por otro que determina el
mismo aminoácido. Las mutaciones sinónimas también hacen referencia a
mutaciones silenciosas.

Mutaciones de cambio de sentido. Un codón que determina un aminoácido se
cambia por un codón que determina otro aminoácido. Las mutaciones de cambio
de sentido se pueden llamar mutaciones no sinónimas.

Mutaciones sin sentido. Un codón que determina un aminoácido es sustituido
por un codón de terminación de la traducción (stop).
Las mutaciones sinónimas nunca cambian la secuencia de aminoácidos de la cadena
polipeptídica. La gravedad del efecto de una mutación de cambio de sentido o sin sentido
en el polipéptido difiere de caso a caso. Por ejemplo, una mutación de cambio de sentido
puede provocar la sustitución de un aminoácido por otro químicamente similar,
denominada sustitución conservadora. En este caso, es poco probable que la alteración
afecte gravemente a la estructura y función de la proteína. Alternativamente, un aminoácido
puede ser sustituido por otro químicamente diferente en una sustitución no conservadora.
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En este tipo modificaciones es más probable que se produzcan cambios severos en la
estructura y función de la proteína. Las mutaciones sin sentido conducirán a la terminación
prematura de la traducción. Por ello se espera que afecten gravemente la función proteica.
Cuanto más cerca del extremo 3’ del marco de lectura abierto esté la mutación sin sentido,
más plausible es que la proteína resultante posea alguna actividad biológica. Sin embargo,
muchas de las mutaciones sin sentido producen productos proteicos completamente
inactivos.
Los cambios de un único par de bases que inactivan proteínas son a menudo debidos
a la mutación en un sitio de corte y empalme. Como puede verse en la Figura 15-3, estos
cambios pueden variar drásticamente la región codificadora, dando lugar a largas
inserciones o deleciones que pueden o no seguir el marco de lectura.
Al igual que las mutaciones sin sentido, las mutaciones indel pueden tener
consecuencias en una secuencia polipeptídica situada más allá del sitio de mutación (véase
Figura 15-2). Recuérdese que las secuencias de mRNA se “leen” mediante el aparato de
traducción que registra (en marco de lectura) tres bases (un codón) al mismo tiempo. La
adición o deleción de un único par de bases de DNA cambia el marco de lectura del resto
del proceso de traducción, desde el sitio donde ocurre la mutación del par de bases hasta el
siguiente codón stop en el nuevo marco de lectura. Por lo tanto, estas lesiones se llaman
mutaciones de desplazamiento del marco de lectura. Estas mutaciones causan que la
secuencia aminoacídica completa traducida aguas abajo desde el sitio de la mutación no
tengan relación con la secuencia aminoacídica original. De esta manera, las mutaciones de
desplazamiento del marco resultan típicamente en la pérdida completa de la estructura y
función de la proteína normal.
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Las consecuencias moleculares de la mutación puntual en la región no codificadora
Volvamos ahora a las mutaciones que ocurren en secuencias reguladoras y otras secuencias
no codificadoras. Las regiones de un gen que no codifican directamente una proteína
contienen muchos sitios cruciales de unión al DNA intercaladas con secuencias no
esenciales para la expresión o actividad del gen. A nivel de DNA, los sitios de unión
incluyen los sitios donde se unen la RNA polimerasa y sus factores asociados además de
sitios donde se unen las proteínas específicas de la regulación de la transcripción. En el
nivel de RNA, otros sitios importantes de unión incluyen los sitios de unión de mRNAs
bacterianos a ribosomas, sitios 5’ y 3’ de corte y empalme para la unión de exones de
mRNAs eucarióticos, y sitios que regulan la traducción y localizan el mRNA en áreas
particulares y compartimientos dentro de la célula.
Las consecuencias derivadas de las mutaciones en otras partes del gen, que no son
codificadores, son más difíciles de predecir que las de las mutaciones en segmentos
codificadores. En general, la consecuencia funcional de cualquier mutación puntual en las
regiones citadas dependen de si la mutación destruye (o crea) un sitio de unión. Las
mutaciones que alteran tales sitios pueden cambiar el patrón de expresión de un gen,
respecto a la cantidad normal de producto expresado en un momento determinado o en
algún tejido concreto, o alterar la respuesta a determinadas situaciones ambientales. Estas
mutaciones reguladoras alterarán la cantidad de producto proteico, pero no la estructura de
la proteína. Alternativamente, las mutaciones en algunos sitios de unión pueden obliterar
completamente un paso necesario en la expresión génica normal (como la unión de la RNA
polimerasa o de factores de corte y empalme) y por lo tanto inactivar totalmente el producto
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génico o bloquear su formación. La Figura 15-4 muestra algunos ejemplos de los efectos de
diferentes tipos de mutaciones sobre el mRNA y las proteínas.
Es importante tener en cuenta la distinción entre la aparición de una mutación
génica, que es un cambio en la secuencia de DNA en un gen dado, y la
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detección de este tipo de sucesos a nivel fenotípico. Muchas mutaciones puntuales en una
secuencia no codificadora afectan poco o nada al fenotipo; estas mutaciones están situadas
entre los sitios de unión del DNA a proteínas reguladoras. Tales lugares puede que sean
funcionalmente irrelevantes o que otros sitios intragénicos dupliquen su función.
15.2 Las bases moleculares de la mutación espontánea
Las mutaciones génicas pueden surgir espontáneamente o pueden ser inducidas. Las
mutaciones espontáneas ocurren de manera natural y surgen en todas las células. Las
mutaciones inducidas surgen por causa de la acción de algunos agentes, denominados
mutágenos, que incrementan la tasa a la que ocurren las mutaciones. En esta sección, se
considerará la naturaleza de las mutaciones espontáneas.
Test de fluctuación de Luria y Delbrück
El origen de los cambios espontáneos y hereditarios ha sido siempre un tema de gran
interés. Una de las primeras preguntas que se hicieron los genetistas fue, ¿ocurren las
mutaciones espontáneas en respuesta a los estímulos externos o son variantes presentes a
baja frecuencia en la mayoría de las poblaciones? Un sistema experimental ideal para tratar
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esta importante cuestión fue el análisis en bacterias de mutaciones que otorgan resistencia a
agentes ambientales específicos normalmente no tolerados por las células de tipo salvaje.
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Un experimento en 1943 de Salvador Luria y Max Delbrück fue especialmente influyente
en nuestra concepción sobre la naturaleza de las mutaciones, no sólo en bacterias, sino en
los organismos en general. En ese momento se sabía que, si la bacteria E. coli se sembraba
en una placa con un medio nutritivo en presencia del fago T1, los fagos enseguida
infectaban y mataban a la bacteria. Sin embargo, rara pero regularmente, se veían colonias
resistentes al ataque del fago. Estas colonias eran estables y por lo tanto parecían ser
mutantes auténticos. Sin embargo, no se sabía si estos mutantes se producían espontánea y
aleatoriamente en el tiempo o si era la presencia del fago la que inducía un cambio
fisiológico que causaba la resistencia.
Luria
razonó
que,
si
las
mutaciones
ocurrían
espontáneamente, entonces se podría esperar que las mutaciones ocurrieran en momentos
distintos y en cultivos diferentes. En este caso, el número de colonias resistentes por cultivo
mostraría alta variación (o “fluctuación” según él). Más tarde él afirmó que la idea se le
ocurrió cuando vio los beneficios fluctuantes obtenidos por sus compañeros jugando en una
máquina tragaperras de un club de country local durante un baile de la facultad; de ahí el
origen del término mutación “el Gordo” (jackpot mutation en inglés).
Luria y Delbrück diseñaron su “test de fluctuación” como se describe a
continuación. Inocularon 20 pequeños cultivos, cada uno con unas pocas células, y se
incubaron hasta obtener 108 células por mililitro. Al mismo tiempo, un cultivo mucho más
grande también se inoculó e incubó hasta obtener 108 células por mililitro. Los 20 cultivos
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individuales y las 20 muestras del mismo tamaño del cultivo grande se sembraron en
presencia del fago. Los 20 cultivos individuales mostraron una alta variación en el número
de colonias resistentes: 11 placas no tenían colonias resistentes, y las restantes tenían 1, 1,
3, 5, 5, 6, 35, 64 y 107 por placa (Figura 15-5a). Las 20 muestras del cultivo grande
mostraron mucha menor variación de placa a placa, todas en el rango de 14 a 26. Si los
fagos estuvieran induciendo mutaciones no habría razones que explicaran por qué la
fluctuación debería de ser mayor en cultivos individuales, ya que todos estaban expuestos
de manera similar a los fagos. La mejor explicación era que las mutaciones ocurrían
aleatoriamente en el tiempo: las mutaciones tempranas daban números más altos de células
resistentes porque las células mutantes tenían tiempo para producir muchos descendientes
resistentes. Las mutaciones tardías producían menos células resistentes (Figura 15-5b). Este
resultado llevó al actual paradigma de la mutación; es decir, en virus, bacterias o eucariotas
la mutación puede ocurrir en cualquier célula, en cualquier momento y al azar. Por éste y
otros trabajos, Luria y Delbrück obtuvieron el Premio Nobel en 1969. Un dato interesante
es que esto fue después de que el primer estudiante graduado de Luria, James Watson,
ganara su Premio Nobel (con Francis Crick en 1964) por el descubrimiento de la estructura
de la doble hélice de DNA.
Este elegante análisis sugiere que las células resistentes se seleccionan por agentes
ambientales (fagos en este caso), más que sean éstos los causantes. ¿Puede demostrarse
directamente la existencia de mutantes en una población antes de la selección? Esta
demostración fue posible mediante una técnica denominada réplica en placa, desarrollada
por Joshua y Esther Lederberg en 1952. Se sembró una población de bacterias en placas de
medio no selectivo (es decir, sin fagos) y de cada una de las células se formó una colonia.
Esta placa se denomina placa matriz. Sobre la superficie de la placa matriz se aplicó
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suavemente un trozo estéril de terciopelo, que quedó impregnado de células allí donde
había una colonia (Figura 15-6). De esta manera, el terciopelo aparece como una “copia” de
toda la placa matriz. El terciopelo se depositó entonces en placas replicadas conteniendo
medio selectivo (es decir, con fagos T1). Al tocar las placas con el terciopelo, algunas
células adheridas al terciopelo se depositaron sobre la superficie de las placas replicadas, en
las mismas posiciones relativas que las colonias de la placa matriz. Como se esperaba, se
encontraron unas pocas colonias mutantes resistentes en las placas replicadas, pero la
mayoría de las placas replicadas mostraron el mismo patrón de colonias
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resistentes (Figura 15-7). Si las mutaciones hubieran ocurrido después de la exposición al
agente selectivo, los patrones de cada placa hubieran sido tan aleatorios como las propias
mutaciones. Los sucesos mutacionales debieron ocurrir antes de la exposición al agente
selectivo. De nuevo, estos resultados confirman que la mutación ocurre al azar en cada
momento, más que en respuesta a un agente selectivo.
Mensaje. La mutación es un proceso aleatorio. Cualquier alelo de cualquier célula puede
mutar en cualquier momento.
Mecanismos de mutación espontánea.
Las mutaciones espontáneas surgen de diversas fuentes. Una de las fuentes es el proceso de
replicación del DNA. Aunque la replicación del DNA es un proceso extraordinariamente
preciso, se cometen errores durante la copia de millones, incluso billones, de pares de bases
de un genoma. Las mutaciones espontáneas también surgen en parte porque el DNA es una
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molécula lábil y el propio entorno celular puede dañarlo. Como se describió en el Capítulo
14, las mutaciones pueden incluso ser causadas por la inserción de un elemento
transponible desde otro lugar del genoma. Este capitulo se centra en las mutaciones que no
son causadas por elementos transponibles.
Errores en la replicación del DNA. Un error en la replicación del DNA puede producirse
cuando se forma un par de nucleótidos ilegítimos (digamos, A-C) durante la síntesis del
DNA, que da lugar a la sustitución de bases que puede ser una transición o bien una
transversión. Otros errores pueden añadir o escindir pares de bases de modo que se
produzca una mutación de desplazamiento del marco de lectura.
Transición. Cada una de las bases del DNA puede aparecer en una de varias formas,
denominadas tautómeros, que son isómeros que difieren en la posición de sus átomos y en
los enlaces que se forman entre ellos. Estas formas están en equilibrio. La forma ceto de
cada base es la que se encuentra normalmente en el DNA (Figura 15-8a), mientras que las
formas imino y enol son raras. Las formas imino y ceto pueden emparejarse con bases
equivocadas formando un emparejamiento erróneo. La capacidad del tautómero raro de una
base para emparejarse erróneamente y producir una mutación durante la replicación del
DNA fue puesta de manifiesto por primera vez por Watson y Crick, cuando propusieron su
modelo de la estructura del DNA. La Figura 15-8b presenta algunos posibles
emparejamientos erróneos causados por el cambio de un tautómero por otro, que recibe la
denominación de desplazamiento tautomérico. La Figura 15-9 muestra como los
desplazamientos tautoméricos afectan al resultado de la replicación del DNA y como
consecuencia se produce una descendencia mutante.
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Los emparejamientos erróneos pueden ocurrir también cuando una de las bases se
ioniza. Este tipo de emparejamientos erróneos suceden con mayor frecuencia que los
emparejamientos erróneos producidos por las formas imino o enol de las bases.
Todos los emparejamientos erróneos descritos hasta ahora dan lugar a mutaciones
por transición, en las que una purina es sustituida por otra purina o una pirimidina por otra
pirimidina (Véase Figura 15-2). La polimerasa DNA III de bacterias (véase capitulo 7)
tiene una actividad correctora que reconoce tales emparejamientos erróneos y los escinde,
reduciendo así enormemente las mutaciones observadas. Otros sistemas de reparación (que
se describe más adelante en este capítulo) corrigen muchas de las bases mal emparejadas
que escapan a la corrección de la función correctora de la polimerasa.
Transversión. En las mutaciones por transversión, una pirimidina es sustituida por una
purina o viceversa (véase Figura 15-2). Las transversiones no pueden generarse mediante
los emparejamientos erróneos representados en la Figura 15-8. Con las bases del DNA en
su orientación normal, la creación de una transversión por un error en la replicación
requeriría, en algún momento durante la síntesis del DNA, el emparejamiento erróneo de
una purina con una purina o de una pirimidina con
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una pirimidina. Aunque las dimensiones de la doble hélice del DNA desfavorecen
energéticamente tales emparejamientos, se sabe ahora por estudios de difracción de rayos
X, que pueden formarse pares G-A así como otros pares purina-purina.
Mutaciones de desplazamiento del marco de lectura. Los errores en la replicación pueden
conducir a mutaciones de desplazamiento del marco de lectura. Recuérdese del Capítulo 9
que tales mutaciones dan lugar a proteínas sumamente alteradas.
Aunque algunos errores en la replicación producen mutaciones de sustitución de
base, otro tipo de errores de la replicación pueden conducir a mutaciones indel, es decir,
inserciones o deleciones de uno o más pares de bases. Cuando dichas mutaciones añaden o
eliminan un número de bases que no es divisible por tres (el tamaño de un codón),
producen mutaciones de desplazamiento del marco de lectura en la región que codifica
proteína. El modelo dominante (Figura 15-10) propone que los indel surgen cuando los
bucles en una región de cadena sencilla se estabilizan mediante un “apareamiento erróneo
por deslizamiento” de secuencies repetidas en el curso de la replicación. Este mecanismo se
denomina a veces replicación por deslizamiento.
Lesiones espontáneas. Además de los errores en la replicación, las lesiones espontáneas,
que son daños que se producen en el DNA de forma natural, también pueden causar
mutaciones. Dos de las lesiones espontáneas más frecuentes son el resultado de la
despurinización y de la desaminación.
La despurinización, la más común de las dos, es la pérdida de una base purínica. La
despurinización consiste en la eliminación del enlace glucosídico entre la base y la
desoxirribosa y la consiguiente pérdida de un residuo de guanina o adenina del DNA.
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Una célula de mamífero pierde espontáneamente de su DNA alrededor de 10 000 purinas
en un periodo de su ciclo celular de 20 horas a 37ºC. Si estas lesiones persistieran,
conducirían a un daño genético importante puesto que, en la replicación, los sitios
apurínicos resultantes no podrían especificar una base complementaria a la purina original.
Sin embargo, como se verá mas tarde en el capitulo, sistemas de reparación eficaces
eliminan los sitios apurínicos. Bajo ciertas condiciones (que se describirán más tarde), se
puede insertar una base en un sitio apurínico; esta inserción resulta con frecuencia en una
mutación.
La desaminación de la citosina produce uracilo. Residuos de uracilo no reparados se
emparejarán con los de adenina durante la replicación, produciendo la conversión de un par
G-C en un par A-T (una transición G·C – A·T).
Las bases dañadas oxidativamente representan un tercer tipo de lesión espontánea
implicada en la mutagénesis. Especies activas de oxígeno, como los radicales superóxido
(O2·-), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y los radicales hidroxilo (OH), se generan como
subproductos del metabolismo normal aerobio. Todas ellas pueden causar daños oxidativos
en el DNA, así como en sus precursores (como el GTP), que dan lugar a mutaciones. Las
mutaciones por daño oxidativo se han relacionado con varias enfermedades humanas. La
Figura 15-11 muestra dos productos del daño oxidativo. El producto 8-oxo-7hidrodesoxiguanosina (8-oxo dG o GO) se empareja errónea y frecuentemente con A,
produciendo un elevado número de transversiones G -> T. El producto glicol timidina
bloquea la replicación del DNA si no se repara, aunque aún no se le ha implicado en la
mutagénesis.
