An lisis de serotipos de rotavirus humanos prevalentes en Tucum n

Rotavirus prevalentes en Tucumán
ANALISIS DE SEROTIPOS DE ROTAVIRUS
HUMANOS PREVALENTES EN TUCUMAN
Komaid, José Alberto
RESUMEN
Se tipificaron el 85,8 % de 225 cepas de
rotavirus aisladas de niños con gastroenteritis internados en el Hospital de Niños de Tucumán (Argentina) entre Dic. 96 y Nov. 98. Todas las cepas
fueron diagnosticadas por ELISA comercial y por
PAGE presentaban un electroferotipo perteneciente al grupo A de rotavirus. Mediante RT-PCR se
determinaron las siguientes asociaciones genéticas
de las proteínas G,P y su frecuencia: G1P6 (4,9
%), G1P8 (20,5 %), G1P4 (0,9 %), G2P4 (43,6
%), G4P4 ((0,9 %), G4P8 (14,3 %) y un 14,3 % no
pudieron ser identificadas. Se destaca la ausencia
de aislamientos con G3 ya informada en estudios
anteriores. Las asociaciones G1P4 y G4P4 se describen como poco frecuentes debido a que P4 se
asociada frecuentemente a G2. Se encontró la
cepa G1P6 causando diarrea sintomática, otros
autores relacionan las asociaciones de P6 a diarrea neonatal asintomática.
INTRODUCCION
Los rotavirus humanos (RVH) son la principal
causa de diarrea aguda en niños de todo el mundo
y una importante causa de muerte por deshidratación crítica en los países en desarrollo. La importancia de los RVH como causantes de muerte por
deshidratación severa concitó el interés por precisar e identificar los antígenos involucrados en la
inmunidad natural y su posible variabilidad.
Los rotavirus son miembros de la familia
Reoviridae, tienen once segmentos genómicos de
ARN bicatenario envueltos un una cápside compuesta por tres capas de proteína en la que se
destacan dos proteínas por sus características
antigénicas, VP7 y VP4 que se encuentran
involucradas en la neutralización del virus posterior a una infección natural jugando así un importante papel en el desarrollo de la inmunidad protectora.. Para referirse a las especificidades
antigénicas de las proteínas VP7 y VP4 se convino en denominar G a la primera por ser una
* Cátedra de Virología, Instituto de Microbiología. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Universidad Nacional de Tucumán.
E-mail: [email protected]
*
glicoproteína y P a la segunda por su sensibilidad
a la acción de las proteasas. Cada una de estas
proteínas presenta varios tipos antigénicos y sus
asociaciones definen cepas virales cuyo estudio
es relevante tanto para conocer la epidemiología
como en el momento de formular una vacuna.
Los párrafos siguientes darán, en apretada síntesis, un pantallazo de la nomenclatura de las cepas de RVH basada en la diversidad antigénica.
Al menos siete serotipos de RVH han sido
descriptos basados en estudios de neutralización
cruzada con sueros hiperinmunes conteniendo
anticuerpos neutralizantes tanto para G como para
P (2,3). Experimentos genéticos y moleculares y
con anticuerpos monoclonales neutralizantes
serotipo-específicos identificaron a G como la principal proteína de neutralización tipo-específica (2).
La disponibilidad de anticuerpos monoclonales capaces de unirse específicamente a G trajo el desarrollo de inmunoensayos para el serotipeado rápido de RVH en muestras de heces (4). Como resultado, se definió perfectamente la diversidad
antigénica de G en RVH. Estos métodos se usaron
para vigilancia epidemiológica de los RVH circulantes y demostraron que los serotipos del 1 al 4
son los mas difundidos, mientras que el serotipo 8
y 9 y el recientemente descripto 12, aún no se
estudiaron tan extensivamente (2,3,5).
La diversidad antigénica del antígeno de neutralización P no ha sido claramente definida. La
observación que los rotavirus pueden poseer especificidad de serotipo dual y que la segunda especificidad reside en P sugiere que una completa
identificación antigénica debe incluir tanto a G como
a P (6,7).
