INDUCCI N DE ANTICUERPOS ANTI-U1 RNP EN UN MODELO EXPERIMENTAL MURINO

ARTICULO ORIGINAL
INDUCCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-U1 RNP EN UN MODELO
EXPERIMENTAL MURINO
Valdez J C, Fiad N, Núñez J, Oquilla J, Ajmat C,
Haro MI, Valverde M.
RESUMEN
Los anticuerpos Anti-snRNP (anti-small nuclear ribonucleoprotein) se encuentran en el suero de
pacientes con una variedad de enfermedades reumáticas sistémicas, en particular en la Enfermedad
Mixta de Tejido Conectivo (EMTC). Objetivo: reproducir la EMTC en ratones BALB/C para determinar los
antígenos y anticuerpos implicados en el daño orgánico de esta enfermedad. Metodología: se realizó la
purificación del antígeno snRNP mediante el método de Blobel y Potter a partir de hepatocitos de rata.
Ratones BALB/C de ambos sexos (n=26) fueron inoculados con 100 µg de snRNP purificado en 0,1ml de
adyuvante de Freund completo la primera dosis e incompleto las restantes, por vía intraperitoneal (n=9) y
por vía subcutánea (n=9), en cuatro dosis cada quince días. El grupo control (n=8) fue inoculado sólo con
adyuvante. Los autoanticuerpos anti-snRNP fueron detectados por ELISA y los autoanticuerpos antinúcleo por inmunofluorescencia indirecta. Se realizó análisis descriptivo de los datos y de comparación
mediante Test de Friedman y Test exacto de Fisher. Resultados: Se obtuvo un valor promedio de
proteína = 0.161±0.027 mg/ml correspondiente a un patrón de peso molecular similar a la fracción U1
snRNP (entre 45 y 55 Kd). La detección de autoanticuerpos por ELISA mostró tres grupos de valores (DO
490 nm): títulos altos (0,600 a 0,850) el 39%, títulos intermedios (0,500 a 0,590) el 39% y títulos bajos
(0,300 a 0,450) el 22% de los sueros. Los sueros con títulos altos y bajos por ELISA mostraron diferencias
significativas en las lecturas a diluciones 1:500 y 1:100 (Test de Friedman p: 0,0066). La positividad de la
inmunofluorescencia fue del 67% encontrándose patrones anular, moteado y homogéneo. Todos los
sueros con títulos altos de anti-snRNP por ELISA resultaron positivos por Inmunofluorescencia Indirecta
(IFI). Este modelo podría considerarse óptimo para el estudio de la serología de EMTC. Los hallazgos
deberán cotejarse con estudios histopatológicos.
Palabras claves: anticuerpos anti-snRNP, Enfermedad Mixta del Tejido Conectivo.
INTRODUCCIÓN
La coexistencia de dos o más enfermedades
del tejido conectivo (ETC) en un mismo paciente es
algo frecuente (aproximadamente el 25% de los
casos con ETC) y conocido desde hace tiempo
(14). Sin embargo existe controversia acerca de si
estos síndromes de solapamiento representan
manifestaciones distintas de un proceso poco
diferenciado con capacidad evolutiva
pluripotencial, o simplemente, la ocasional
concurrencia de dos o más enfermedades de este
tipo (15-16).
En un intento por unificar criterios clínicos y
pronósticos para estos pacientes, Sharp en 1972
(17) define la Enfermedad Mixta del Tejido
Conectivo (EMTC). Desde el punto de vista clínico,
se trata de de un cuadro polimorfo, constituido por
la conjunción de signos y síntomas propios del
lupus eritematoso sistémico (LES), la
esclerodermia (ES), la dermatomiositis (DM) y/o la
polimiositis (PM). La presencia de una serie de
signos guía (fenómeno de Raynaud, artritis,
edema de manos, dismotilidad esofágica, miositis)
permite establecer las líneas generales de un perfil
clínico. Las distintas manifestaciones pueden
aparecer simultáneamente o de forma secuencial
en el curso de la enfermedad, y se han descripto
Cátedra de Histología. Fac. Medicina UNT. Av. Roca 1900 (4000)
S.M.de Tucumán. E-mail : [email protected] (JC Valdez).
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también cuadros transicionales.
Serológicamente se caracteriza por títulos muy
altos de anticuerpos antinucleares (ANA) con
patrón moteado nuclear (27), ausencia de
anticuerpos anti-DNAds, hipergamaglobulinemia
(21-28) y factor reumatoideo (29). Los casos de
hipertensión pulmonar se han asociado con
anticuerpos anti-cardiolipina (24). La característica
inmunoserológica definitoria es, según Sharp, la
presencia de títulos altos de anti-U1RNP,
anticuerpos dirigidos contra ribonucleoproteínas
compuestas por RNA pequeño del complejo RNA,
rico en uridina y sensibles a ribonucleasas (27). Se
han descrito anticuerpos tanto para la parte
proteica del complejo U1RNP como contra la
fracción de RNA, habiéndose correlacionado los
títulos de estos últimos con la actividad de la
enfermedad (24-27). Para establecer el
diagnóstico, los anticuerpos anti-Sm (contra
fracciones ENA) deben ser negativos (28-29-30).