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Mensaje. Las mutaciones espontáneas pueden originarse mediante diferentes procesos. Los
errores en la replicación y las lesiones espontáneas generan la mayoría de las sustituciones
espontáneas de bases. Los errores en la replicación pueden también causar deleciones que
dan lugar a mutaciones de desplazamiento del marco de lectura.
Mutaciones espontáneas en humanos: enfermedades de repeticiones de trinucleótidos.
El análisis de las secuencias de DNA ha permitido identificar las mutaciones responsables
de varias enfermedades hereditarias humanas. Muchas son las mutaciones de sustitución de
base o del tipo indel de un único par de bases que se esperaban. Sin embargo, algunas
mutaciones son más complejas. Varias de estas enfermedades humanas se deben a
duplicaciones en pequeñas secuencias repetidas.
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(Pág.524)
Un mecanismo común responsable de varias enfermedades genéticas es la expansión de una
repetición de tres pares de bases. Por esta razón, se denominan enfermedades de repetición
de trinucleótidos. Un ejemplo es la enfermedad humana denominada síndrome del X
frágil. Esta enfermedad es la forma más común de retraso mental hereditario, presentándose
en aproximadamente uno de cada 1500 varones y una de cada 2500 mujeres.
Citológicamente se caracteriza por un sitio frágil en el cromosoma X que produce su rotura
in vitro (pero esto no conlleva al fenotipo de la enfermedad). El síndrome del X frágil es el
resultado de los cambios en el número de repeticiones (CGG)n en una región del gen FMR1 que se transcribe pero no se traduce (Figura 15-12a).
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¿Cómo se relacionan el número de repeticiones con el fenotipo de la enfermedad?
En la especie humana, se observa normalmente una variación considerable en el número de
repeticiones CGG en el gen FMR-1, que oscila desde 6 a 54, con 29 repeticiones en el alelo
más frecuente. Algunas veces, padres y abuelos que no están afectados tienen varios
descendientes con el síndrome del X frágil. Los descendientes con síntomas de la
enfermedad tienen un elevado número de repeticiones que oscilan desde 200 a 1300 (Figura
15-12b). En los padres y abuelos no afectados también se ha encontrado que contenían un
incremento en el número de repeticiones, pero que oscilaban sólo de 50 a 200. Por esta
razón, se dice que los ancestros son los portadores de las premutaciones. Las repeticiones
en estos alelos premutados no son suficientes para causar el fenotipo de la enfermedad,
pero son mucho mas inestables (es decir, que se expanden fácilmente) que los alelos
normales, y esto da lugar a expansiones aun mayores en sus descendientes. (En general,
cuanto mayor sea el número de repeticiones expandidas, mayor parece ser la inestabilidad).
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(Pág.525)
El mecanismo propuesto para la generación de estas repeticiones es un
emparejamiento erróneo por deslizamiento durante la síntesis del DNA (Figura 15-13). Sin
embargo, la frecuencia de mutación extraordinariamente elevada de las repeticiones de
trinucleótidos en el síndrome del X frágil sugiere que en las células humanas, por encima
de un umbral de alrededor de 50 repeticiones, la maquinaria de replicación no puede
replicar fielmente la secuencia correcta, lo que da lugar a grandes variaciones en el número
de repeticiones.
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Otras enfermedades, como la enfermedad de Huntington (véase Capítulo 2),
también han sido asociadas a la expansión de la repetición de trinucleótidos en un gen.
Diversos patrones generales se dan en estas enfermedades. En la enfermedad de
Huntington, por ejemplo, el gen salvaje HD incluye una secuencia repetida, a menudo en la
región codificadora de la proteína, y la mutación se relaciona con una expansión
considerable de esta región repetida. La severidad de la enfermedad se relaciona con el
número de copias repetidas.
La enfermedad de Huntington y la enfermedad de Kennedy (también llamada la
atrofia muscular espinal y bulbar ligada al cromosoma X) se deben a una amplificación de
una repetición de tres pares de bases, CGA. Los individuos normales tienen una media de
19 a 21 repeticiones, mientras que los pacientes afectados tienen una media de alrededor de
46 repeticiones. En la enfermedad de Kennedy, que se caracteriza por debilidad y atrofia
muscular progresiva, la expansión de la repetición del trinucleótido se encuentra en el gen
que codifica el receptor de andrógenos.
Las propiedades comunes de ciertas enfermedades de repetición de trinucleótidos
sugieren un mecanismo común de cómo se producen los fenotipos anómalos. Primero,
muchas de estas enfermedades parecen incluir neurodegeneración, es decir, muerte celular
en el sistema nervioso. Segundo, en este tipo de enfermedades, las repeticiones de
trinucleótido afectan al marco de lectura abierto del transcrito de estos genes, dando lugar a
la expansión o contracción del número de repeticiones de un único amino ácido en el
polipéptido (por ejemplo, las repeticiones CAG codifican una repetición de poliglutamina).
Así, es fácil de entender porque la enfermedad implica la expansión del tamaño del codón
en unidades de tres pares de bases.
19
Sin embargo, esta explicación no se cumple para todas las enfermedades de
repeticiones de trinucleótido. Después de todo, en el síndrome de la X frágil, la expansión
del trinucleótido está cerca del extremo 5´ del mRNA del gen FMR-1, antes del sitio de
inicio de la traducción. Así, no se puede atribuir el fenotipo anómalo de la mutación del
FMR-1 a un efecto en la estructura proteica. Una pista sobre el problema con el gen
mutante FMR-1 es que, a diferencia de los genes normales, está hipermetilado, una
característica asociada a los genes transcripcionalmente inactivos (véase Figura 15-12b).
Sobre la base de estos descubrimientos, la hipótesis es que la expansión de las repeticiones
da lugar a cambios en la estructura de la cromatina que silencia la transcripción del gen
mutante (véase Capítulo 11). El descubrimiento de que el gen FMR-1 se deleciona en
algunos pacientes con el síndrome del X frágil, respalda este modelo. Estas observaciones
sugieren una mutación de pérdida de función.
Mensaje. Las enfermedades de repeticiones de trinucleótidos surgen debido a la expansión
de varias copias de una secuencia de tres pares de bases que suelen estar en varias copias, a
menudo en la región codificadora de un gen.
15.3 Las bases moleculares de las mutaciones inducidas
Mientras que algunas mutaciones se producen espontáneamente en la célula, otras fuentes
de mutaciones están presentes en el ambiente, ya sean aplicadas intencionadamente en el
laboratorio o accidentalmente durante el transcurso de la vida cotidiana. La
(pág525)
(pág526)
20
producción de mutaciones en el laboratorio a causa de la exposición a mutágenos se
denomina mutagénesis, y el organismo se dice que ha sido mutagenizado.
Mecanismos de mutagénesis
Los mutágenos inducen mutaciones al menos mediante tres mecanismos diferentes. Pueden
reemplazar una base de DNA, alterar una base de modo que se empareje erróneamente de
forma específica con otra base o dañar una base de modo que, en condiciones normales, ya
no pueda emparejarse con ninguna base. La mutagénesis de genes y la observación del
fenotipo consecuente es una de las estrategias primarias usadas por los genetistas.
Incorporación de análogos de bases. Algunos compuestos químicos son lo
suficientemente parecidos a las bases nitrogenadas normales del DNA para que,
ocasionalmente, se incorporen en el DNA en lugar de éstas; tales compuestos se denominan
análogos de bases. Una vez incorporados, estos análogos tienen propiedades de
emparejamiento distintas a las que presentan las bases normales; de este modo, pueden
causar mutaciones al provocar que, durante la replicación, se inserten nucleótidos
incorrectos frente a ellos. Originalmente, el análogo de base sólo está en una de las cadenas,
pero puede provocar la sustitución de un par de nucleótidos que se replicará en todas las
copias de DNA derivadas de la cadena original.
Por ejemplo, el 5-bromouracilo (5-BU) es un análogo de la timina que contiene
bromo en la posición del carbono-5 en lugar del grupo CH3 que aparece en la timina. Este
cambio no afecta a los átomos que participan en los puentes de hidrógeno durante el
emparejamiento de las bases, aunque la presencia de bromo altera de forma significativa la
distribución de electrones en la base. La estructura normal (la forma ceto) del 5-BU
21
empareja con la adenina, como se muestra en la Figura 15-14a. Sin embargo, el 5-BU
puede cambiar con frecuencia a la forma enol o a una forma ionizada. La última empareja
in vivo con la guanina (Figura 15-14b). De esta forma, la naturaleza del par formado
durante la replicación dependerá de la estructura en que se encuentre el 5-BU en el
momento del emparejamiento. El 5-bromouracilo provoca casi exclusivamente transiciones,
como se deduce de la Figura 15-14.
Otro análogo muy utilizado en investigación es la 2-amino-purina (2-AP). Este
análogo de la adenina puede emparejarse con la timina, aunque también puede emparejarse
erróneamente con la citosina cuando está en estado protonado, como se muestra en la
Figura 15-15. Por lo tanto, cuando la 2-AP se incorpore al DNA mediante un
emparejamiento
con timina, puede
generar
transiciones
A·T->
G·C
mediante
emparejamiento erróneo con la citosina en las replicaciones posteriores. O, si la 2-AP se
incorpora mediante un emparejamiento erróneo con la citosina, en ese caso provocará
transiciones G·C -> A·T cuando se empareje con la timina. Estudios genéticos han
demostrado que la 2-AP, al igual que el 5-BU, es muy específica en la producción de
transiciones.
(pág526)
(pág527)
Emparejamiento erróneo específico. Algunos mutágenos no se incorporan al DNA, sino
que en su lugar alteran una base, provocando un emparejamiento erróneo específico.
Ciertos agentes alquilantes, tales como el metanosulfonato de etilo (EMS) y la ampliamente
utilizada nitrosoguanidina (NG) funcionan de esta manera.
Aunque tales agentes añaden grupos alquilo (un grupo etilo el EMS y un grupo
metilo la NG) en muchas posiciones de las cuatro bases, la mutagenicidad se correlaciona
22
más con la adición al oxígeno situado en la posición 6 de la guanina, para formar O-6alquilguanina. Esta adición provoca el emparejamiento erróneo con la timina, como se
muestra en la Figura 15-16, lo que producirá transiciones G·C -> A·T en la siguiente ronda
de replicación.
(pág527)
(pág528)
Los agentes alquilantes también pueden modificar las bases de los dNTP (donde N
puede ser cualquier base), que son precursores de la síntesis del DNA.
Agentes intercalantes. Los agentes intercalantes constituyen otra clase importante de
modificadores del DNA. Este grupo de compuestos incluye la proflavina, el naranja de
acridina y una clase de compuestos químicos denominados compuestos ICR (Figura 1517a). Estos agentes son moléculas planas, que mimetizan pares de bases y son capaces de
deslizarse (intercalarse) entre las bases nitrogenadas que están apiladas en el interior de la
doble hélice del DNA (Figura 15-17b). En esta posición intercalada el agente puede
producir inserciones o deleciones de un único par de nucleótidos.
Daños en las bases. Un gran número de mutágenos dañan una o más bases, de manera que
se imposibilita el emparejamiento específico entre las bases. El resultado es un bloqueo de
la replicación, puesto que la síntesis del DNA no continuará más allá de una base que no
pueda especificar a su complementaria mediante enlaces por puente de hidrógeno. El
boqueo de la replicación puede causar mutaciones adicionales como se explicará más tarde
en este capítulo (véase la sección de reparación por escisión de nucleótido).
23
La luz ultravioleta normalmente provoca daños en bases nucleotídicas de la mayoría
de organismos. La luz ultravioleta genera distintos tipos de alteraciones en el DNA,
denominados fotoproductos (la palabra foto significa “luz”). La manera más probable de
que estos productos generen una mutación son dos lesiones diferentes que unen residuos de
pirimidina adyacente en la misma cadena. Estas lesiones son el fotodímero ciclobutanopirimidina y el fotoproducto 6-4 (Figura 15-18).
La radiación ionizante causa la formación de moléculas ionizadas y excitadas que
pueden dañar el DNA. Puesto que los sistemas biológicos poseen una naturaleza acuosa, las
moléculas generadas por los efectos de la radiación ionizante sobre el agua producen la
mayor parte del daño. Se originan muchos tipos diferentes de especies reactivas del
oxígeno, pero las más perjudiciales para las bases de DNA son OH, O2- y H2O2. Estas
especies pueden dañar las bases dando lugar a diferentes productos de aductos y de
degradación. Entre los más corrientes, que provocan mutaciones, se encuentran el glicol
timina y el 8-oxodG, representados en la Figura 15-11.
La radiación ionizante puede también dañar directamente el DNA sin que medien
las especies reactivas del oxígeno. Esta radiación puede causar la rotura del enlace Nglucosídico, conduciendo a la formación de sitios apurínicos o apirimidínicos, así como
roturas de las cadenas de DNA. De hecho, las roturas de las cadenas son las responsables de
los efectos letales de la radiación ionizante.
La aflatoxina B1 es un carcinógeno poderoso que se une a la posición N-7 de la guanina
(Figura 15-19). La formación de este producto de adición da lugar a la rotura del enlace
entre la base y el azúcar, liberando la base y generando un sitio apurínico. La aflatoxina B1
es un miembro de una clase de
(pág528)
24
(pág529)
(pág529)
(pág530)
carcinógenos químicos que originan productos de adición voluminosos cuando se unen
covalentemente al DNA. Otros ejemplos incluyen los diol epóxidos de benzo(a)pireno, un
compuesto producido por los motores de combustión interna. Todos los compuestos de este
tipo inducen mutaciones, aunque no siempre esté claro cual es el mecanismo que utilizan.
Mensaje. Los mutágenos inducen mutaciones mediante varios mecanismos diferentes.
Algunos mutágenos mimetizan las bases normales y se incorporan al DNA, donde luego
establecen
emparejamientos
incorrectos.
Otros
dañan
las
bases
y
producen
emparejamientos erróneos específicos, o impiden completamente el emparejamiento porque
eliminan el reconocimiento entre las bases.
El test de Ames: evaluando mutágenos en nuestro entorno
Se han sintetizado un número enorme de compuestos químicos y muchos de ellos tienen
potenciales aplicaciones comerciales. Hemos aprendido la dificultad que supone sopesar los
posibles beneficios de estas aplicaciones con el riesgo ambiental y a la salud que entrañan.
En consecuencia, es imprescindible disponer de técnicas eficientes de exploración para
evaluar algunos de los riesgos que hay en un gran número de compuestos.
El factor importante de riesgo de muchos compuestos es que sean agentes causantes
de cáncer (carcinógenos). Así, tener sistemas modelo válidos en los que la carcinogenicidad
de los com25
(pág530)
(pág531)
puestos puede ser evaluada eficiente y eficazmente es muy importante. Sin embargo, usar
un sistema modelo con mamíferos como el ratón es muy lento, requiere mucho tiempo y es
caro.
En los setenta, Bruce Ames reconoció la fuerte correlación entre la carcinogenicidad
y mutagenicidad de los compuestos. Él supuso que la medición de la tasa de mutación en
sistemas bacterianos sería un modelo efectivo para evaluar la mutagenicidad de los
compuestos como primera detección de los posibles carcinógenos. Sin embargo, se
descubrió que no todos los carcinógenos eran mutagénicos; más bien, algunos metabolitos
de los carcinógenos producidos en el cuerpo son en realidad los agentes mutagénicos.
Típicamente, estos metabolitos se producen en el hígado y las reacciones enzimáticas que
convierten los carcinógenos en metabolitos bioactivos no se dan en bacterias.
Ames se dio cuenta que podía superar este problema tratando cepas especiales de la
bacteria Salmonella typhimurium con extractos de hígado de rata que contenían los enzimas
metabólicos (Figura 15-20). La cepa especial de S. typhimurium tiene uno de los alelos
mutantes de un gen responsable de la síntesis de la histidina que se sabe que “revierte” (es
decir, vuelve al fenotipo salvaje) sólo por algún tipo de suceso mutacional adicional. Por
ejemplo, un alelo denominado TA100 puede revertir al alelo salvaje sólo con una mutación
de sustitución de base, mientras que TA1538 y 1535 sólo podrán revertir por una mutación
indel que produzca un desplazamiento del marco de lectura de la proteína (Figura 15-21).
Tras exponer al test compuesto las bacterias tratadas de cada una de estas cepas,
crecieron en placas de Petri que contenían medio sin histidina. La ausencia de este nutriente
26
aseguraba que sólo crecerían los individuos que revertían por contener sustituciones de base
apropiadas o mutaciones de desplazamiento del marco. El número de colonias en cada
placa y el número total de bacterias analizadas fueron decisivas, permitiendo a Ames medir
la frecuencia de reversión. Los compuestos que produjeron metabolitos induciendo niveles
elevados de reversión, relativo al control de extractos de hígado sin tratar, serían claramente
mutagénicos y podrían ser posibles carcinógenos. El test Ames proporcionaría así una
forma importante de explorar miles de compuestos y evaluar un aspecto de su riesgo al
ambiente y a la salud. Hoy en día se sigue utilizando como herramienta importante para la
evaluación de la seguridad de los compuestos químicos.