Mediante secuenciación comparativa de
nucleótidos, se identificaron cinco tipos de genes
4 distintos en cepas de RVH sobre las bases de
secuencia y conservación predecible de
aminoácidos en cepas que poseen el mismo tipo y
una gran diversidad en cepas con tipo diferente
(9). Las cepas que poseen uno u otro tipo de gene
4 han sido designadas como pertenecientes al grupo genético 1 al 5 (9) o grupos antigénicos P8,
P4, P6, P9 y P10. P tipo 1 o P8 está presente en
cepas sintomáticas con G serotipos 1, 3, 4 y 9; P
tipo 2 o P4 está presente en miembros de G serotipo
2; P tipo 3 o P6 está presente en cepas con serotipo
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Rotavirus prevalentes en Tucumán
de G 1,2,3 y 4 (solo ha sido aislada de neonatos
excretando RVH asintomáticamente); P tipo 4 o
P9 está presente en G serotipo 1 cepa K8 y P tipo
5 o P10 está presente en G serotipo 8 cepa 69M
(10). Recientemente se ha presentado evidencia
experimental que los miembros de los grupos
genéticos de VP4 1 al 4 pueden ser divididos en
tres grupos antigénicos, tentativamente llamados
serotipos y un subtipo. La evidencia fue obtenida
sobre las bases de pruebas de neutralización cruzada con antisueros para polipéptidos de P expresados en baculovirus de las cepas prototipos KU
(grupo1), DS1 (grupo 2), 1076 (grupo 3) y K8 (grupo 4) (11). Además, todos los miembros del mismo
grupo genético caen dentro del mismo grupo
antigénico. Tomados juntos, estos resultados sugieren que métodos para identificar grupos
genéticos de P a nivel de ácido nucleico pueden
ser válidos para asegurar la diversidad del gene 4
en cepas circulantes de RVH.
Las infecciones por RVH presentan picos
estacionales de incidencia siendo su máximo en
invierno y las cepas predominantes varían de un
año a otro tanto como de un lugar geográfico a
otro. Esta variabilidad justifica establecer patrones
de comportamiento regionales de las cepas virales
para predecir el comportamiento de una vacuna
según su composición antigénica.
Una particularidad que se acentúa con los estudios es la regionalidad de las cepas aisladas, lo
que hace importante la caracterización de las variantes que se presentan en cada brote estacional.
OBJETIVOS
Con el objeto de determinar grupo antigénico y
combinaciones de los antígenos G y P de las cepas de RVH involucradas en las diarreas
sintomáticas de niños con deshidratación crítica,
así como establecer la prevalencia y variación
estacional, datos estos que contribuirán al conocimiento del comportamiento de esta patología con
características regionales. Se propuso el estudio
de las cepas virales de RVH causantes de 225 casos de diarrea sintomática en niños internados por
deshidratación crítica en Tucumán en un período
de 2 años.
de la Facultad de Bioquímica de la Universidad Nacional de Tucumán.
Diagnóstico de RVH: Para el diagnóstico se
utilizó un método ELISA comercial (Rotazyme
Abbott) el cual está basado en la antigenicidad de
la proteína VP7 de la capside viral detectada por
un anticuerpo monoclonal específico fijado a una
fase sólida y en una segunta etapa se enfrenta a
un anticuerpo conjugado con una enzima que en
una tercera etapa será revelada con el sustrato
apropiado. Para su aplicación se siguieron las
especificaciones del fabricante.
Electroforesis del genoma viral: Fue realizado a
partir de las muestras fecales diluidas al 20 % en
buffer de Laemli y desproteinizadas en fenol
cloroformo 1:1, centrifugadas a 2000 g por 5
minutos y el sobrenadante se mezcló con igual
volúmen de sacarosa al 50 % usando azul de
bromofenol como colorante del frente de corrida.
Se efectuó electroforesis del genoma en gel de
poliacrilamida según la técnica descripta por Herring (13). Los patrones electroforéticos fueron
revelados con sales de plata (17 pg. 61-63) .
Genotipificación de G y P: El antígeno G fue
genotipeado mediante la técnica de RT-PCR
descripta por Gentsch y col. (12) en que el ARN
viral fue materia de reacción de polimerasa en
cadena con transcriptasa reversa semianidada con
primers 9con1 y 9con2 seguido de 30 ciclos de
PCR con una mezcla de primers 9T1-1, 9T1-2,
9T3P, 9T4 y 9T-9B (a una concentración de 20 uM
cada uno). Igual procedimiento se siguió para el
antígeno P salvo que RT y la primera amplificación
fue con con3 y la segunda amplificación con los
primers multiplex 1T-1, 2T-1, 3T-1, 4T-1, y 5T-1.
Los productos fueron resueltos en gel de agarosa
al 2% y revelados con bromuro de ethidium. El
desarrollo técnico de las genotipificaciones se
realizó en el ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” de
Buenos Aires en el marco de la Red de Vigilancia
Epidemiológica de Gastroenteritis Virales.