Se han propuesto otras técnicas para el
diagnóstico de EMTC. La inmunofluorescencia
directa (IFD) detecta depósitos granulares de Ig M
en la unión dermo-epidérmica, así como la Ig G, Ig
A e Ig M en la pared vascular de la piel sana no
expuesta de la mayoría de estos enfermos, lo que
se ha sugerido como un dato relevante para el
diagnóstico diferencial entre EMTC y ES (33-34).
Es sabido que los anticuerpos anti-U1RNP
pueden acceder a los antígenos celulares
3
intranucleares, lo que constituye una excepción
entre los autoanticuerpos que se conocen (27-29).
Si bien se desconoce el rol patogénico que pueda
tener este hecho como desencadenante de EMTC,
está bien establecido la participación esencial de
snRNPs en la maduración y empalme (splicing) del
pre-mRNA (38). Existe una alta frecuencia de HLADR4 y HLA-DR3 en adultos y niños con EMTC
(32-39). Estos hallazgos pueden apoyar, desde le
punto de vista genético, la singularidad de la
EMTC.
No obstante, por ahora sigue habiendo grupos
que niegan su existencia (15-16), mientras que
otros siguen alineados en la postura de la EMTC
como entidad clínica diferenciada y continúan
trabajando en la explicación de sus mecanismos
fisiopatológicos (25-29).
La EMTC puede producir trastornos
invalidantes si no se diagnostica y trata
oportunamente.
El objetivo del presente trabajo es reproducir la
Enfermedad Mixta de Tejido Conectivo en ratones
BALB/C para determinar los antígenos y
anticuerpos implicados en el daño orgánico de
esta enfermedad.
MATERIAL Y MÉTODOS
Purificación del antígeno: Se realizó la
purificación de ribonucleoproteína (snRNP)
empleando el método de Blobel y Potter. Se utilizó
núcleos de hepatocitos de rata aislados por
centrifugación (30 min a 39.000 rpm a 4 ºC) de los
cuales se separaron la ribonucleoproteína por
ultracentrifugación y fraccionamiento en sulfato de
amonio (30% y 60%). Se sonicó para romper la
membrana nuclear y se centrifugó a 12.000g (4000
rpm) 15 min.
Se ultracentrifugó el sobrenadante a 120.000 g
(39.000 rpm) por 90 min (en el pellet esta la nRNP).
Se retomó el pellet con 10mM Tris/ HCl pH 8
/0.5mM PMSF y separó la nRNP por precipitación
de 2 partes de ésta con 1 parte de sulfato de
amonio (solución saturada) (30%). Luego se
centrifugó a 10.000 g (4.000 rpm) por 15 min.
Se tomó el pellet con buffer10mM Tris/ HCl pH 8
/0.5mM PMSF y 1 parte de esto se mezcló con 1,5
partes de solución saturada de sulfato de amonio
(60%). Finalmente se centrifugó a 10.000g (4.000
rpm).
La verificación de la pureza del antígeno se
realizó por electroforesis en gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE). Se determinó la cantidad obtenida
por el método de Bradford (Bio Rad).
Inoculación en ratones: Se emplearon
ratones BALB/C endocriados de ambos sexos
(n=26) los cuales fueron inoculados con 100 µg de
snRNP purificado en 0,1ml de adyuvante de
Freund completo la primera dosis e incompleto las
restantes, según dos esquemas de inmunización:
9 ratones fueron inoculados por vía intraperitoneal
4
y 9 por vía subcutánea, en cuatro dosis cada
quince días. Por otra parte, 8 ratones inoculados
sólo con adyuvante fueron utilizados como grupo
control. Al tercer mes fueron sacrificados. El suero
fue conservado a -20°C hasta su utilización y los
órganos fueron procesados para el análisis
histológico.
Detección de autoanticuerpos: Los
autoanticuerpos anti-snRNP fueron detectados
por el método de ELISA. Para ello placas NUNC
MAXISORP fueron sensibilizadas con snRNP
purificada (1 µg/100µl por pocillo) y enfrentadas
con diferentes diluciones del suero (1:500, 1:1000,
1:5000 y 1:10000). Se determinó la especificidad
del antígeno probando su reacción frente a sueros
de pacientes con EMTC y sueros humanos
negativos para EMTC conocidos, gentilmente
donados por el Laboratorio de Inmunología del
Hospital de Pediatria Gutiérrez (Bs As). Los títulos
de los sueros de ratón se compararon con títulos
de éstos sueros. Con este análisis se determinó
además la especificidad del antígeno para
reaccionar con anticuerpos anti-snRNP. Como
control negativo se utilizaron los sueros de los
ratones inoculados sólo con adyuvante de Freund.