15.4 Mecanismos de reparación biológica
Tras analizar las numerosas maneras con las que se puede dañar el DNA −mediante fuentes
tanto del interior de la célula (replicación, reactivos del oxígeno, etc.) como del exterior
(ambientales: luz ultravioleta, radiación ionizante, mutágenos)− se preguntará como ha
logrado sobrevivir y prosperar la vida durante miles de millones de años. El hecho es que
los organismos que abarcan desde las bacterias hasta los humanos y plantas pueden reparar
eficientemente su DNA mediante una variedad de mecanismos que juntos emplean hasta
100 proteínas de reparación conocidas. De hecho, nuestra compresión actual nos muestra al
DNA como la única molécula que los organismos reparan más que reemplazan. Como se
verá, los fallos de estos sistemas de reparación son una causa importante en enfermedades
humanas hereditarias.
El mecanismo de reparación más importante fue brevemente mencionado en el
Capítulo 7 −la función correctora de la DNA polimerasa I y la DNA polimerasa III como
parte del complejo de replicación. Como consta aquí, tanto la DNA polimerasa I como la
27
DNA polimerasa III son capaces de escindir bases que se han insertado erróneamente
dando lugar a emparejamientos erróneos. Se examinará ahora alguna de las otras rutas de
reparación, empezando por las reparaciones libre de errores.
(pág531)
(pág532)
Reversión directa del daño en el DNA
La forma más simple de reparar una lesión, una vez que ha ocurrido, es eliminarla
directamente, regenerando a continuación la base normal (Figura 15-22). No siempre es
posible la reversión, ya que algunos tipos de daños son esencialmente irreversibles. Sin
embargo, en pocos casos las lesiones se pueden reparar de esta forma. Un ejemplo es el
fotodímero mutagénico causado por la luz ultravioleta. El dímero de ciclobutano-pirimidina
(CPD) puede repararse con una encima denominada CPD fotoliasa. La encima se une al
fotodímero y lo rompe regenerando la base original. Este mecanismo de reparación se
denomina fotoreactivación porque la encima requiere luz para funcionar. Se requieren otras
rutas de reparación para eliminar el daño producido por la luz ultravioleta en ausencia de
luz de longitud de onda apropiada (>300nm).
Las transferasas de grupo alquilo también son enzimas implicadas en la reversión
directa de las lesiones. Eliminan ciertos grupos alquilo añadidos a la posición O-6 de la
guanina (véase Figura 15-16) por mutágenos como la nitrosoguanidina y el
metanosulfonato de etilo. Se ha estudiado ampliamente la transferasa de grupos metilo de
E. coli. Esta enzima transfiere el grupo metilo desde la O-6-metilguanina a un residuo de
cisteína en el sitio activo de la enzima. Cuando esto ocurre, la enzima se inactiva, de forma
que este sistema de reparación puede saturarse si el nivel de alquilación es lo
suficientemente elevado.
28
Reparación por escisión de bases
Un principio dominante que guía a los sistemas genéticos celulares es la fuerza de la
complementariedad de la secuencia nucleotídica. (Recuérdese que el análisis genético
también depende fuertemente de este principio). Los sistemas de reparación importantes
aprovechan las propiedades de la complementariedad antiparalela del DNA para restaurar
los segmentos dañados a su estado inicial, no dañado. En estos sistemas, una base o un
segmento mas largo de la cadena de DNA es eliminado y reemplazado por un segmento
nucleotídico recién sintetizado complementario a la cadena molde opuesta.
Como estos sistemas dependen de la complementariedad u homología entre la
cadena molde y a la cadena que se esta reparando, se denominan sistemas de reparación
dependientes de homología. A diferencia del ejemplo de reversión de daños descrito en la
sección precedente, esta ruta incluye la eliminación y reemplazo de una o más bases. El
primer sistema de reparación dependiente de homología que se examinará es la reparación
por escisión de bases. Después de la actividad correctora de la DNA polimerasa, la
reparación por escisión de bases es el mecanismo más importante usado para eliminar bases
incorrectas o dañadas. El principal blanco de la reparación por escisión de bases son los
daños de bases que no abultan. Este tipo de daños puede ser el resultado de la variedad de
causas mencionadas en la sección precedente, incluyendo la metilación, la desaminación, la
oxidación o la pérdida espontánea de una base del DNA. La reparación por escisión de
bases se lleva a cabo por unas glicosilasas de DNA que rompen enlaces de unión entre la
base y el azúcar, liberando la base alterada y generando un sitio apurínico o apirimidínico
(AP). Una enzima denominada endonucleasa AP, mella entonces la cadena dañada aguas
arriba del sitio AP. Una tercera enzima, la desoxirribofosfodiesterasa, limpia un tramo de
29
DNA eliminando los residuos vecinos de azúcar-fosfato permitiendo así a la DNA
polimerasa rellenar los huecos con nucleótidos complementarios a la cadena opuesta. La
DNA ligasa sella entonces el nuevo nucleótido al resto de la cadena (véase Figura 15-23).
(pág532)
(pág533)
Existen numerosas glicosilasas de DNA. Una de ellas, la glucosilasa de uracilo de
DNA, elimina el uracilo del DNA. Los residuos de uracilo, que se producen por la
desaminación espontánea de la citosina (véase página 523), pueden dar lugar a una
transición C −> T cuando no se reparan. Una ventaja de que sea la timina (5-metiluracilo),
y no el uracilo, la pareja natural de la adenina en el DNA es que permite el reconocimiento
y posterior escisión y reparación de las citosinas espontáneamente desaminadas. Si el
uracilo fuera un constituyente normal del DNA, este sistema de reparación no sería posible.
Sin embargo, la desaminación plantea otros problemas tanto en bacterias como en
eucariotas. Tras analizar un gran número de mutaciones en el gen lacI, Jeffrey Miller
identificó lugares de una o más bases en el gen que eran propensos a padecer mutaciones
con mayor frecuencia. Miller descubrió que los denominados puntos calientes mutacionales
correspondían a la desaminación de algunos residuos de citosina. El análisis de la secuencia
de DNA del punto caliente para la transición G·C – A·T en el gen lacI mostró que los
residuos 5-metilcitosina están presentes en cada uno de los puntos calientes. La metilación
del DNA eucariótico se trató en el Capítulo 11. Aunque con un propósito diferente, E. coli
y otras bacterias también metilan su DNA de forma similar. Algunos de los datos del
estudio de lacI se muestran en la Figura 15-24. La altura de cada barra en el gráfico
representa la frecuencia de mutación en cada sitio. Las posiciones del residuo 5metilcitosina se correlacionan muy bien con los sitios de mayor mutación.
30
¿Por qué son las 5-metilcitosinas puntos calientes para las mutaciones? La
desaminación del 5-metilcitosina genera timina (5-metiluracilo):
La timina no es reconocida por la enzima glucosilasa de uracilo de DNA y así no se repara.
Por tanto, las transiciones C -> T generadas por la desaminación se encuentran más
frecuentemente en lugares 5-metilcitosina porque escapan a este sistema de reparación. Una
consecuencia de la mayor frecuencia de mutación del 5-metilcitosina a timina es la
(pág533)
(pág534)
baja representación de los dinucleótidos CpG en células eucarióticas, puesto que esta
secuencia se metila obteniendo 5-metil-CpG, que gradualmente, a lo largo del tiempo
evolutivo, se convierte en TpG.
Mensaje. En la reparación por escisión de bases, un daño no voluminoso en el DNA es
reconocido por una de las enzimas denominada glicosilasa del DNA que corta los enlaces
base-azúcar, liberando la base incorrecta. La reparación consiste en la eliminación del sitio
en el que falta la base y la inserción de la base correcta usando como guía la
complementariedad de la cadena no dañada.
Reparación por escisión de nucleótidos
Aunque la inmensa mayoría del daño que soporta un organismo es un daño leve de una
base que puede manejarse con la reparación por escisión de base, este mecanismo no puede
corregir ni aductos voluminosos que distorsionan la hélice de DNA, ni aductos como los
dímeros de ciclobutano-pirimidina causados por la luz ultravioleta, ni tampoco corregir
daños de más de una base. Una DNA polimerasa no puede continuar con la síntesis de
31
DNA más allá de estas lesiones, siendo el resultado el bloqueo de la replicación. El bloqueo
de la horquilla de replicación puede causar la muerte celular. Asimismo, una base anómala
o dañada puede detener el complejo transcripcional. Para superar estas dos situaciones, los
procariotas y eucariotas utilizan una ruta extremadamente versátil denominada reparación
por escisión de nucleótido (NER) que es capaz de liberar el bloqueo de la replicación y
transcripción y reparar el daño.
Es interesante saber que dos enfermedades autosómicas recesivas, xeroderma
pigmentosum (XP) y el síndrome de Cockayne, son causadas por defectos en la
reparación por escisión de nucleótido. Aunque los pacientes tanto con XP como con el
síndrome de Cockayne son excepcionalmente sensibles a la luz ultravioleta, otros síntomas
son drásticamente distintos. Al principio de este capítulo se introdujo la enfermedad
xeroderma pigmentosum que se caracteriza por un desarrollo temprano de cáncer,
especialmente cánceres de piel y en algunos casos defectos neurológicos. Por otro lado, los
pacientes con el síndrome de Cockayne presentan una variedad de desórdenes del
desarrollo que incluyen, enanismo, sordera y retraso. En términos generales, los pacientes
de XP contraen cánceres anticipadamente, mientras que los pacientes con el síndrome de
Cockayne envejecen prematuramente. ¿Cómo pueden defectos en la misma ruta de
reparación dar lugar a síntomas tan distintos? Aunque no hay una respuesta simple a esta
pregunta, los estudios de las bases genéticas de estas enfermedades condujeron a la
identificación de proteínas importantes en la ruta NER.
La reparación por escisión de nucleótido es un proceso complejo que requiere
docenas de proteínas. A pesar de esta complejidad, el proceso de reparación se puede
separar en cuatro fases:
1. Reconocimiento de la o las bases dañadas
32
2. Ensamblaje del complejo multiproteico en el sitio dañado
3. Corte de la cadena dañada varios nucleótidos aguas arriba y aguas abajo del sitio dañado
y eliminación de los nucleótidos que haya ( 30) entre los cortes
4. Uso de la cadena no dañada como molde por la DNA polimerasa, seguido de la ligación
de la cadena
De hecho, como ya se ha mencionado, el que la detención tanto de la horquilla de
replicación como el del complejo de transcripción active esta ruta de reparación implica
que hay dos tipos de reparaciones por escisión de nucleótido que difieren en el
reconocimiento del daño (paso 1). Ahora se sabe que uno de ellos repara regiones de DNA
transcritas y se denomina, como cabe esperar, reparación por escisión de nucleótido
unido a la transcripción (TC-NER del inglés transcription-coupled nucleotide-excision
repair). El otro tipo, reparación genómica global (GGR del inglés global genomic repair),
corrige las lesiones en cualquier lugar del genoma y se activa cuando la horquilla de
reparación se detiene. Como puede verse en la figura 15-25, aunque difieran en el paso de
reconocimiento, tanto TC-NER como GGR comparten los pasos del 2 al 4.
(pág534)
(pág535)
(pág535)
(pág536)
Llegado a este punto, algunos se preguntarán, ¿y si las diferencias entre los síntomas
de las enfermedades XP y Cockayne son debidas a mutaciones en clases distintas de
proteínas de reconocimiento? Estará en el buen camino si se plantea esta cuestión. Los
pacientes con el síndrome de Cockayne tienen una mutación en una de las dos proteínas
llamadas CSA y CSB, que reconocen el bloqueo del complejo de transcripción. Un modelo
33
de cómo CSA y CSB se podrían unir a la polimerasa bloqueada y atraer el complejo
multiproteico necesario para la reparación del DNA se muestra en la Figura 15-25.
Para GGR, el primer paso es el reconocimiento de una base que (1) ha sido dañada
por un complejo heterodimérico que distorsiona la doble hélice de DNA y (2) no forma
parte de una cadena molde que se transcribe activamente. Este complejo de reconocimiento
atrae al complejo multiproteico, que contiene las diez subunidades de los factores generales
de trascripción, TFIIH. Dos de las diez subunidades, XPB y XPD, son helicasas que
desenrollan el DNA. La RPA, una proteína de unión a DNA de cadena sencilla, mantiene la
estructura completa estabilizada. Los pasos posteriores que median la hendidura y escisión
de la base dañada y otros tantos como 30 nucleótidos adyacentes, seguidos de la síntesis por
parte de la DNA polimerasa para rellenar el hueco, son comunes tanto para la ruta de TCNER como para la de GGR. El paso en el que el DNA se sintetiza de nuevo para rellenar el
hueco (denominado síntesis de reparación del hueco) se discutirá con más detalle más
adelante, puesto que otras rutas de reparación también comparten este paso.
Muchas de las proteínas de reparación nucleares (XPA, XPB, etc.) equivalentes en
humanos fueron identificadas por primera vez en pacientes con XP. Tanto XP como el
síndrome de Cockayne son un ejemplo de trastornos genéticos heterogéneos en los que el
paciente tiene mutaciones en uno de los genes que desempeñan sus funciones en un proceso
particular, en este caso en la reparación por escisión de nucleótidos.
¿Pueden las diferencias moleculares entre TC-NER y GGR proporcionar una
explicación de los diferentes síntomas que muestran los pacientes con XP y el síndrome de
Cockayne? Recuérdese que los pacientes con XP desarrollan cánceres tempranos, mientras
que los pacientes del síndrome de Cockayne tienen una variedad de síntomas asociados con
el envejecimiento prematuro. Ya se vio que los sistemas de reparación de los pacientes con
34
el síndrome de Cockayne no pueden reconocer la detención del complejo de transcripción.
Una consecuencia de este defecto es que la célula tiene una mayor probabilidad de activar
la ruta del suicidio por apoptosis. En personas sanas, es preferible la muerte celular a la
propagación de una célula con el DNA dañado. Sin embargo, de acuerdo con esta teoría, la
ruta de la muerte celular se activaría muy frecuentemente en los pacientes con síndrome de
Cockayne, dando lugar, de esta manera, a toda una variedad de síntomas de envejecimiento.
Por otro lado, los pacientes con XP pueden reconocer el complejo de transcripción detenido
(tienen las proteínas CSA y CSB normales) y prevenir la muerte celular cuando la
transcripción vuelva a empezar. Sin embargo, no pueden reparar el daño original debido a
la mutación en una de sus proteínas XP. Así, las mutaciones se irán acumulando en las
células de los pacientes con XP y, como se indicó previamente en este capítulo, la presencia
de mutaciones, ya sean causadas por mutágenos como por errores en las rutas de
reparación, incrementa el riesgo de desarrollar muchos tipos de cánceres.
Mensaje. La reparación por escisión de nucleótidos es una ruta versátil que reconoce y
corrige las lesiones del DNA debidas en gran parte a daños causados por la luz ultravioleta,
que al hacerlo, libera el bloqueo de la horquilla de replicación y el complejo de
transcripción. Los pacientes con xeroderma pigmentosum y el síndrome de Cockayne son
sensibles a los rayos ultravioletas debido a mutaciones en proteínas claves de la reparación
por escisión de nucleótidos que reconocen o reparan las bases dañadas.
Reparación postreplicativa: reparación de emparejamientos erróneos
Se ha aprendido en la primera mitad de este capítulo que muchos errores ocurren en la
replicación del DNA. De hecho, la tasa de error es de alrededor de 10-5. La corrección
35
mediante la función correctora de la polimerasa replicativa reduce la tasa de error a menos
de 10-7. La ruta más importante que corrige los restantes errores replicativos se denomina la
reparación de emparejamientos erróneos. Esta ruta de reparación reduce la tasa de error
a menos de 10-9 debido al reconocimiento y reparación de las bases erróneamente
emparejadas y pequeños bucles producidos por inserciones y delecio(pág536)
(pág537)
nes de nucleótidos (indel) durante el transcurso de la replicación. A partir de estos valores,
se puede ver que las mutaciones que den lugar a la pérdida de la ruta de reparación de
emparejamientos erróneos incrementarían la frecuencia de mutación 100 veces. De hecho,
la pérdida de la reparación de emparejamientos erróneos esta asociado con una forma
hereditaria del cáncer de colon.
El sistema de reparación de emparejamientos debería ser capaz de hacer al menos
tres cosas:
1. Reconocer pares de bases mal emparejadas
2. Determinar cuál de las dos bases del emparejamiento erróneo es la incorrecta
3. Escindir la base incorrecta y realizar la síntesis de la reparación
Mucho de lo que se sabe sobre la reparación de emparejamientos erróneos proviene de
décadas de análisis genético y bioquímico mediante el uso del modelo bacteriano de E. coli
(véase el recuadro de organismo modelo E. coli en la página 185). Especialmente digno de
mención fue la reconstitución del sistema de reparación de emparejamientos erróneos en el
tubo de ensayo llevada a cabo en el laboratorio de Paul Modrich. La conservación de
muchas de las proteínas de reparación de emparejamientos erróneos en bacterias, levaduras
y humanos, indica que esta ruta es tan antigua como importante en todos los organismos
36
vivos. Recientemente, el sistema de reparación de emparejamientos erróneos en humanos
ha sido también reconstituido en el tubo de ensayo en el laboratorio de Modrich. La
capacidad de estudiar los detalles de la reacción incitará futuros estudios sobre la ruta
bioquímica en humanos. Sin embargo, por el momento este capítulo se centrará en el
sistema tan bien caracterizado de E. coli (Figura 15-26).