Debido a que aún no hay un consenso acerca
de la nomenclatura de P y que según los autores
usan nombres de serotipos o de genotipos, nosotros
convenimos en usar el sistema numérico como
sugieren Estes y Cohen (8).
MATERIALES Y METODOS
Muestras clínicas consideradas: Corresponden
a 225 muestras fecales diagnosticadas positivas
para rotavirus de 455 recolectadas entre diciembre de 1996 y noviembre de 1998 provenientes de
niños internados por diferente grado de deshidratación por gastroenteritis en la sala de hidratación
del Hospital de Niños de la ciudad de San Miguel
de Tucumán y recibidas en la Cátedra de Virología
RESULTADOS
Las muestras analizadas por electroforesis del
genoma presentaron un electroferotipo (EFT) correspondiente al grupo A de rotavirus con patrón
de corrida denominado largo según estableció
Pedley (18).
Un resumen de las asociaciones encontradas
de G y P así como la distribución mensual se muestran en la tabla 1. La denominación críptica es la
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sugerida por Estes y Cohen (8). El 85,7 % de las
muestras fueron tipificadas lo que es consistente
con lo esperado para el método utilizado. De las
muestras estudiadas, 11 presentaron la asociación G1P6; 46 G1P8; 2 G1P4; 98 G2P4; 2 G4P4;
33 G4P8 y 32 (14,3 %) no pudieron ser identificadas por presentar mas de un producto genotípico
por esta técnica. La tabla 1 también muestra el predominio de cepas en el período estudiado, se ve
así que en 1997 predominó G2P4 con un 43,6 %
de los aislamientos mientras que en 1998 predominaron G1P8 y G4P8 con 20,5 % y 14,7 % respectivamente.
DISCUSION
Se diagnosticaron positivas para rotavirus 225
muestras de 455 niños sintomáticos (49,45 %).
En estudios anteriores (14) informamos la ausencia de aislamientos con tipo G3 igual a lo encontrado en este nuevo estudio y parece ser una
particularidad de la zona, situaciones similares fueron descriptas en otros estudios en Pakistán y Vietnam (19, 20). El serotipo P6 fue relacionado a cepas neonatales asintomáticas (15) y puede verse
Mes/año
D/96
E/97
F/97
M/97
A/97
M/97
J/97
J/97
A/97
S/97
O/97
N/97
D/97
E/98
F/98
M/98
A/98
M/98
J/98
J/98
A/98
S/98
O/98
N/98
TOTALES
G1P6
6
4
G1P8
G1P4
1
1
1
1
11
1
1
2
5
4
8
3
5
12
3
46
en la tabla 1 que la cepa G1P6 aparece como causante de deshidratación por diarrea en verano en
11 oportunidades, característica esta que parece
estar mas relacionada al tipo de dieta que a la virulencia de la cepa (17). Otro aspecto particular son
las asociaciones genéticas G4P4 y G1P4 que no
son frecuentes en rotavirus humanos debido a que
P4 suele asociarse solo a G2 (10,12). La cepa
G2P4 causó un brote estacional en el período 9697 y es reemplazada por las cepas G1P8 y G4P8
en el período 97-98. Estas últimas cepas no ofrecen particularidades ya que estas asociaciones de
P4 y P8 son los aislamientos más comunes en todo
el mundo (16) sin embargo de esto puede destacarse la observación que la modificación antigénica
más constante entre brotes corresponde al antígeno
P. Un análisis de la tabla 1 sugiere que una
predominancia de virus presentando P6 es reemplazada por una predominancia de P4 y luego pasa
a predominar P8. Una última reflexión que genera
un interrogante es porqué las cepas de baja frecuencia de aparición como G1P4 y G4P4 no producen brotes epidémicos ya que teoricamente encontrarían una gran población susceptible.
G2P4
13
5
4
4
5
20
24
7
4
G4P4
G4P8
Indet.
6
4
1
1
1
3
2
1
1
4
2
1
4
3
2
1
1
1
2
98
2
2
3
2
4
3
2
8
3
2
3
1
1
3
1
2
2
33
32
Totales
25
13
4
4
5
21
26
13
5
2
9
5
3
5
1
7
6
8
14
14
6
10
16
3
225
TABLA 1. Rotavirus aislados en Tucumán: distribución mensual de las cepas y sus combinaciones antigénicas de G y P
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