MÉTODOS DE ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS

MÉTODOS DE ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS
Debido al tamaño diminuto de los microorganismos, los métodos de estudio de la microbiología son
característicos: Se necesitan:
 Instrumentos para observarlos con aumento
 Preparaciones especiales para observarlos al microscopio
 Conocimiento de sus requerimientos de vida
 Medios para cultivarlos
 Técnicas para caracterizarlos, aislarlos y conservarlos.
EL MICROSCOPIO
El microscopio es el instrumento que más se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos.
Es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño, mediante un sistema de lentes y
fuentes de iluminación se puede aumentar el tamaño original. y hacer visible un objeto microscópico.
Actualmente existen dos tipos de microscopios: el óptico y el electrónico.
 En el microscopio óptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que
modifica el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos

El microscopio electrónico
utiliza un rayo de electrones controlado por un campo magnético
EL MICROSCOPIO OPTICO
Los microscopios de este tipo generalmente alcanzan un aumento de 1000 veces del tamaño original,
aunque pueden alcanzar hasta 2000 veces, pero la resolución no es tan buena.
Las lentes de un microscopio óptico son el condensador, el objetivo y el ocular.
 El
condensador se utiliza para enfocar la luz sobre la preparación. Elevando o bajando el
condensador puede alterarse el plano del foco de luz hasta conseguir el foco preciso.
 El objetivo es el lente más cercano al objeto observado y con ella se logra el aumento primario del
objeto. Los microscopios que se usan normalmente en microbiología están equipados con tres
objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersión. Estos objetivos están montados sobre una
pieza que se llama revolver que puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el condensador.
 El ocular es el lente más cercano al observador, donde la imagen formada por el objetivo es
finalmente aumentada.
El aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular.
El microscopio compuesto es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el
microscopio construido con una sola lente, llamado microscopio simple, que se usa como lupa.
Resolución. En un microscopio, además del aumento, hay que considerar su poder resolutivo que es la
capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos. A mayor poder resolutivo, mayor
será la definición de un objeto. El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud
de onda utilizada y de una propiedad óptica de la lente conocida como apertura numérica. Como los
microscopios ópticos utilizan luz visible, la longitud de onda está fijada, por lo que la resolución de un
objeto es función de la apertura numérica; cuanto mayor sea la apertura, el objeto resuelto será más
pequeño.
0.5 l
d: poder resolutivo; l: longitud de onda; a: mitad del ángulo de la lente objetivo
d = ----------N: índice de refracción del medio
N sen a
N sen a: apertura numérica
Aceites de inmersión. El medio a través del cual pasa la luz es un factor que afecta la resolución. .
Cuando el objetivo está separado del objeto por el aire, su apertura numérica nunca será mayor de 1,0.
Para conseguir aperturas numéricas mayores, el objetivo debe estar inmerso en un líquido de mayor
índice de refracción que el aire. A estos líquidos se les denomina aceites de inmersión que utilizados con
los objetivos de inmersión elevan la apertura numérica entre 1,2 y 1,4. Aún así, con luz visible, las
partículas con un tamaño más pequeño de 0,25 µm no pueden distinguirse unas de otras.
Existen varios tipos de microscopios:
Microscopio de campo claro:
Usa como fuente luz directa una bombilla o la luz solar. Como los
microorganismos suelen ser transparentes, es difícil distinguirlos
con este tipo de microscopio , por lo que se tiñen para mejorar su
visibilidad.
Microscopio de campo oscuro:
Usa un microscopio óptico dotado con un condensador y un objetivo
especial. Con este microscopio, los microorganismos vivos sin teñir
se ven iluminados contrastando con un fondo oscuro.
Microscopio de fluorescencia:
La muestra se tiñe con una sustancia fluorescente que absorbe la
energía de las ondas cortas de la luz (azul) y emite la luz de
longitudes de ondas más largas (verde). Se utiliza una sustancia
fluorescente
que se une al microorganismo, el cual emite
fluorescencia y se puede identificar. Esta técnica se usa en clínica.
Microscopio de contraste de Es un microscopio óptico modificado mediante un condensador y un
fases:
objetivo especial que controlan la iluminación de tal manera que
permite contrastar sustancias de diferente grosor o densidad. El
resultado es una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad.
Con este método, el material denso aparece brillante, mientras que
las partes de la célula que tienen una densidad cercana al H 2O
(citoplasma) aparecen oscuras. Se utiliza para visualizar estructuras
celulares sin necesidad de usar colorantes o matar microorganismos.