El primer paso en la reparación de emparejamientos erróneos es el reconocimiento
del daño en el DNA recién replicado por la proteína MutS. La unión de esta proteína a la
distorsión de la doble hélice de DNA causada por un emparejamiento erróneo de bases
inicia la ruta de reparación de emparejamientos erróneos atrayendo otras tres proteínas al
sitio de la lesión (MutL, MutH y UvrD). La proteína clave es MutH, que realiza la función
crucial de cortar la cadena que contiene la base incorrecta. Sin esta capacidad para
discriminar entre la base correcta y la incorrecta, el sistema de reparación de
emparejamientos erróneos no podría determinar la base que debe ser escindida para
prevenir que la mutación tenga lugar. Por ejemplo, si se produce un emparejamiento
erróneo G-T como resultado de un error de replicación, ¿cómo podría determinar el sistema
si la base incorrecta es la G o la T? Ambas son bases normales en el DNA. Sin embargo,
los errores en la replicación se producen por la incorporación errónea de bases en la cadena
recién sintetizada, de modo que es la base de esta cadena la que debe ser reconocida y
escindida.
¿Cómo distingue la reparación de emparejamientos erróneos la cadena recién
sintetizada de la antigua? Recuérdese del Capítulo 11 las bases de citosina están metiladas a
menudo en eucariotas y la denominada señal epigenética se propaga de la cadena parental a
la hija en cuanto finaliza la replicación. El DNA de E. coli también está metilado pero los
grupos metilo pertinentes para la reparación de emparejamientos erróneos se añaden a las
37
bases de adenina. Para reconocer la cadena vieja, el molde de la cadena recién sintetizada,
el sistema de reparación de emparejamientos erróneos de las bacterias aprovecha el retraso
normal en la metilación posterior a la replicación de la secuencia
5´-G-A-T-C-3´
3´-C-T-A-G-5´
La enzima metiladora es la metilasa de adenina, que produce 6-metiladenina en cada
una de las cadenas. No obstante, la enzima tarda varios minutos en reconocer y modificar
las secuencias GATC recién sintetizadas. Durante este periodo, la proteína MutH corta el
sitio de metilación de cadena que contiene la A que aún no ha sido metilada. Este sitio
puede estar a cientos de pares de bases del apareamiento erróneo. Tras el corte, la proteína
UrvD se une al sitio donde se hizo el corte y usando su actividad helicasa desenrolla en
DNA. Una proteína protectora de unión a cadena sencilla cubre la cadena madre
desenrollada mientras el fragmento de la nueva cadena entre el emparejamiento erróneo y
el sitio donde se realizó el corte se escinde.
(pág537)
(pág538)
Muchas de las proteínas de la reparación de emparejamientos erróneos de E. coli se
conservan en la reparación de emparejamientos erróneos de humanos. No obstante, no se
conoce aún cómo reconocen y reparan sólo la cadena recién sintetizada en eucariotas. El
problema es particularmente desconcertante en organismos que carecen de la mayoría o de
toda la metilación del DNA como las levaduras, Drosophila y C. elegans (véase Capítulo
11). Un modelo popular propone que la distinción se base en el reconocimiento del extremo
3´ libre que caracteriza a la recién sintetizada cadena principal y retrasada.
38
Uno de los objetivos importantes del sistema de reparación de emparejamientos
erróneos en humanos son las secuencias cortas repetitivas que se pueden expandir o borrar
durante la replicación mediante el mecanismo de apareamiento erróneo por deslizamiento
previamente descrito (véase Figura 15-10). Mutaciones en alguno de los componentes de
esta ruta son las responsables de algunas enfermedades humanas, especialmente cáncer.
Hay miles de cortas repeticiones (microsatélites) situadas a lo largo del genoma (véase
Capítulo 4). Aunque la mayoría de ellas están situadas en regiones no codificadoras (la
mayor parte del genoma no codifica), unos pocos se sitúan en genes que son críticos para el
desarrollo y crecimiento normal.
Por tanto, se podría predecir que los defectos en la ruta de reparación de
emparejamientos erróneos humano causarán enfermedades con consecuencias muy graves.
Esta predicción resultó ser verdadera, y un buen ejemplo de ello es el síndrome
denominado cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC del inglés hereditary
nonpolyposis colorectal cancer), que a pesar de su nombre no es un cáncer sino un
incremento del riesgo de padecerlo. La enfermedad es una de las predisposiciones
hereditarias al cáncer más comunes, que afecta a 1 de cada 200 personas en el mundo
occidental. Los estudios han demostrado que el HNPCC se debe a la pérdida del sistema de
reparación de emparejamientos erróneos debido en gran medida a las mutaciones heredadas
en genes que determinan los equivalentes (y homólogos) humanos de las proteínas
bacterianas MutS y MutL (véase Figura 15-26). La herencia del HNPCC es autosómica
dominante. Las células con un copia funcional de los genes del sistema de reparación de
emparejamientos erróneos tiene una actividad normal de reparación, pero las células
tumorales derivan de las células que han perdido la única copia funcional y, por lo tanto,
son deficientes en la reparación de los emparejamientos erróneos. Estas células presentan
39
una tasa de mutación elevada debido en parte a la incapacidad de corregir la formación de
las mutaciones indel durante la replicación.
Mensaje. El sistema de la reparación de emparejamientos erróneos corrige los errores que
no son corregibles por la función correctora de la DNA polimerasa replicativa durante la
replicación. La reparación está restringida a la cadena recién sintetizada, que en procariotas
es reconocida por el mecanismo de reparación porque le falta la señal de la metilación.
Reparación propensa a error: síntesis por translesión de DNA
Hasta ahora, todos los mecanismos de reparación que se han estudiado no cometían errores,
en la medida en que revertía el daño directamente o usaban la complementariedad de bases
para introducir la base correcta. Sin embargo, hay mecanismos de reparación que son en sí
mismo fuentes importantes de mutación. Estos mecanismos parece que se desarrollaron
para prevenir hechos potencialmente más graves como la muerte celular o el cáncer. Como
se mencionó anteriormente, un bloqueo de la horquilla de replicación puede iniciar una ruta
de muerte celular. Tanto en procariotas como en eucariotas, este bloqueo de la replicación
puede evitarse mediante la inserción de bases no específicas. En E. coli el proceso requiere
la activación del sistema SOS. El nombre de SOS deriva de la idea de que este sistema se
induce como respuesta de emergencia para impedir la muerte de la célula en el caso de que
produzca un daño significativo en el DNA. La inducción de SOS es el último recurso, que
permite la supervivencia de la célula a cambio de un cierto grado de mutagénesis.
Se han necesitado más de 30 años para comprender como el sistema SOS genera
mutaciones mientras permite que la DNA polimerasa pase por alto las lesiones en la
horquilla de replicación bloqueada. Ya conocemos los daños que induce la luz ultravioleta
40
en el DNA (véase Figura 15-18). En los setenta se aisló una cepa mutante rara de E. coli
que sobrevivía a la exposición de los rayos ultravioletas sin sufrir mutaciones adicionales.
El simple hecho de que estos mutantes existieran sugería que algunos genes de E. coli
funcionaban generando mutaciones cuando se exponían a la luz ultravioleta. Las
mutaciones inducidas por la luz ultravioleta no ocurrirán si los genes DinB, UmuC o
UmuD´ están mutados.
La Figura 15-27 muestra los pasos del mecanismo SOS. En el primer paso, la luz
ultravioleta induce la síntesis de una proteína denominada RecA. Más adelante en el
capítulo se verá más sobre recA porque es una proteína clave en el mecanismo de
reparación y recombinación del DNA. Cuando la polimerasa replicativa (DNA polimerasa
III) se detiene en el sitio dañado del DNA, el DNA que está por delante de la polimerasa
continúa desenrollado, exponiendo regiones de cadena sencilla a las que se unirán proteínas
de unión a cadena sencilla. Después, la proteína RecA se une las proteínas de unión a
cadena sencilla formando un filamento de DNA-proteína. Este filamento es la forma
biológica activa de RecA. En esta situación, RecA actúa como señal que da lugar a la
inducción de algunos genes que cifran los miembros de una recién descubierta familia de
polimerasas de DNA que pueden evitar el bloqueo de la replicación y son distintas a las
polimerasa replicativas. Las DNA polimerasas que pueden evitar la detención de la
replicación se han encontrado en diversos taxones, desde lavaduras a la especie humana.
Estas polimerasas eucarióticas contribuyen a un mecanismo de daño tolerado denominado
síntesis por translesión de DNA, el cual se parece al sistema de bypass SOS de E. coli.
Estas polimerasas de translesión o de bypass, como han acabado siendo
denominadas, difieren de las polimerasa replicativas de varias maneras. Primero, pueden
tolerar aductos inusualmente grandes en las bases. Mientras que las polimerasas replicativas
41
se detienen si la base no encaja con un sitio activo, las polimerasas de bypass tienen
bolsillos mucho más grandes que pueden acomodar bases dañadas. Segundo, en algunas
situaciones la polimerasa de bypass tiene una tasa de error mucho mayor, en parte porque
no tiene la actividad correctora 3´ -> 5´ de la polimerasa replicativa principal. Tercero, sólo
pueden añadir unos pocos nucleótidos antes de desprenderse. Esta característica es
interesante porque la principal función de una polimerasa propensa a error es desbloquear
la horquilla de replicación, no la de sintetizar largos trechos de DNA que puedan contener
muchos errores.
Actualmente
se
conocen varias polimerasas de bypass que parecen estar siempre presentes en células
eucariotas, por lo que su acceso al DNA debe estar regulado para hacer uso de ellas sólo
cuando sea necesario. La célula ha evolucionado hacia una solución ingeniosa a este
problema. Recuérdese que una parte integral del complejo de replicación es la proteína
PCNA (del inglés proliferating cell nuclear antigen) que funciona como una abrazadera
deslizante que dirige una miríada de sucesos en la horquilla de replicación (véase la Figura
7-18). Una proteína crítica que está presente en una horquilla de replicación bloqueada es la
Rad6, que, curiosamente es una proteína que añade ubiquitinas a las proteínas (Figura 1528). Como se describió en el Capítulo 9, la adición de cadenas de muchos monómeros de
ubiquitina sirven como marcaje de degradación de las proteínas (véase Figura 9-23). Por
otro lado, la unión de un sólo monómero al PCNA cambia su conformación permitiendo
entonces que se una la polimerasa de bypass y dirija la síntesis por translesión. La
eliminación enzimática de la ubiquitina etiqueta la PCNA de manera que permite la
disociación de la polimerasa de bypass y la consiguiente restauración de la replicación
normal. Cualquier emparejamiento erróneo de bases debido a la síntesis por translesión
42
tiene todavía una opción de ser detectado y corregido por la ruta de reparación de
emparejamientos erróneos.
La regulación de la función de la PCNA mediante la adición y eliminación de
monómeros de ubiquitina ilustra la importancia de las modificaciones posteriores a la
traducción en eucariotas. Si el daño en la cadena molde no se corrige rápidamente, la
horquilla de replicación detenida será la señal de activación de la ruta de muerte celular.
Una célula eucariota no puede esperar a la síntesis de novo de una polimerasa de bypass
(pág539)
(pág540)
seguida de su transcripción y traducción como ocurre en sistema SOS de E. coli. En
cambio, las polimerasas de bypass eucarióticas se transcriben constitutivamente y están
siempre presentes. Su acceso a la horquilla de replicación se controla por modificaciones
postraduccionales rápidas y reversibles.
Mensaje.
En la síntesis por translesión, se reclutan polimerasas de bypass hacia la
horquilla de replicación que se ha parado debido a una lesión en la cadena molde. Las
polimerasas de bypass introducirán errores durante la síntesis que podrán persistir y dar
lugar a mutaciones o podrán ser reparadas por otros mecanismos tales como la reparación
de emparejamientos erróneos.
Reparación de roturas de doble cadena
Como ya se ha visto, muchos sistemas de reparación aprovechan la complementariedad del
DNA para realizar reparaciones libres de error. Esta reparación libre de error se caracteriza
por dos etapas: (1) eliminación de la base dañada, y quizá de las bases vecinas, de una de
43
las cadenas de la doble hélice y (2) uso de la otra cadena como molde para rellenar el hueco
de la cadena sencilla, mediante la síntesis de DNA. Sin embargo, ¿qué pasaría si las dos
cadenas de la doble hélice se dañaran de manera que la complementariedad de bases no
pudiera aprovecharse? Por ejemplo, la exposición a los rayos X causa a menudo roturas
cercanas en las dos cadenas de la doble hélice. Este tipo de mutaciones se denominan
rotura de doble cadena. Si no se repararan las roturas de doble cadena, podrían causar
varios tipos de aberraciones cromosómicas que darían como resultado la muerte celular o
un estado precanceroso.
Es interesante saber que la generación de roturas de doble cadena es una
característica de algunos procesos celulares normales que requieren reordenaciones del
DNA. Un ejemplo es la recombinación meiótica. Como se verá en el resto del capítulo, en
la célula, las rutas de reparación y el mecanismo de recombinación meiótica comparten
muchas proteínas. Por esta razón, se empezará con los mecanismos moleculares que
reparan roturas de doble cadena antes de volver la atención en los mecanismos de
recombinación meiótica.
Las roturas de doble cadena pueden surgir espontáneamente (por ejemplo, en
respuesta a especies de oxigeno reactivo producidos como subproducto del metabolismo
celular) o pueden ser inducidos mediante radiación ionizante. Se conocen varios
mecanismos que reparan las roturas de doble cadena, y se siguen descubriendo nuevos. En
la siguiente sección se describen dos mecanismos distintos: la unión de extremos nohomólogos y la recombinación homologa.
Unión de extremos no homólogos. Muchos de los mecanismos de reparación descritos
previamente sucedían en la fase S del ciclo celular, cuando el DNA está replicándose en
44
preparación para la mitosis o la meiosis. Sin embargo, a diferencia de muchas células
procariotas y eucariotas inferiores, las células eucariotas superiores normalmente no están
replicando su DNA, porque están en una fase de reposo del ciclo celular o porque han
dejado completamente de dividirse. ¿Qué sucede cuando la rotura de doble cadena ocurre
en células en las que la cadena no dañada o la cromátida hermana no están presentes? La
respuesta es que estos extremos han de ser reparados, perfecta o imperfectamente, porque
los extremos rotos pueden iniciar reordenaciones cromosómicas potencialmente
perjudiciales que podrían dar lugar a un estado canceroso (véase Capítulo 16).
Una vía mediante la cual los eucariotas superiores vuelven a unir los extremos rotos
de doble cadena es por un mecanismo más bien poco elegante pero importante denominado
unión de extremos no homólogos, NHEJ (del inglés nonhomologous end joinig), que se
muestra en la Figura 15.29. Al igual que otros mecanismos de reparación, el primer paso en
la ruta NHEJ es el reconocimiento del daño. La ruta NHEJ se inicia cuando dos proteínas
muy abundantes, KU70 y KU80, se unen a los extremos rotos, formando un heterodímero
que tiene dos funciones. Primero, evita que los extremos tengan daños adicionales, y en
segundo lugar, recluye otras proteínas que cortan los extremos de las cadenas generando los
extremos 5´-P y 3´-OH necesarios para la ligación. La DNA ligasa IV une entonces los dos
extremos.
(pág540)
(pág541)
¿Qué hacen los genetistas hoy en día?
¿Cómo saben los científicos que se han identificado todos los componentes de una
ruta? El modo de resolver este problema es difícil. La identificación de un nuevo
componente de la ruta NHEJ proporciona un ejemplo reciente.
45
Por varias razones, se pensaba que todos los componentes de la ruta NHEJ estaban
identificados. Sin embargo, una sorpresa les esperaba a los genetistas que analizaban una
línea celular (denominada 2BN) que se obtuvo de un niño con un trastorno hereditario raro.
Aunque eran capaces de demostrar que la línea celular 2BN era defectuosa para la
reparación de roturas de doble cadena, no fueron capaces de restaurar el sistema de
reparación y de producir el genotipo salvaje por complementación genética de cualquiera
de los genes que codifican proteínas de la ruta NHEJ. Es decir, cuando introdujeron genes
salvajes que codificaban proteínas NHEJ conocidas (por ejemplo, KU70, KU80, ligasa IV)
a la línea 2BN, la línea celular seguía siendo defectuosa en la reparación de roturas de
doble cadena. Este resultado negativo indicaba que la línea celular 2BN llevaba una
mutación en una proteína NHEJ desconocida.