Para revelar la reacción se utilizó anticuerpos antiinmunoglobulina homólogos (anti-ratón o antihumano) conjugados con peroxidasa (Zymed), y
OPDA (Sigma)-H 2 O 2 como sustrato. La
absorbancia se midió a una DO de 490 nm.
Los autoanticuerpos anti-núcleo fueron
detectados por inmunofluorescencia indirecta. Los
sueros diluidos 1:2 y 1:80 fueron dispensados
sobre improntas de células Hep-2
(BIOCIENTFICA) y revelados por una anti-IgG de
ratón marcada con FITC (SIGMA) y observados
por microscopía de fluorescencia registrándose
los diferentes patrones de tinción nuclear.
Análisis estadístico: se realizó un análisis
descriptivo de los datos y de comparación
aplicando los siguientes test: Test de Friedman y
Test exacto de Fisher
RESULTADOS
Se obtuvo un valor promedio de proteína=
0.161±0.027 mg/ml que en la electroforesis (SDSPAGE) mostró un patrón de peso molecular similar
a la fracción conocida como U1 snRNP (30 Kd).
GRAFICO Nº 1.
Además este antígeno purificado reacciona
con alta especificidad con los sueros de pacientes
con EMTC, lo que confirma su naturaleza.
La detección de autoanticuerpos por ELISA en
los sueros de ratones mostró tres grupos de
valores de anti-snRNP (DO 490 nm): títulos altos
(0,600 a 0,850) el 39%, títulos intermedios (0,500
a 0,590) el 39% y títulos bajos (0,300 a 0,450) el
22% de los sueros. GRAFICO Nº 2.
Los sueros con títulos altos y bajos por ELISA
muestran diferencias significativas en las lecturas
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a diluciones 1:500 y 1:1000 (Test Friedman p=
0,0066) en consecuencia, se elegiría como óptima
para futuras aplicaciones la dilución 1:500. Los
sueros con títulos intermedios no muestran
diferencias significativas en las lecturas de las
diluciones 1:500, 1:1000 y 1:5000 (Test Friedman
p= 0,204). GRAFICO Nº 2.
La positividad de la inmunofluorescencia fue
del 67% con patrones de imágenes repartidos de la
siguiente manera: homogéneo 50 %, moteado 20
%, homogéneo + anular 20% y homogéneo +
moteado 10%. Todos los sueros con títulos altos
por ELISA resultaron positivos por
inmunofluorescencia indirecta. También se
observó positividad en el 89% de las hembras y en
el 33% de los machos, siendo estas proporciones
significativamente diferentes (test exacto de
Fisher, p = 0,013). No hubo diferencias en los
parámetros investigados según la vía de
inoculación (subcutánea o intraperitoneal).
GRÁFICO Nº 1: Electroforesis (SDS- PAGE).
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA (DS-PAGE) Gel
stacking = 4.5% Gel separador = 9%.
GRÁFICO Nº 2: Títulos de Anticuerpos Anti-snRNP obtenidos por ELISA en sueros de ratones.
0,900
0,800
0,773
0,700
DO 490nm
0,600
0,693
0,619
0,57
0,558
0,545
0,500
0,400
0,423
0,4
0,317
0,300
0,299
0,31
0,28
0,200
0,100
Sueros
Negativos
Sueros
Intermedios
Sueros
Positivos
Control
Negativo
0,000
1:500
1:1000
1:5000
DILUCIONES
DISCUSIÓN
La positividad anti-snRNP de los sueros de
pacientes con EMTC y la negatividad de los que no
padecen la enfermedad revela que la pureza del
antígeno obtenido en nuestro laboratorio es
compatible con el utilizado por los kits de ELISA
comerciales. Esto posibilitaría la elaboración de un
kit artesanal cuyo costo es muy inferior al
comercial, con lo que se permitiría una
investigación de la enfermedad en nuestro medio y
en centros asistenciales con bajos recursos.
La positividad de los anticuerpos antinucleares
fue mayor en las hembras que en los machos. Ésta
es una característica general de la mayoría de las
colagenopatías y en este caso particular de la
EMTC.
Los títulos de los sueros de ratones inoculados
con el antígeno snRNP obtenido son similares a
los de los pacientes con EMTC tanto en el caso de
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positivos como en los negativos.
Esta concordancia indica que este modelo en
ratón podría considerarse óptimo para el estudio
de la serología de EMTC. Los hallazgos deberán
cotejarse con estudios histopatológicos.
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