Microscopio de luz polarizada
Tiene una lámina polarizadora que se ubica por debajo de la platina,
para polarizar la luz proveniente de la fuente. El microscopio
polarizante se emplea en la interpretación de textura y relaciones de
las sustancias naturales o artificiales tal como aparecen en las
secciones delgadas y para determinar algunas propiedades ópticas
de los minerales
EL MICROSCOPIO ELECTRONICO
Los microscopios electrónicos utilizan rayos de electrones en lugar de luz. La longitud de onda de los
rayos de electrones es de 0,005 - 0,0003 nm, muy corta comparada con la de la luz visible (426 - 750nm;
violeta - rojo), lo que les permite tener un poder de resolución muy elevado. Los aumentos pueden llegar
a ser de un millón de veces. Es posible con el microscopio electrónico resolver objetos separados por una
distancia de 0,003 µm, comparado con los 0,25 µm de uno óptico.
En este microsacopio sólo pueden examinarse objetos muy delgados; incluso una sola bacteria es
demasiado gruesa para ser observada directamente. Por lo tanto, es necesario preparar muestras
mediante técnicas especiales de cortes ultrafinos.
Para seccionar las células primero deben ser fijadas y deshidratadas (etanol o acetona). Después de la
deshidratación, la muestra se incluye en una resina, a la cual se le realizan cortes finos con un
ultramicrotomo (generalmente con , cuchilla de diamante). Una sola célula bacteriana puede cortarse en
cinco o seis secciones muy finas.
Si sólo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias secciones finas por lo que
se montan células enteras que se recubren de una capa fina de un metal pesado (oro). El rayo de
electrones es dirigido sobre la preparación y los electrones dispersados por el metal pesado activan una
pantalla de observación produciendo una imagen.
A la primera técnica se la denomina Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) y a la segunda
Microscopía Electrónica de Barrido (MEB).El microscopio electrónico de barrido -SEM- es el mejor
método adaptado al estudio de la morfología de las superficies, la imagen se genera por interacción de un
haz de electrones que "barre" un área.
TECNICAS PARA LA OBSERVACION DE LOS MICROORGANISMOS
Todos los microorganismos, excepto los acelulares (virus, viriones) pueden ser observados mediante
microscopios ópticos, a los cuales vamos a limitar la descripción de las técnicas más usadas para realizar
preparaciones de las muestras a observar .
Preparación en fresco:
Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobre un portaobjetos y
cubriéndola, sin formar burbujas de aire, con un cubreobjetos. Se observa al microscopio de contraste de
fases o de campo claro los microorganismos vivos, para que semuevan es preciso que no esté fijados.
Para poder observar mejor la movilidad de un microorganismo se utiliza la técnica de la gota pendiente.
Técnicas de tinción:
Para teñir los microorganismos de una muestra se siguen, en general, los siguientes pasos:
Extensión: Sobre un portaobjetos limpio se extiende con el asa la muestra que contiene los
microorganismos. Si la muestra es líquida se hace directamente y, si es sólida, hay que
suspenderla previamente en una gota de H2O. El extendido no debe ser muy denso porque
obstaculizaría el paso de la luz del microscopio y porque los microorganismos quedarían
aglomerados.
Fijación:
Para adherir la muestra al portaobjetos y para desnaturalizar las proteínas de manera que
el colorante entre fácilmente, se pasa la muestra repetidamente a 10 cm de la llama del
mechero, cuidando que el caentamiento logre secar la muestra pero no quemarla.
Tinción:
Se añaden los colorantes sobre los microorganismos sometidos al proceso anterior.
Existen varios tipos de tinciones:
Negativa:
Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo
su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina o tinta
china), cuyos pigmentos no penetran a la célula. La preparación se ve como un
negativo de fotografía en blanco y negro.
Simple:
Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tinción
negativa, sólo nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las
células.
Diferencial:
Intervienen dos o más colorantes y cada uno diferencia una estructura. El colorante
que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero, denominándose
colorante de contraste.
La Tinción de Gram Es la técnica de tinción más utilizada en bacterias. El primero en
describirla fue el danés Christian Gram. El procedimeinteo es el siguiente:
 Se tiñe la muestra con cristal (colorante azul)
 Se le agrega Lugol (mordiente, sustancia no colorante que refuerza la acción de un
colorante)
 Se lava con Etanol 96° (decolorante que remueve el colorante de ciertas bacterias,
las demás permanecen de color violeta
 Se añade Safranina (colorante de contraste, rojo, que tiñe las células que
quedaron decoloradas en el paso anterior)
Esta tinción distingue entre dos amplios grupos de bacterias según la composición de
la pared celular; las Gram (-) que no retienen el complejo cristal violeta-lugol después
de la decoloración con alcohol y aparecen teñidas de rojo, y las Gram (+) que sí lo
retienen y aparecen teñidas de azul oscuro.