En la era genómica, la identificación de proteínas relacionadas con enfermedades se
está convirtiendo en algo más común debido a que hay una amplia disponibilidad de líneas
celulares de personas afectadas fenotípicamente por una enfermedad. Cuando se tienen
problemas de salud, se va al medico y se le cuentan los síntomas que se padecen,
incluyendo información de familiares con problemas similares. Este tipo de información
está incrementando su importancia en la era genómica a la vez que las siempre crecientes
herramientas genéticas que pueden usarse a menudo para identificar genes mutantes
asociados con trastornos hereditarios (véase Capítulo 13 y 20).
¿Qué pueden hacer los genetistas en un laboratorio para encontrar una proteína, tal
como la proteína de NHEJ desconocida, que aún no ha sido identificada? Dos fueron los
laboratorios, siguiendo investigaciones muy diferentes, los que lograron identificar el nuevo
componente de NHEJ; una de las investigaciones se describirá aquí porque se ha utilizado
con éxito para descubrir otros proteínas. Como consta en capítulos anteriores, muchas
46
proteínas celulares realizan su función cuando interactúan con otras proteínas. En el
Capítulo 13, por ejemplo, se describe el sistema del doble híbrido de levaduras usado para
identificar proteínas que interaccionan con una proteína de interés. En el caso que se está
considerando ahora, la proteína de interés fue la XRCC4 del componente NHEJ (véase
Figura 15-31), y el sistema del doble híbrido identificó una proteína de interacción de 33kD
que era codificada por un tramo de lectura abierto humano no caracterizado. Que estas dos
proteínas interaccionen en el sistema del doble híbrido de levaduras no significa
necesariamente que vayan a interactuar en células humanas. Para establecer una conexión
entre la proteína de 33kD y la ruta NHEJ, los genetistas usaron otra técnica valiosa, el
RNAi (véase capítulo 8 y 13). En este caso, demostraron que las células normales que
expresaban RNA antisentido del ORF que codifica la proteína de 33kD, que evitaría la
traducción de este gen a proteína, tendrían ahora la ruta NHEJ defectuosas.
La historia se completó cuando se vio que a las células 2BN defectivas para la
reparación de roturas de doble cadena les faltaba la proteína de 33kD. La expresión de esta
proteína corrigió los defectos celulares.
Mensaje. NHEJ es una ruta propensa a error que repara las roturas de doble cadena en
eucariotas superiores volviendo a enlazar los dos extremos libres. La identificación de
genes responsables de trastornos hereditarios es una manera importante mediante la que los
genetistas aíslan componentes anteriormente desconocidos de la reparación o de otras rutas
biológicas.
Recombinación homóloga. Si la rotura de doble cadena ocurre después de la replicación
de una célula que se está dividiendo, el daño se podrá corregir por un mecanismo libre de
47
error denominado templado de cadena dependiente de la síntesis (SDSA, del inglés
synthesis-dependent strand anneling). Este mecanismo está representado en la Figura 1530. Éste usa la cromátida hermana disponible en la mitosis como molde para asegurar un
reparación correcta.
El primer paso en la SDSA es la unión de los extremos rotos mediante proteínas y
enzimas especializadas, la digestión de los extremos 5´ por una endonucleasa que expone
regiones de cadena sencilla, y el recubrimiento de estas regiones con proteínas entre las
cuales hay un
(pág541)
(pág542)
homólogo de la RecA, la Rad51. Recuérdese que en la respuesta SOS, los monómeros de
RecA se asociaban a regiones de cadena sencilla de DNA para formar filamentos de
nucleoproteínas. De forma similar, Rad51 forma largos filamentos porque se asocian con
las regiones de cadena sencilla expuestas. Los filamentos de Rad51-DNA participan
entonces en una búsqueda notable de la secuencia complementaria, en la cromátida
hermana no dañada, que usarán como molde para la síntesis de DNA. Este proceso se
denomina invasión de cadena. El extremo 3´ de la cadena invasora desplaza un de las
cromátidas hermanas no dañadas, que forma un lazo D (debido al desplazamiento), y sirve
como cebador en la síntesis de DNA desde su extremo 3´ libre. La nueva síntesis continúa
desde los extremos 3’ hasta que ambas cadenas se desenrollan de sus moldes y se anillan.
La ligación sella las mellas, dejando un fragmento reparado de DNA que tiene una
característica distintiva: se ha replicado de forma conservativa. Es decir, ambas son cadenas
recién sintetizadas, esto supone una diferencia importante con la replicación
semiconservativa de la mayoría del DNA (véase Capítulo 7).
48
Mensaje. El templado de cadena dependiente de la síntesis es un mecanismo libre de error
que repara las roturas de doble cadena en células en división en las que hay una cromátida
hermana disponible que sirve como molde para la síntesis de reparación.
15.5 El mecanismo del entrecruzamiento meiótico
Nuestro estudio de la reparación de roturas de doble cadena en células en división da lugar
de forma natural al tema del entrecruzamiento meiótico, porque una rotura de doble cadena
inicia el proceso del entrecruzamiento. Aunque las roturas sean una parte normal y
necesaria de la meiosis, si no se lleva a cabo correcta y eficientemente, son igual de
peligrosas que las roturas accidentales tratadas hasta ahora.
Aunque el proceso de la meiosis se describió por primera vez hace más de un siglo,
el mecanismo subyacente a la recombinación meiótica es todavía un área de investigación
activa en la que los mayores descubrimientos se han dado en los últimos diez años.
Roturas de doble cadena programadas inician la recombinación meiótica
El entrecruzamiento meiótico es un proceso extraordinariamente preciso que tiene lugar
entre dos cromosomas homólogos (Figura 15-31). Los modelos iniciales proponían que la
rotura de cadena sencilla en una cromátida no hermana era la que iniciaba la
recombinación. Sin embargo, ahora se conoce que la recombinación se inicia cuando una
enzima denominada SpoII hace cortes en el DNA de doble cadena en uno de los
cromosomas homólogos después de que la horquilla de replicación haya pasado a través de
una región cromosómica (Figura 15-32). Aunque se descubrió en levaduras, la proteína
49
SpoII se conserva ampliamente en eucariotas, indicando que este mecanismo de inicio de la
recombinación esta ampliamente utilizado.
Después de realizar los cortes, la enzima SpoII permanece unida a los nuevos
extremos 5’ libres donde parece que sirve para dos propósitos. Primero, protege los
extremos de daños adicionales, incluyendo la falsa recombinación con otros extremos
libres. Segundo, podrá atraer a otras proteínas que son necesarias para el siguiente paso en
la recombinación. Este paso es en realidad muy similar a lo que sucede en la reparación de
roturas de doble cadena en células en división. Los extremos 5’ son digeridos (retirados) y
un complejo proteínico se une los extremos 3’ de cadena sencilla (véase Figura 15-30).
Forman parte de este complejo la proteína Rad51, que, como se ha mencionado, es
homólogo a la proteína RecA que participa en la extraordinaria búsqueda de la
complementariedad en la cromátida hermana.
En este punto, la recombinación meiótica toma una ruta completamente distinta a la
que seguía la reparación de roturas de doble cadena. En la meiosis, Rad51 se asocia con
otra proteína, Dmc1, que sólo está presente durante la meiosis (véase Figura 15-32).
(Fíjense que el organismo modelo Drosophila y C. elegans no tiene el homólogo de
Dmc1.) De alguna manera, por un mecanismo no completamente entendido, los filamentos
que contienen
(pág542)
(pág543)
Rad51-Dmc1 guían la búsqueda de una secuencia complementaria. Sin embargo, en
contraste con la reparación de roturas de cadena doble, el filamento busca en el cromosoma
homólogo, no en la cromátida hermana. Esta búsqueda culmina con la invasión de cadena y
formación del lazo D, igual que en la reparación de roturas de doble cadena. Estos hechos
50
son necesarios para la formación de un quiasma en meiosis I. Es decir, los homólogos se
unen como resultado de la recombinación.
Mensaje. La recombinación meiótica se inicia con la enzima SpoII, que introduce cortes de
doble cadena en el cromosoma después de que se hayan replicado, pero antes de la
separación de los homólogos.
Este proceso es sencillo hasta este punto. Sin embargo, se han omitido por claridad
dos factores complicados. El primer factor es que el número de quiasmas que unen
cromosomas homólogos es mucho menor que el de cortes hechos por la SpoII. Hay al
menos un quiasma por cromosoma (pocos son los organismos, como Arabidopsis y
levaduras que tiene más). Por el contrario, más de 200 roturas de doble cadena se producen
en los 16 cromosomas de levaduras, y posiblemente muchos más en eucariotas superiores.
Todas o muchas de estas roturas se recortan de manera que, de media, alrededor de 1kb de
cadena sencilla de DNA se exponen por cada rotura. Todas o muchas de ellas participan en
la búsqueda de Rad51-Dmc1 con la subsiguiente formación de un lazo D que se muestra en
la Figura 15-32. La primera complicación es que, si la gran mayoría de estas roturas dan
lugar a un quiasma, ¿qué sucede con éstas?
El segundo factor que complica el proceso es que el entrecruzamiento meiótico tiene
en realidad varios resultados genéticos distintos. En lo que queda de este capítulo, se verán
cuales son estos resultados y cómo el modelo actual explica tanto los resultados genéticos
como el destino de las roturas de doble cadena.
El análisis genético de las tétradas proporciona indicios del mecanismo de
recombinación
51
Los análisis de tétradas en hongos filamentosos, como Neurospora crassa, proporcionó el
impulso que derivó en los primeros modelos para la recombinación meiótica. Como se
indicó en el Capítulo 3, la ventaja de estudiar los hongos es que se pueden recuperar y
analizar los cuatro productos de una sola meiosis. Se espera que el cruce entre A
a en
hongos cree un meiocito híbrido A/a que segrega 1:1 para formar los productos meióticos
en función de la primera ley de la segregación equitativa de Mendel. Es más, la segregación
1:1 se encuentra en la mayoría de meiocitos fúngicos: se verían 4A y 4a. Sin embargo, en
meiocitos raros, se pueden encontrar cualquiera de las 4 segregaciones anómalas, y estos
resultados genéticos diferentes son la clave para construir un modelo de entrecruzamiento.
La Figura 15-33 muestra las proporciones anómalas más frecuentes. Parece como si,
durante el entrecruzamiento, algunos alelos se hubiesen “convertido” en los alelos
opuestos. Por dicha razón el proceso se conoce como conversión génica; sólo es detectable
cuando hay heterocigosis para dos alelos distintos de un gen. En las ascas de segregación
6:2 ó 2:6, parece que se ha convertido una cromátida completa de un cromosoma. En las
ascas con segregación 5:3 ó 3:5 parece que se ha convertido sólo la mitad de la cromátida.
Para ver porqué, observe en la Figura 15-33 que en las ascas con segregación 5:3 ó 3:5 los
dos miembros de una pareja de esporas tienen genotipos distintos. Recuerde que cada
pareja de esporas se origina por mitosis a partir de un único producto de la meiosis. Las
segregaciones 5:3 ó 3:5 se pueden explicar únicamente porque las dos cadenas de la doble
hélice llevan la información de dos alelos distintos del gen A al finalizar la meiosis.
Por lo tanto, la conversión génica se puede explicar si el proceso de la meiosis
forma DNA heterodúplice, es decir, DNA con un segmento en el que una cadena es la
secuencia nucleotídica del alelo A y la otra es la secuencia nucleotídica del alelo a.
52
(pág543)
(pág544)
Tras la mitosis, las dos células hermanas que resultan de la división del núcleo que contiene
este heterodúplice será diferente, una con A y la otra con a.
Se podría suponer que A y a difieren en un único par de bases; siendo G-C en A y
A-T en a. Se podría suponer además que, para cualquier gen en particular, se formará un
único heterodúplice poco frecuente en la meiosis de manera que A-T en uno de los
productos se convierte en G-T (pronto se verá el mecanismo). Entonces podemos
representar los productos de la meiosis como
1. G-C 2. G-C 3. G-T 4. A-T
Después de la mitosis posmeiótica, las octadas resultantes serán
1. G-C 2. G-C 3. G-C 4. G-C 5. G-C 6. A-T 7. A-T 8. A-T
en la que se observa la segregación 5:3.
Sin embargo, en este capítulo se ha aprendido que el G-T del heterodúplice es un
candidato para la reparación por emparejamientos erróneos. Se podría suponer que este
sistema de reparación escindiera la T del heterodúplice G-T y insertara una C, teniendo así
G-C. En estas ascas, habrá una segregación 3:1 de G-C:A-T y la octada mostrará una
segregación 6:2.
El modelo de rotura de doble cadena para la recombinación meiótica.
Un modelo para explicar el origen del DNA heterodúplice en la recombinación meiótica se
muestra a la izquierda de la Figura 15-34. Se comienza en el punto de la invasión de cadena
(pág544)
(pág545)
53
(donde se dejó en la Figura 15-32). La cadena invasora se utiliza como cebadora de la
síntesis usando la cadena complementaria de la cromátida A como molde. Esta nueva
síntesis alarga el lazo D de cadena sencilla, que sirve como molde para la síntesis de DNA
en que la otra cadena sencilla (a) actúa de cebador. La actividad polimerasa rellena los
huecos y la DNA ligasa une los extremos dando como resultado una estructura peculiar que
parece el entrecruzamiento de dos cadena simples. Observe que esta estructura contiene el
heterodúplice.
El “entrecruzamiento” de cadena sencilla se denomina unión de Holliday, en honor
de Robin Holliday fuera el primero en proponerlo en los sesenta. Las dos uniones se
denominan doble unión de Holliday o estructura de Holliday. El modelo propone que
esta estructura inestable se resuelve produciendo un entrecruzamiento recíproco de doble
cadena. Además, el modelo
(pág545)
(pág546)
explica las conexiones físicas de suma importancia entre cromosomas homólogos en la
meiosis. La doble unión o estructura de Holliday es inestable y ha de ser resuelta en una de
dos maneras. Dicho simplemente, cada una de las estructuras puede ser resuelta mediante
rotura de forma “vertical” u “horizontal” y reunión de cadena única (véanse las flechas en
la Figura 15-34). Una resolución tiene como resultado el entrecruzamiento recíproco de
doble cadena (mostrado a la izquierda) y la ausencia de entrecruzamiento en la otra
(derecha).
¿Qué hacen los genetistas hoy en día?
54
Este modelo resuelve la segunda complicación: los diferentes resultados genéticos.
Pero el modelo debe dar cuenta también del hecho de que, en levaduras, parece ser que hay
más cortes que dobles estructuras de Holliday y quiasmas. Así, muchos de los cortes tienen
que ser el resultado de una resolución sin entrecruzamiento. ¿En qué punto del proceso se
toma la decisión de seguir una vía u otra? Los resultados de nuevos experimentos sugieren
que, en levaduras, la decisión se toma después de que SpoII corte pero antes de la invasión
de cadena y la formación del lazo D.
Estos descubrimientos y otro nuevos resultados dan lugar a un nuevo modelo que se
muestra en la tercera vía de la Figura 15-34. El modelo de entrecruzamiento de decisión
temprana propone que dos vías diferentes dan lugar bien al entrecruzamiento o a su
ausencia. Así, muchos de los cortes de doble cadena se resuelven sin entrecruzamiento por
un mecanismo muy similar al templado de cadena dependiente de la síntesis (véase Figura
15-34), excepto que la reacción es entre cromátidas no hermanas. Se ha propuesto la
hipótesis de que la vía de entrecruzamiento utilizaría un grupo de proteínas que estabilizan
la doble unión o estructura de Holliday, que normalmente es una estructura inestable. Este
modelo predice que la mutación de estas proteínas suprimiría los entrecruzamientos pero no
tendría ningún efecto sobre la ruta que no da lugar a entrecruzamientos. Estas mutaciones,
de hecho, se han aislado.
Mensaje. Los productos con entrecruzamientos y sin entrecruzamiento de la recombinación
meiótica surgen de cortes de doble cadena programados. Los entrecruzamientos se forman
tras la resolución de la doble unión de Holliday, mientras que la vía que da lugar a la
ausencia de entrecruzamiento sigue la resolución alternativa de la doble unión de Holliday
o bien una vía distinta parecida al sistema de reparación SDSA.
55
15.6 Cáncer: una consecuencia fenotípica importante de la mutación
¿Por qué hay tantos agentes mutagénicos que causan cáncer? ¿Cuál es la conexión entre el
cáncer y la mutación? En esta sección, se explora la conexión mutación-cáncer.
Se ha hecho patente que prácticamente todos los cánceres de las células somáticas
surgen a causa de una serie de mutaciones especiales que se acumulan en una célula.
Algunas de estas mutaciones alteran la actividad de un gen; otras simplemente eliminan su
función. Las mutaciones inductoras del cáncer pueden pertenecer a un limitado número de
grandes categorías: a aquellas que incrementa la capacidad de la célula de proliferar;
aquellas que descienden la susceptibilidad de la célula a seguir la vía de la muerte celular
programada, denominada apoptosis; o aquellas que incrementan la tasa de mutación de la
célula en general o su longevidad de manera que aumenta la probabilidad de cualquier
mutación, incluyendo las que fomentan la proliferación o la apoptosis.
Diferencias entre células normales y células cancerosas
Un tumor maligno, o cáncer, está compuesto por un agregado de células, todas ellas
derivadas de una célula fundadora aberrante. En otras palabras, todas las células malignas
provienen de un único clon, incluso en cánceres avanzados que tienen múltiples tumores en
muchos sitios del cuerpo. Las células cancerosas suelen distinguirse de las células normales
que las rodean por una serie de cambios fenotípicos específicos, tales como una tasa rápida
de división, la invasión de nuevos territorios celulares, una elevada tasa metabólica y una
morfología anormal. Por ejemplo, cuando las células epiteliales nor(pág546)
(pág548)
56
males se colocan en un medio de cultivo, sólo crecen si están adheridas a la superficie de la
placa. Además, las células normales en cultivo se dividen hasta que constituyen una
monocapa continua (Figura 15-35a). Por lo que reconocen de alguna manera que han
formado una capa epitelial sencilla y dejan de dividirse. Por el contrario, las células
malignas derivadas del tejido epitelial continúan proliferando y se apilan unas sobre otras
(Figura 15-35b).
Claramente, los factores que regulan la diferenciación celular normal deben estar
alterados. ¿Cuál es entonces la causa que produce el cáncer? Muchos tipos de celulares
distintos pueden sufrir su transformación a un estado maligno. ¿Existe una base común o,
por el contrario, cada uno surge de un modo diferente? Parece que, en efecto, podemos
hablar de un mecanismo general común que consiste en la acumulación de múltiples
mutaciones en una sola célula que provoca su proliferación descontrolada. Algunas de estas
mutaciones pueden transmitirse de padres a hijos a través de la línea germinal. Muchas
surgen de novo en el linaje celular somático de una célula determinada.
Mutaciones en células cancerosas
Existen varias pruebas que apuntan a que la transformación de las células de un estado
benigno a un estado canceroso tiene un origen genético. En primer lugar, como ya se ha
mencionado en este capítulo, muchos agentes mutagénicos como los químicos y las
radiaciones causan cáncer, lo que indica que producen cáncer introduciendo mutaciones en
los genes. En segundo lugar, pero no menos importante, se han identificado mutaciones que
se asocian frecuentemente con un tipo particular de cáncer.
Existen dos tipos generales de mutaciones asociadas a los tumores: las mutaciones
en los oncogenes y las mutaciones en los genes supresores de tumores. Las mutaciones en
57
los oncogenes actúan en las células tumorales como mutaciones dominantes afectando a la
ganancia de función (véase el Capítulo 6 para una explicación de ganancia de función de
las mutaciones dominantes). El enunciado sugiere dos características clave de las
mutaciones en los oncogenes. En primer lugar, las proteínas codificadas por el oncogén
están permanentemente activadas en las células tumorales, y segundo, que la mutación esté
en uno de los dos alelos es suficiente para
(pág547)
(pág548)
contribuir a la formación de un tumor. Estos genes es su estado normal, antes de mutar, se
denominan protooncogenes.
Las mutaciones en genes supresores de tumores que inducen la formación de
tumores son mutaciones recesivas de pérdida de función. Es decir, este tipo de mutaciones
hace que se pierda mucha o toda la actividad de los productos génicos codificados (es decir,
una mutación nula). Además, para que se desarrolle el cáncer, la mutación debe estar
presente en ambos alelos del gen.
Mensaje. Los oncogenes codifican formas mutadas de proteínas de las células normales
como resultado de una mutación dominante, normalmente debido a su activación
inapropiada. Por otro lado, los genes supresores de tumores codifican proteínas cuya
pérdida de actividad pueden contribuir a un estado canceroso, y como tal, son mutaciones
recesivas.
Clases de oncogenes Se han identificado entorno a cien oncogenes diferentes. ¿Cómo
funcionan los protooncogenes, los genes correspondientes normales, no mutados? Los
protooncogenes suelen cifrar una clase de proteínas que se activan selectivamente sólo en
58
presencia de las señales reguladoras adecuadas. Muchos de los productos de los
protooncogenes son elementos inductores (reguladores positivos) del ciclo celular. Entre
ellos se incluyen receptores de factores de crecimiento, proteínas implicadas en la
transducción de señales y factores de transcripción. Otros productos de los protooncogenes
funcionan inhibiendo el proceso apoptótico (control negativo) que destruye células
dañadas. En ambos casos de mutación de un oncogén, la actividad de la proteína mutante se
desacopla de su vía de regulación normal, lo que se traduce en una expresión continuada y
desregulada. El producto proteico continuamente expresado de un oncogén se denomina
oncoproteína. Se han identificado las diferentes categorías de oncogenes en función de las
diversas maneras en las que se pueden desacoplar de su función reguladora.
El oncogén ras se puede utilizar para ilustrar lo que ocurre cuando un gen normal
sufre una mutación inductora de un tumor. Como ocurre en muchos casos, la
transformación de una proteína
(pág548)
(pág549)
normal en una oncoproteína suele implicar modificaciones estructurales de la propia
proteína, que en este caso están causadas por una simple mutación. Por ejemplo, un solo
cambio de base que convierte una glicina en una valina en el aminoácido numero 12 de la
proteína Ras, genera una oncoproteína que se ha encontrado asociada al cáncer de vejiga en
humanos (Figura 15-36a). La proteína Ras normal es una subunidad de una proteína G que
está implicada en la transducción de señales. Normalmente funciona alternando entre un
estado activo, unido a GTP, y un estado inactivo, unido a GDP. La mutación de cambio de
sentido en el oncogén ras produce una proteína que siempre se une a GTP (Figura 15-36b),
59
incluso en ausencia de señales habituales. Como consecuencia, la oncoproteína Ras
transmite de forma continua una señal que promueve la proliferación celular.
Genes supresores de tumores Las funciones normales de los genes supresores de tumores
pueden clasificarse en categorías complementarias a las de los protooncogenes (véase la
Tabla 15-1). Algunos genes supresores de tumores cifran elementos reguladores negativos,
siendo su función normal inhibir el ciclo celular. Otros cifran reguladores positivos que
normalmente activan la apoptosis, o muerte celular, de una célula dañada. Otros actúan
indirectamente en el cáncer, con una actividad normal reparando el DNA dañado o
controlando la longevidad celular. A continuación se considerará un ejemplo.
Las mutaciones en p53 aparecen asociadas a muchos tipos de tumores. En realidad,
se ha estimado que un 50% de los tumores humanos carecen de un gen p53 funcional. La
proteína p53 activa es un regulador transcripcional que se activa en respuesta a la presencia
de daños en el DNA. La p53 salvaje activa desempeña un doble papel: impide la progresión
del ciclo celular hasta que hayan sido reparados los daños en el DNA y, en determinadas
circunstancias, induce la apoptosis. En ausencia de un gen p53 funcional el ciclo celular
progresa aunque no hayan sido reparados los daños en el DNA. La progresión del ciclo
celular en la mitosis provoca un aumento generalizado en la frecuencia de mutaciones,
reorganizaciones cromosómicas y aneuploidías, y así se incrementa la probabilidad de que
aparezcan otras mutaciones que aumenten la proliferación celular o inhiban la apoptosis.
Ahora está claro que las mutaciones capaces de producir un aumento en la tasa de mutación
juegan un papel clave en la inducción de tumores en los seres humanos. Estas mutaciones
son mutaciones recesivas en los genes supresores de tumores que normalmente actúan en
las rutas de reparación del DNA. Las mutaciones en estos genes interfieren con la
60
reparación del DNA. Éstas promueven el desarrollo de tumores de forma indirecta
incrementando la tasa de mutación, que eleva la probabilidad de que surjan mutaciones en
oncogenes o en genes supresores de tumores, que alterarían la regulación normal del ciclo
celular y de la muerte celular programada. Se han identificado un gran número de estas
mutaciones de genes supresores de tumores, entre las cuales se incluyen algunas asociadas
a cánceres hereditarios en tejidos especiales, como las mutaciones BRCA1 y BRCA2 y el
cáncer de mama.
Mensaje. Los agentes mutagénicos pueden causar algunos cánceres porque el cáncer es en
parte causado por versiones mutantes de genes normales que dan lugar a un crecimiento
descontrolado.
(pág549)
(pág550)
Resumen
Los cambios en el DNA de un gen (mutaciones puntuales) generalmente suponen uno o
algunos pocos pares de bases. Las sustituciones de un único par de bases pueden crear
codones sin sentido o de cambio de sentido (de terminación de la transcripción). Una purina
reemplazada por otra purina (o una pirimidina reemplazada por otra pirimidina) es una
transición. Una purina reemplazada por una pirimidina (o viceversa) es una transversión.
Las adiciones o deleciones de un único par de bases producen mutaciones de cambio de
fase. Algunos genes humanos que contienen repeticiones de trinucleótidos (sobretodo los
que se expresan en tejido neural) mutan debido a la expansión de estas repeticiones y de
esta manera pueden causar enfermedades. La formación de monoaminoácidos repetidos en
el polipéptido cifrado por estos genes, es responsable de los fenotipos mutantes.
61
Las mutaciones pueden ocurrir espontáneamente como subproductos de procesos
celulares normales como la replicación del DNA o el metabolismo, o pueden ser inducidos
por radiaciones mutagénicas o sustancias químicas. Debido a su especificidad química los
mutágenos a menudo causan un tipo de cambio específico. Por ejemplo, algunos producen
exclusivamente transiciones G·C → A·T, otros exclusivamente cambios de fase.
Aunque las mutaciones sean necesarias para generar diversidad, muchas mutaciones
están asociadas a enfermedades genéticas hereditarias como el xeroderma pigmentosum.
Además, las mutaciones que ocurren en células somáticas son el origen de muchos cánceres
humanos. Se han desarrollado muchas rutas biológicas para corregir el amplio espectro de
mutaciones espontáneas e inducidas. Algunas rutas, como la reparación por escisión de
base o nucleótido o la reparación de emparejamientos erróneos, usan la información
heredada en forma de complementariedad de bases para realizar una reparación libre de
error. Otras rutas que usan la polimerasa de bypass para corregir las bases dañadas
introducen errores en la secuencia de DNA.
La corrección de las roturas de doble cadena es particularmente importante porque
estas lesiones pueden llevar a la desestabilización de reordenaciones cromosómicas. La ruta
de unión de extremos no-homólogos vuelve a ligar los extremos rotos de manera que la
detención de la horquilla de replicación no resulte en la muerte celular. En células que se
están replicando, la reparación libre de error de las roturas de doble cadena puede hacerse
mediante la ruta del templado de cadena dependiente de la síntesis, que utiliza la cromátida
hermana para reparar la rotura.
Cientos de roturas de doble cadena programadas inician el entrecruzamiento
meiótico entre cromátidas no hermanas. Como las otras roturas de doble cadena, las roturas
meióticas deben ser procesadas rápida y eficazmente para evitar graves consecuencias
62
como la muerte celular y el cáncer. La forma en la que esta reparación se lleva a cabo es
aún objeto de investigación. Un modelo actual, estudiado a partir de la segregación en la
formación de esporas fúngicas, propone el uso de las cromátidas no hermanas del
cromosoma homólogo como molde para reparar las roturas. Según este modelo, muchas de
las roturas dan lugar a productos sin entrecruzamiento y son probablemente resueltos por
un mecanismo parecido al SDSA. Sin embargo, las roturas críticas en la formación de
quiasmas dan lugar a entrecruzamientos tras la formación y consiguiente resolución de la
doble unión o estructura de Holliday.
Términos clave
agente intercalante (pág. 528)
análogo de base (pág. 526)
apoptosis (pág. 546)
desplazamiento tautomérico (pág. 520)
cáncer (pág. 546)
ceto (pág. 520)
conversión génica (pág. 543)
doble estructura unión o estructura de Holliday (pág. 545)
enol (pág. 520)
gen supresor de tumor (pág. 548)
imino (pág. 520)
lesión espontánea (pág. 522)
modelo de decisión temprana de entrecruzamiento (pág. 546)
63
mutación de cambio de fase (pág. 516)
mutación de cambio de sentido (pág. 516)
mutación espontánea (pág. 518)
mutación indel (pág. 522)
mutación inducida (pág. 518)
mutación puntual (pág. 514)
mutación sin sentido (pág. 516)
mutación sinónima (pág. 516)
mutagénesis (pág. 526)
mutágeno (pág. 518)
oncogén (pág. 547)
oncoproteína (pág. 548)
polimerasa de bypass (de translesión) (pág. 539)
protooncogén (pág. 548)
templado de cadena dependiente de la síntesis (SDSA) (pág. 541)
reparación de emparejamientos erróneos (pág. 536)
reparación genómica global (GGR) (pág. 534)
reparación por escisión de bases (pág. 532)
reparación por escisión de nucleótido (NER) (pág. 534)
reparación por escisión de nucleótido unido a la transcripción (TC-NER) (pág. 534)
repetición de trinucleótido (pág. 524)
replica en placa (pág. 519)
rotura de doble cadena (pág. 540)
síndrome de Cockayne (pág. 534)
64
síntesis de DNA de translesión (pág. 539)
sistema de reparación dependiente de homología (pág. 532)
sistema SOS (pág. 538)
sitio apurínico (pág. 523)
sustitución conservadora (pág. 516)
sustitución no conservadora (pág. 516)
tautómero (pág. 520)
test de Ames (pág. 530)
(pág550)
(pág551)
test de fluctuación (pág. 519)
transición (pág. 515)
transversión (pág. 515)
trastorno genético heterogéneo (pág. 536)
unión de extremos no homólogos (NHEJ) (pág. 540)
estructura de Holliday (pág. 545)
xeroderma pigmentosum (pág. 534)
Problemas resueltos
Problema resuelto 1. En el capitulo 9, aprendió que los codones UAG y UUA eran dos de
los tripletes sin sentido terminadores de la traducción. Basándose en la especificidad
65
mutagénica de la aflatoxina B1 y el metanosulfonato de etilo (EMS), describa si cada uno
de estos mutágenos podría revertir los codones UAG y UAA a la forma salvaje.
SOLUCIÓN
El EMS induce fundamentalmente transiciones G·C –> A·T. Los codones UAG no podrían
revertir al tipo salvaje, puesto que el EMS solo estimularía el cambio UAG -> UAA, lo que
originaría otro codón sin sentido (ocre). El EMS no actuaría sobre los codones UAA. La
aflatoxina B1 induce principalmente transversiones G·C –> T·A. Solo actuaría sobre la
tercera posición de los codones UAG, produciendo (a nivel de mRNA) un cambio UAG –>
UAU, que da lugar a tirosina. Por lo tanto, si la tirosina fuera un aminoácido aceptable en la
posición correspondiente de la proteína, la aflatoxina B1 podría revertir los codones UAG.
La aflatoxina B1 no revertiría los codones UUA, porque no hay pares G·C en la posición
correspondiente del DNA.
Problema resuelto 2. Explique por qué el 5-bromouracilo no puede revertir las mutaciones
inducidas por las acridinas en el fago T4 o por ICR-191 en bacterias.
SOLUCIÓN
Las acridinas y ICR-191 inducen mutaciones delecionando o añadiendo uno o más pares de
bases, que dan lugar a un cambio de fase. Sin embargo, el 5-bromouracilo induce
mutaciones debido a la sustitución de una base por otra. Esta sustitución no compensa el
cambio de fase causado por ICR-191 y las acridinas.
Problemas
66
PROBLEMAS BÁSICOS
1. Considere las siguientes secuencias de tipo salvaje y mutante:
Tipo salvaje ….CTTGCAAGCGAATC….
Mutante
….CTTGCTAGCGAATC….
En la sustitución que se muestra, parece haberse creado un codón stop. ¿Qué información
adicional se necesita para asegurarlo?
2. ¿Qué tipo mutación se representa en las siguientes secuencias (mostradas como mRNA)?
Tipo salvaje ….5’ AAUCCUUACGGA 3’ ….
Mutante
….5’ AAUCCUACGGA 3’ ….
3. ¿Puede una mutación de cambio de sentido de prolina a histidina producirse por un
mutágeno que cause transiciones G·C → A·T?
4. Mediante la sustitución de pares de bases, ¿cuáles son todos los cambios sinónimos que
pueden producirse a partir del codón CGG?
5.
a. ¿Cuáles son todas las transversiones que pueden producirse a partir del codón
CGG?
b. ¿Cuáles de estas transversiones serán de cambio de sentido? ¿Puede estar seguro?
6. ¿Qué tautómero de timina es el que puede formar más puentes de hidrógeno al
emparejarse con otras bases en el DNA?
7.
a. Si la forma enol de la timina se inserta en el molde de cadena sencilla durante la
replicación, ¿qué sustitución de par de bases dará como resultado?
b. Si la timina cambia a su forma enol mientras actúa como molde durante la
replicación, ¿qué sustitución de par de bases dará como resultado?
8.
a. La naranja de acridina es un mutágeno efectivo para producir alelos nulos por
mutación. ¿Por qué produce alelos nulos?
67
b. Cierto compuesto parecido a la acridina genera sólo inserciones de una única
base. Una mutación inducida por este compuesto se trata con el mismo compuesto, y se
producen algunos revertientes. ¿Cómo es posible este resultado?
9. Defienda la afirmación, “El cáncer es una enfermedad genética.”
10. Ponga un ejemplo de un defecto en la reparación en el DNA que de lugar al cáncer.
11. En la reparación de emparejamientos erróneos en E. coli, sólo se corrige un
emparejamiento erróneo en la cadena recién sintetizada. ¿Cómo puede E. coli reconocer la
cadena recién sintetizada? ¿Qué sentido evolutivo tiene esta capacidad?
12. Una lesión mutacional ocurre en una secuencia que contiene un par de bases
erróneamente emparejado:
5’ AGCTGCCTT 3’
3’ TCGATGGAA 5’
Codón
Si la reparación del emparejamiento erróneo ocurre en cualquier dirección, ¿Qué
aminoácidos se podrían encontrar en este sitio?
13. ¿Bajo que circunstancias una unión de extremos no homólogos podría considerarse
propensa a error?
(pág551)
(pág552)
14. ¿Por qué muchos productos químicos que dan positivo en el test de Ames son también
clasificados como carcinógenos?
15. La proteína SpoII se conserva en eucariotas. ¿Cree que también se conserva en especies
bacterianas? Justifique su respuesta.
16. Distinga las siguientes parejas de términos:
68
a. Transiciones y transversiones
b. Mutaciones sinónimas y neutras
c. Mutaciones de cambio de sentido y sin sentido
d. Mutaciones de desplazamiento del marco de lectura y sin sentido
17. ¿Cuáles son las principales diferencias entre la reparación de las roturas de doble
cadena cuando se producen accidentalmente y su reparación cuando ocurren en la meiosis?
18. ¿Qué es la conversión génica y qué tiene que ver con la reparación de emparejamientos
erróneos?
19. Describa dos lesiones espontáneas que puedan dar lugar a mutaciones.
20. ¿Qué son las polimerasas de bypass? ¿En qué difieren de las polimerasas de
replicación? ¿De qué manera sus características especiales facilitan su papel en la
reparación del DNA?
21. ¿Qué es el DNA heterodúplice? ¿Cuál es su relación con la conversión génica?
22. En células adultas que han dejado de dividirse, ¿qué tipos de sistemas de reparación son
posibles?
23. Cierto compuesto análogo a la base citosina se puede incorporar en el DNA. Forma
puentes de hidrógeno como lo hace la citosina, pero a menudo se isomeriza a una forma
que establecen puentes de hidrógeno como la timina. ¿Espera que éste compuesto sea
mutagénico, y, en tal caso, qué tipo de cambios podría inducir en el DNA?
24. Existen dos rutas, recombinación homóloga y unión de extremos no homólogos
(NHEJ), por las que se reparan roturas de doble cadena en el DNA. Si la recombinación
homóloga es una ruta libre de errores, mientras que NHEJ no siempre lo es, ¿por qué se
utiliza NHEJ la mayoría del tiempo en eucariotas?
69
25. ¿Cuál es la ruta de reparación que reconoce el daño en el DNA durante la transcripción?
¿Qué ocurre si el daño no se repara?
PROBLEMAS PARA PENSAR
26.
a. ¿Por qué es imposible inducir mutaciones sin sentido (representadas en el mRNA
por los tripletes UAG, UAA y UGA) tratando cadenas de tipo salvaje con mutágenos que
causan sólo transiciones A·T → G·C en el DNA?
b. La hidroxilamina (HA) causa sólo transiciones G·C → A·T en el DNA.
¿Producirá la HA mutaciones sin sentido en cadenas de tipo salvaje?
c. ¿Podrá el tratamiento con HA revertir mutaciones sin sentido?
27. Se tratan varios mutantes auxotróficos en Neurospora con varios agentes para analizar
si se produce reversión. Se obtuvieron los siguientes resultados (el signo más indica
reversión; HA causa sólo transiciones G·C→A·T).
Mutante
5-BU
HA
Proflavina
Reversión espontánea
________________________________________________________________________
1
−
−
−
−
2
−
−
+
+
3
+
−
−
+
4
−
−
−
+
5
+
+
−
+
_______________________________________________________________
a. Describa la naturaleza molecular de la mutación original (no de la reversión) en
cada uno de los cinco mutantes. Sea lo más concreto posible.
70
b. Indique para cada uno de los cinco mutantes un posible mutágeno que pudiera
haber causado la mutación original. (La mutación espontánea no se admite como
respuesta).
c. En el experimento de reversión para el mutante 5, se obtiene un protótrofo
particularmente interesante. Cuando éste se cruza con una cadena salvaje estándar, la
descendencia consta de un 90% de protótrofos y un 10% de auxótrofos. Dé una explicación
completa para estos resultados que incluya una razón precisa para las frecuencias
observadas.
28. Utiliza nitrosoguanidina para “revertir” alelos mutantes nic-2 (dependientes de
nicotinamida) de Neurospora. Trata las células, las siembra en un medio sin nicotinamida y
busca colonias protótrofas. Obtiene los siguientes resultados para dos alelos mutantes.
Explique estos resultados en el nivel molecular, e indique cómo comprobaría su hipótesis.
a. No obtiene ningún protótrofo con el alelo 1 de nic-2.
b. Obtiene tres colonias protótrofas con el alelo 2 de nic-2, A, B y C, y las cruza por
separado con una cepa de tipo salvaje. Del cruzamiento del protótrofo A × tipo
salvaje, obtiene una descendencia de 100 individuos, todas ellos protótrofos. Del
cruzamiento del protótrofo B × tipo salvaje, obtiene una descendencia de 100
individuos, de las que 78 son protótrofos y 22 requieren nicotinamida. Del
cruzamiento del protótrofo C × tipo salvaje, obtiene una descendencia de 1000
individuos, de los que 996 son protótrofos y 4 requieren nicotinamida.
29. Está trabajando con un mutágeno recién descubierto, y le gustaría determinar el cambio
de base que introduce en el DNA. Hasta ahora ha visto que el mutágeno altera
químicamente una sola base de manera que sus propiedades de emparejamiento se ven
alteradas permanentemente. Para determinar la especificidad de la alteración, examina los
71
cambios de aminoácido que tienen lugar tras la mutagénesis. Aquí tiene una muestra de lo
que obtiene:
(pág552)
(pág553)
Original:
Gln-His-Ile-Glu-Lys
Mutante:
Gln-His-Met-Glu-Lys
Original:
Ala-Val-Asn-Arg
Mutante:
Ala-Val-Ser-Arg
Original:
Arg-Ser-Leu
Mutante:
Arg-Ser-Leu-Trp-Lys-Thr-Phe
¿Cuál es el cambio de base específico que causa el mutágeno?
30. Ahora encuentra un mutante adicional del experimento del Problema 29:
Original:
Ile-Leu-His-Gln
Mutante:
Ile-Pro-His-Gln
¿Podría el cambio de base específico de su respuesta en el Problema 29 explicar esta
mutación? ¿Por qué o por qué no?
31. La cepa A de Neurospora contiene una mutación ad-3 que revierte espontáneamente
con una frecuencia de 10-26. Se cruza la cepa A con una cepa salvaje recién aislada y se
recogen las cepas descendientes de fenotipo Ad-3. Cuando se examinaron 28 de ellas, se
encontró que 13 líneas revierten con una tasa de 1 entre 1026, mientras que las restantes 15
líneas revierten con una tasa de 1023. Formule una hipótesis que explique estos resultados y
diseñe un programa experimental para someterle a comprobación.
32. Usted es un experto en mecanismos de reparación del DNA. Recibe una muestra de una
línea celular humana de una mujer que padece síntomas de xeroderma pigmentosum.
72
Determina que ella tiene una mutación en un gen que no ha sido asociado previamente con
XP. ¿Cómo es esto posible?
33. El ozono (O3) es un importante componente que se forma de manera natural en la
atmósfera, donde forma una capa que absorbe la radiación ultravioleta. En los años setenta
se descubrió un agujero en la capa de ozono sobre la Antártida y Australia. El agujero
aparece de forma estacional y se vio que es causa de la actividad humana. Específicamente,
el ozono se destruye por una clase de compuestos químicos (denominados CFCs de
clorofluocarbonos) que se encuentran en los refrigerantes, sistemas de aire acondicionado y
aerosoles.
Como científico que trabaja en mecanismos de reparación del DNA, descubre que
ha habido un incremento significativo de cáncer de piel en las comunidades costeras de
Australia. Un periodista amigo suyo le ofrece publicar una pequeña nota (un párrafo) en la
que describa la posible conexión entre el agujero en la capa de ozono y el incremento de los
cánceres de piel. Usando como base lo que ha aprendido en este capítulo sobre la
reparación en el ADN, redacte un párrafo dónde explique la conexión entre los
mecanismos.
34. ¿Cuál de las siguientes líneas de ascas muestra conversión génica en el locus arg-2?
1
2
3
4
5
6
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
arg
+
+
arg
arg
+
arg
arg
arg
arg
arg
arg
arg
arg
+
+
arg
arg
arg
arg
arg
+
arg
73
arg
+
arg
arg
arg
arg
arg
+
arg
arg
arg
arg
____________________________
35. Suponga que ha realizado un cruzamiento en Neurospora usando un mutante que tiene
tres sitios mutantes, denominados 1, 2 y 3, en el mismo gen y separados de forma regular a
lo largo del gen cada 2 kb:
123 × +++
Explique un origen probable para las siguientes dos ascas:
123
123
123
123
+++
12+
+++
12+
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
36. El modelo de rotura de doble cadena ilustrado en este capítulo genera un heterodúplice.
Otros modelos generan dos heterodúplices idénticos en la misma meiosis; por lo tanto las
cromátidas son, parental 1, heterodúplice, heterodúplice, parental 2. ¿Qué patrón de octadas
se produciría de diferentes combinaciones de reparación y de no reparación de
emparejamientos erróneos de estos dos heterodúplices?
EXPLORANDO GENOMAS Tutoría bioinformática en Web
74
Explorando el Proyecto de Anatomía del Cáncer
El proyecto de Anatomía del Cáncer del NCBI (Centro Nacional de Información
Biotecnológica, del inglés National Center for Biotechnology Information) es una base de
datos especializada que se centra en un particular subconjunto de datos. Ésta proporciona,
en un formato gráfico y de fácil búsqueda, toda la información conocida sobre genes
individuales, posiciones en el mapa, y localización cromosómica de los genes asociados al
cáncer. En la tutoría Genómica en www.whfreeman.com/iga9e, se exploran los datos de
expresión génica, mutación génica, y aberraciones cromosómicas asociadas a varios tipos
de tumores.
PIES DE FIGURAS
Imagen inicial
Modelo de ordenador de la unión de Holliday. [Julie Newdol, laboratorio de computadores
gráficos, Universidad de California, San Francisco. Copyright de Regents, Universidad de
California.]
75
FIGURA 15-1 Cáncer de piel en xeroderma pigmentosum
La deficiencia de un enzima que ayuda a reparar el DNA dañado causa esta enfermedad
hereditaria recesiva. La deficiencia enzimática conlleva a la formación de un cáncer de piel
bajo la exposición de la piel a los rayos ultravioleta de la luz solar. [Ken Greer/Visuals
Unlimitated.]
FIGURA 15-2 Consecuencias intragénicas de la mutación puntual
Las mutaciones puntuales dentro de la región codificadora de un gen varían en el efecto que
tienen sobre la función proteica. Las proteínas con mutaciones sinónimas y de cambio de
sentido se mantienen normalmente como funcionales.
Transición
Transversión
FIGURA 15-3 Las mutaciones puntuales pueden alterar el corte y empalme del
mRNA
Los dos ejemplos muestran las consecuencias de la mutación puntual en el sitio de corte y
empalme. (a) La mutación de transición de C a T conlleva a la formación de un
dinucleótido GT en el exón, formándose un nuevo sitio 5’ de corte y empalme. Como
resultado, 64 nucleótidos al final del exón son eliminados. (b) La mutación de transversión
de G a T eliminaría el sitio 5’ de corte y empalme con lo que el intrón se retendría en el
mRNA.
FIGURA 15-4 Consecuencias de las mutaciones puntuales en los productos génicos
76
Las mutaciones puntuales en regiones codificadoras pueden alterar la estructura proteica
alterando o no el tamaño del mRNA. Las mutaciones puntuales en regiones reguladoras
pueden impedir la síntesis de mRNA (y la proteína).
FIGURA 15-5 Hipótesis del test de fluctuación
Linajes celulares que ilustran los resultados que se esperarían de acuerdo con dos hipótesis
opuestas sobre el origen de las células resistentes. [De G.S. Stent y R. Calendar, Molecular
Genetics 2.ªed. W. H. Freeman and Company, 1978]
FIGURA 15-6 Réplica en placa
El método de la réplica en placa se utiliza para revelar que colonias de una placa matriz son
mutantes, de acuerdo con su comportamiento tras ser replicadas en placas de medio
selectivo. [De G.S. Stent y R. Calendar, Molecular Genetics 2.ªed. W. H. Freeman and
Company, 1978]
FIGURA 15-7 Réplica en placa para demostrar la existencia de mutantes antes de la
selección
Que el patrón de colonias resistentes sea idéntico en las réplicas indica que las colonias
resistentes estaban ya en la placa matriz. [De G.S. Stent y R. Calendar, Molecular Genetics
2.ªed. W. H. Freeman and Company, 1978]
FIGURA 15-8 Las bases pueden adoptar formas tautoméricas raras propensas a
emparejamientos erróneos
77
Emparejamiento de las bases normales comparado con los emparejamientos erróneos. (a)
Emparejamiento entre las formas normales (ceto) de las bases. (b) Emparejamientos
erróneos resultantes de las formas tautoméricas raras.
FIGURA 15-9 Los desplazamientos tautoméricos de las bases del DNA pueden causar
mutaciones
Un desplazamiento tautomérico genera una mutación en alguna progenie después de la
replicación de DNA. (a) En el ejemplo que se representa en la figura, un residuo de guanina
sufre una cambio tautomérico a su forma enol rara (G*) durante la replicación. (b) En su
forma enol, empareja con la timina. (c y d) En la siguiente replicación, el residuo de
guanina vuelve a su forma ceto más estable. La timina incorporada frente a la forma enol de
la guanina (véase en b) dirige la incorporación de adenina en la siguiente replicación,
mostrado en c y d. El resultado neto es una mutación GC –> AT. [De E.J.Gardner y D.P.
Snustad, Priciples of Genetics, 5ª ed. (c) 1984 por John Wiley & Sons, New York.]
FIGURA 15-10 Las mutaciones indel causan desplazamiento del marco
La adición y deleción de base (mutaciones indel) causan mutaciones de desplazamiento del
marco de lectura debido al emparejamiento erróneo por deslizamiento de las secuencias
repetidas durante la replicación.
FIGURA 15-11 Los radicales de oxígeno pueden dañar el DNA
Productos que se encuentran en el DNA dañado después del ataque con radicales de
oxígeno. Abreviación: dR, desoxirribosa.
78
FIGURA 15-12 Repeticiones de trinucleótidos en el gen FMR-1 dificultan la
transcripción
El gen FMR-1 en el síndrome del X frágil. (a) Estructura del exón y las repeticiones CGG
aguas arriba. (b) La transcripción y metilación en alelos normales, premutados y con
mutación completa. Los círculos rojos representan los grupos metilo. [De W.T. O’Donnell
y S.T.Warren, Annu. Rev. Neurosci. 25, 2002, 315-338, Fig. 1.]
FIGURA 15-13 El emparejamiento erróneo por deslizamiento causa la expansión de
repeticiones
Las regiones de repetición de trinucleótidos son propensas a errores de emparejamiento por
deslizamiento (bucle rojo). Como consecuencia, la misma región de repeticiones de
trinucleótidos podría duplicarse dos veces durante la replicación.
FIGURA 15-14 Emparejamientos alternativos del 5-bromouracilo (5-BU)
(a) El 5-BU es un análogo de la timina que se puede incorporar erróneamente al DNA como
una base. (b) La forma ionizada empareja con la guanina.
FIGURA 15-15 Emparejamientos alternativos de la 2-aminopurinas.
(a) La 2-aminopurina (2-AP) es un análogo de la adenina que puede emparejarse con la
timina. (b) En su estado protonado, la 2-AP se puede emparejar con la citosina.
FIGURA 15-16 Emparejamiento erróneo específico inducido por la alquilación
El tratamiento con EMS altera la estructura de la guanina y la timina dando lugar a
emparejamientos erróneos.
79
FIGURA 15-17 Agentes intercalantes
Estructuras de los agentes intercalantes comunes (a) y su interacción con el DNA (b). [De
L. S. Lerman, “The Structure of the DNA-Acridine Complex” Proc. Natl. Acad. Sci. USA
49, 1963, 94.]
FIGURA 15-18 Fotoproductos generados por la luz ultravioleta
Los fotoproductos que unen las pirimidinas adyacentes en el DNA están fuertemente
correlacionados con la mutagénesis. [(Izquierda) Adaptado de E.C. Friedberg, DNA Repair.
Copyright 1985 de W. H. Freeman and Company. (Derecha) De J. S. Taylor et al.]
FIGURA 15-19 La aflatoxina B1 forma un producto de adición voluminoso
Unión al DNA de la aflatoxina B1 al activarse metabólicamente.
FIGURA 15-20 El test de Ames revela los productos mutagénicos
Resumen del procedimiento empleado en el test de Ames. Las enzimas solubilizadas del
hígado se añaden a la suspensión de bacterias auxotróficas en una solución del posible
carcinógeno (X). Esta mezcla se siembra en un medio que no contiene histidina. La
aparición de revertientes indica que el compuesto químico es mutagénico y posiblemente
también carcinogénico.
FIGURA 15-21 Test de Ames en el que se muestra la mutagenicidad de la aflatoxina
B1
80
TA100, TA1538 y TA1535 son cepas de Salmonella que llevan diferentes mutaciones
auxotróficas de histidina. La cepa TA100 es muy sensible a la reversión mediante cambios
de pares de bases. Las cepas TA1535 y TA1538 son sensibles a la reversión mediante
mutaciones de desplazamiento del marco de lectura. Los resultados del test muestran que la
aflatoxina B1 es un potente mutágeno que produce cambios de pares de bases, pero no
desplazamientos del marco. [De J. McCann y B. N. Ames, en W. G. Flamm y M. A.
Mehlman, eds. Advances in Modern Technology, vol. 5. Copyright de Hemisphere Publish
Corporation, Washington, D.C.]
FIGURA 15-22 Un fotodímero se puede revertir por reparación directa
La enzima CPD fotoliasa escinde el fotodímero de ciclobutano-pirimidina para reparar esta
mutación.
FIGURA 15-23 Un daño menor de bases se detecta y repara mediante la reparación
por escisión de base.
En la reparación por escisión de bases, las bases dañadas se eliminan y reparan mediante la
acción
secuencial
de
la
DNA
glucosidasa,
la
endonucleasa
AP,
la
desoxirribofosfodiesterasa (dRpase), la DNA polimerasa y ligasa.
FIGURA 15-24 La 5-metilcitosina es un punto caliente para las mutaciones
Puntos calientes de 5-metilcitosina en E. coli. Se indican las mutaciones sin sentido que se
registraron en 15 sitios diferentes de lacI. Todas son resultado de una transición GC –> AT.
Los asteriscos (*) señalan las posiciones de los residuos de 5-metilcitosina y las barras
blancas representan los sitios en los que la transición se suele dar, pero no se aislaron en
81
este grupo. [De C. Coulondre, J. H. Miller, P. J. Farabaugh, y W. Gilbert, “Molecular Basis
of Base Sustitution Hotspots in Escherichia coli” Nature 274, 1978, 775.]
FIGURA 15-25 Las dos rutas de reparación por escisión de nucleótidos
La ruta de reparación por escisión de nucleótidos se activa cuando se reconocen aductos
voluminosos o múltiples bases dañadas en regiones del genoma que no se transcriben
(GGR) o que se transcriben (TC-NER). Un complejo multiproteico escinde varias bases y
las resintetiza empleando la cadena opuesta como molde. Véase el texto para los detalles.
FIGURA 15-26 La reparación de emparejamientos erróneos corrige los errores
replicativos
Modelo de reparación de emparejamientos erróneos en E. coli. El DNA se metila (Me) en
el residuo A de la secuencia GATC. La replicación de DNA da un dúplice hemimetilado
que se mantiene hasta que la metilasa pueda modificar la cadena recién sintetizada. La
reparación de emparejamientos erróneos realiza cualquier corrección necesaria basándose
en la secuencia de la cadena metilada (el molde original). MutS, MutH y MutL son
proteínas.
FIGURA 15-27 La síntesis por translesión sobrepasa las lesiones en la horquilla de
replicación detenida.
Un modelo para la síntesis translesión en E. coli. En el transcurso de la replicación, la DNA
polimerasa III se reemplaza temporalmente por un polimerasa de bypass (polV) que
continua replicando más allá de la lesión. Las polimerasas de bypass son propensas a error.
[Adaptado de E. C. Friedberg, A. R. Lehmann y R. P. Fuchs, “Trading Place: How Do
82
DNA Polymerases Switch During Translesion DNA Synthesis?” Molec Cell 18, 2005,499505.]
FIGURA 15-28 El intercambio entre polimerasas requiere la adición de un monómero
de ubiquitina
La adición de un único monómero de ubiquitina a la abrazadera deslizante (PCNA) permite
a la polimerasa de bypass unirse al PCNA y replicar.
FIGURA 15-29 El mecanismo de unión de extremos no homólogos propenso a error
repara roturas de doble cadena
Mecanismo de unión de extremos no homólogos (NHEJ). Este mecanismo es propenso a
error. Véase el texto para los detalles.
FIGURA 15-30 Reparación libre de error de roturas de doble cadena por SDSA
El mecanismo libre de error del templado de cadena dependiente de la síntesis (SDSA)
repara las roturas de doble cadena en células en división.
FIGURA 15-31 Entrecruzamiento durante la meiosis
El intercambio de los brazos cromosómicos entre cromátidas no hermanas da lugar a un
quiasma en el lugar del entrecruzamiento. Los círculos representan los centrómeros unidos
a las fibras del huso. [Adaptado de Matthew J. Neale y Scott Keeney, Nature 442, 2006,
153-158]
FIGURA 15-32 Las roturas de doble cadena inician la recombinación meiótica
83
La recombinación meiótica se inicia cuando la enzima SpoII realiza roturas escalonadas en
ambas cadenas de una cromátida.
FIGURA 15-33 Una segregación aberrante es el resultado de la conversión génica
Segregación aberrante en Neuroespora. (a) Normalmente, un meiocito A/a entra en meiosis,
después en mitosis dando como resultado una segregación 4:4 de los productos A y a. (b)
La conversión génica produce a veces una segregación aberrante.
FIGURA 15-34 Modelo de decisión temprana de entrecruzamiento
Según el modelo de decisión temprana de entrecruzamiento, los no entrecruzados y los
entrecruzados surgen por dos rutas distintas. [Adaptado de la Figura 2 en Mathew J. Neale
y Scott Keeney, Nature 442, 2006, 153-158.]
FIGURA 15-35 Células normales y células transformadas por un oncogén
Microfotografias de barrido de (a) células normales y (b) células transformadas con el virus
del sarcoma de Rous, un virus que infecta las células del oncogén scr. (a) Una línea celular
normal denominada 3T3. Puede verse cómo las células forman una estructura organizada
en monocapa. (b) Una línea transformada derivada de 3T3. Nótese que las células adoptan
una morfología más redondeada y se apilan unas sobre otras. [Courtesy of L.-B.Chen.]
FIGURA 15-36 El oncogén ras está continuamente activado
Formación y efecto de la oncoproteína Ras. (a) El oncogén ras difiere del gen salvaje en un
solo par de bases en el codón número 12 de la secuencia de lectura abierta, y da lugar a una
oncoproteína Ras, que difiere de la proteína normal en un aminoácido. (b) la oncoproteína
84
Ras no puede hidrolizar GTP a GDP. Debido a este defecto, la oncoproteína Ras permanece
en el complejo activo Ras-GTP y activa continuamente la señal de proliferación.
TABLAS
Tabla 15-1 Funciones de la proteína salvaje y propiedades de las mutaciones
inductoras de tumores en los genes correspondientes
Función de la proteína salvaje
Propiedades de las mutaciones inductoras de tumores
Inducen la progresión del ciclo celular
Oncogén (ganancia de función)
Inhiben la progresión del ciclo celular
Mutación del supresor de tumores (pérdida de función)
Inducen apoptosis
Mutación del supresor de tumores (pérdida de función)
Inhiben apoptosis
Oncogén (ganancia de función)
Inducen la reparación del DNA
Mutación del supresor de tumores (pérdida de función)
PARCHEADOS
85
Figura 15-2 Consecuencias intragénicas de la mutación puntual
1. Tipos de mutaciones en el nivel del DNA
2. Sin mutación
3. Transición o transversión
4. Indel
5. Inserción de base
6. Deleción de base
7. Resultados en el nivel molecular
8. Tipo salvaje
9. Los codones determinan la proteína tipo salvaje
10. Mutación sinónima
11. El codón alterado determina el mismo aminoácido
12. Mutación de cambio de sentido (conservadora)
13. El codón alterado determina un aminoácido químicamente similar.
14. Mutación de cambio de sentido (no conservadora)
15. El codón alterado determina un aminoácido químicamente distinto.
16. Mutación sin sentido
17. El codón alterado indica la terminación de la cadena
18. Mutación de desplazamiento del marco
19. Mutación de desplazamiento del marco
Figura 15-3
Exón
86
Intrón
1. Nuevo sitio 5’ de corte y empalme
2. Eliminación del sitio 5’ de corte y empalme, el intrón se retiene
Figura 15-4
1. Alelo salvaje
2. Mutación de cambio de sentido (p. ej., GC-->AT)
3. Mutación sin sentido (p. ej., CAA-->TAA)
4. Mutación de desplazamiento del marco (p. ej., +A)
5. Mutación en la región reguladora
6. mRNA
7. Proteína
8. = Sitio mutante
9. N = Transferencia de Northern (RNA)
10. W= Transferencia de Western (proteína)
11. Migración imprevisible
12. No hay mRNA
13. No hay proteínas
Figura 15-5
1. Cambio fisiológico inducido por fago
2. Cultivo 1
3. Cultivo 2
4. Cultivo 3
87
5. Cultivo 4
6. Mutación al azar
7. Cultivo 1
8. Cultivo 2
9. Cultivo 3
10. Cultivo 4
Figura 15-6
1. Superficie de terciopelo (esterilizada)
2. Mango
3. Presión sobre la placa matriz de colonias crecidas
4. Presión sobre la placa replicada que permite distinguir los genotipos salvaje y
mutante.
Figura 15-7
1. Placa matriz con 107 colonias de E. coli Tons (sensible a T1)
2. Réplica en placa
3. Placa 1
4. Placa 2
5. Placa 3
6. Réplicas en placas que contienen una elevada concentración de fagos T1 y cuatro
colonias Tonr
Figura 15-8
88
1. (a) Emparejamiento entre las bases normales
2. Citosina
3. Guanina
4. Timina
5. Adenina
6. (b) Bases incorrectamente emparejadas
7. Forma imino rara de la citosina (C*)
8. Adenina
9. Forma enol rara de la timina (T*)
10. Guanina
11. Citosina
12. Forma imino rara de la adenina (A*)
13. Timina
14. Forma enol rara de la guanina (G*)
Figura 15-9
1. (a) DNA parental
2. (b)
3. (c) Progenie de la primera generación
4. (d) Progenie de la segunda generación
5. Replicación de DNA
6. Replicación de DNA
7. Tipo salvaje
8. Mutante
9. Tipo salvaje
89
10. Tipo salvaje
11. Forma tautomérica enol rara de la guanina
Figura 15-10
1. Mecanismo molecular de la mutación
2. Adición
3. Dirección de la síntesis de DNA
4. La cadena recién sintetizada se desliza
La base extra forma un bucle
5. El bucle se estabiliza por las secuencias repetitivas
6. Siguiente ronda de replicación
7. Se añade un par de bases A · T
8. Deleción
9. Dirección de la síntesis de DNA
10. La cadena molde se desliza
La base extra forma un bucle
11. El lazo se estabiliza por las secuencias repetitivas
12. Siguiente ronda de replicación
13. Se delecionan los pares de bases G·C y A·T
Guanina
Guanina
Figura 15-11
90
Citosina →Desaminación→ Uracilo
1. Glicol de timidina
2. 8-Oxo-7-hidrodesoxiguanosina (8-oxodG)
Figura 15-12
1. Gen FMR-1
2. Fenotipo
3. Transmisión
4. Metilación
5. Transcripción
6. Normal
7. Estable
8. No
9. Sí
10. Mayoritariamente normal
11. Inestable, propenso a la expansión
12. No
13. Sí
14. Afectado
15. Inestable
16. Sí
17. No
18. Normal
19. Premutación
91
20. Mutación completa
Figura 15-13
1. Cadena molde
2. Repeticiones de trinucleótido
3. Cadena hija
4. Emparejamiento erróneo por deslizamiento
5. Esta parte del molde se repite dos veces en la cadena hija
Figura 15-14
1. Forma ceto normal del 5-BU
2. Adenina
3. Forma ionizada del 5-BU
4. Guanina
FIGURA 15-15
1. 2-AP
2. Timina
3. 2-AP protonada
4. Citosina
EMS
NG
FIGURA 15-16
92
1. Guanina
2. EMS
3. O-6-Etilguanina
4. Timina
5. Timina
6. EMS
7. O-4-Etiltimina
8. Guanina
FIGURA 15-17
1. Proflavina
2. Naranja de acridina
3. ICR-191
4. Bases nitrogenadas
5. Molécula intercalada
FIGURA 15-18
1. (a) Dímero de ciclobutano-pirimidina
2. Anillo ciclobutilo
3. (b) Fotoproducto 6-4
FIGURA 15-19
1. Guanina
2. Aflatoxina B1
93
3. Esqueleto de DNA
FIGURA 15-20
1. Disgregación del hígado y centrifugación
2. Enzimas del hígado
3. S9
4. S9
5. S9
6. Cepa
7. Cepa
8. Cepa 1 o cepa 2 (Control)
9. Mezclar y sembrar
10. His-→His+ Test de reversión
11. His-→His+ Test de reversión
FIGURA 15-21
1. Colonias revertientes por placa
2. Dosis de aflatoxina B1 (ng)
3. TA100
4. Aflatoxina B1
5. TA1538
6. TA1535
FIGURA 15-22
94
1. Fotodímeros inducidos por luz ultravioleta
2. Luz >300 nm
3. Fotoliasa CPP
4. Sin mutación
5. Luz ultravioleta
6. Fotodímero
FIGURA 15-23
1. La glucosilasa de DNA rompe el enlace base-azúcar
2. Sitio AP
3. La endonucleasa AP realiza un corte
4. dRpase elimina un tramo de DNA
5. La polimerasa sintetiza nuevo DNA
6. La ligasa sella la mella
FIGURA 15-24
5-metilcitosina → Desaminación → Timina
1. Número de sucesos
2. Posición
FIGURA 15-25
1. Reparación genómica global (GGR)
2. Reconocimiento de la base dañada
95
3. TFIIH
4. Ensamblaje del complejo multiproteico y desenrollamiento
5. Incisión en el DNA dañado
6. 15 – 24 nucleótidos de la lesión
7. 2 – 8 nucleótidos de la lesión
8. Síntesis y ligación del nuevo DNA
9. Abrazadera deslizante (PCNA)
10. Polimerasa de bypass
11. Ligasa I
12. NER acoplada a la transcripción
13. Polimerasa de RNA
14. Reconocimiento del complejo de transcripción detenido
15. TFIIH
16. Polimerasa de RNA, CSA y CSB
FIGURA 15-26
1. MutS reconoce la base erróneamente emparejada
2. MutH reconoce las cadenas parentales metiladas y mella la cadena hija
3. La nueva cadena se escinde y es remplazada entre la mella y el par de bases mal
emparejados
FIGURA 15-27
1. Pol III
96
2. DNA dañado
3. La Pol III se detiene en el sitio dañado
4. RecA
5. La polimerasa de bypass reemplaza a la pol III
6. Pol IV
7. La polimerasa de bypass continúa la síntesis de DNA
8. La polimerasa de bypass se desengancha
9. Pol V
10. Pol III
11. Pol III continua la síntesis
FIGURA 15-28
1. PCNA
2. Pol III
3. Rad6, Rad18
4. PCNA
5. Pol translesión
FIGURA 15-29
1. Rotura de doble cadena
2. KU80 y KU70
3. Unión de extremos por el complejo proteico
4. Recorte de los extremos
5. XRCC4; DNA ligasa IV
Unión de extremos (ligación)
97
FIGURA 15-30
1. Recorte de extremos
2. Invasión de cadena
3. Lazo D
4. Síntesis de nuevo DNA
5. La cadena molde se desenrolla y templado
6. Ligación
FIGURA 15-31
1. Cromátidas hermanas
2. Cromátidas hermanas
3. Quiasma
4. Cromátidas no hermanas
FIGURA 15-32
1. Corte asimétrico
2. SpoII
3. Recorte de los extremos
4. Rad51 y Dmc1 los cubren
5. Invasión de cadena
FIGURA 15-33
1. (a) Producción de una segregación normal
98
2. Meiocito después de la duplicación de las crómatidas
3. Primera división meiótica
4. Segunda división meiótica
5. Mitosis
6. Patrón 4:4
7. Tétrada
8. Octada
9. (b) Segregaciones aberrantes
10. Segregaciones aberrantes
11. Saco
12. Par de esporas 1
13. Par de esporas 2
14. Par de esporas 3
15. Par de esporas 4
DNA heterodúplice
Mitosis
Restauración
Conversión
FIGURA 15-34
1. Formación de una rotura de doble cadena
2. SpoII
3. Recorte de los extremos
99
4. Invasión de cadena
5. Síntesis y captura del segundo extremo
6. Síntesis
7. Resolución de la estructura de Holliday mediante el corte del mismo sentido
8. Resolución de la estructura de Holliday mediante el corte de sentido opuesto
9. Sintesis y templado de cadena
10. No hay entrecruzamiento
11. Entrecruzamiento
12. No hay entrecruzamiento
FIGURA 15-36
1. DNA ras tipo salvaje
2. DNA del oncogén ras
3. Aminoácido 10
4. Aminoácido 15
5. Ras inactiva
6. La interacción con SOS promueve el intercambio de GTP-GDP
7. Ras activa
8. Activa continuamente la señal de proliferación
9. La oncoproteína Ras queda bloqueada. La señal continúa emitiendo.
100