INTRODUCCIÓN Las células con las que vamos a trabajar son MCF7 y CHO. Las MCF7 son células tumorales de mama de una línea estable, obtenidas de efusión pleural de una paciente con carcinoma mamario metastásico [SOU84]. Se caracterizan por poseer interacciones célula- célula, en cultivo, formando agregados muy compactos: Las CHO son células de ovario de hámster chino: Antes de comenzar con cada uno de los experimentos, vamos a realizar una breve explicación del uso de algunos materiales del laboratorio, que usaremos en las prácticas cuando sean necesarios, así como algunos de los productos que usaremos habitualmente. Materiales de laboratorio: - Estufa ; existen varios tipos de estufas: Incubador de CO2 se encuentra a 37℃ y 5% de CO2 , lo usamos para incubar los cultivos en su ambiente óptimo de Tª y concentración de gases, así como el grado de humedad. Para el uso de esta estufa, hay que tener en cuenta siempre el el estado en el que se encuentra la bombona de gas y la bandeja de agua. Estufa común, el cual no tiene asociado ningún tipo de mecanismo para 1 introducción de gases, solo regula la Tª y el grado de humedad. - Centrífuga; se utiliza para decantar el contenido sólido, en este caso las células, que se encuentran solubles en una disolución. Nosotros en la mayoría de los casos vamos utilizarla a 1000 rpm durante 5 min. - Baño térmico; lo utilizamos para adecuar la Tª de los productos que vamos a utilizar durante la realización de los distintos experimentos. Normalmente debe de mantenerse a 37℃. - Campana de flujo laminar; Su función es la de mantener un área libre de partículas, especialmente de posibles contaminantes (bacterias, levaduras,...) que puedan acceder al cultivo. Esto se consigue mediante un dispositivo mecánico que fuerza el paso del aire a través de un filtro de gran superficie (filtro HEPA) situado o bien en el techo (flujo vertical) o en la pared frontal (flujo horizontal) y que con una eficiencia del 99.999 % retiene las partículas por debajo de un cierto calibre que es en general de 0.2 mm. En la Figura 2.1 se representa una sección de filtro HEPA. El flujo del aire es laminar, sin turbulencias en las que puedan quedar retenidas partículas contaminantes. El flujo laminar se asegura tanto por la gran superficie del filtro HEPA como por la velocidad constante del aire, como por la ausencia de fuentes intensas de calor (mecheros Bunsen) en el interior de las cabinas, generadores de intensas corrientes de convección. - Autoclave; Un autoclave es un dispositivo que sirve para esterilizar material médico o de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presión y temperatura para ello. El fundamento del autoclave es que coagula las proteínas de los microorganismos debido a la presión y temperatura, aunque recientemente se ha llegado a saber de algunos microorganismos, así como los priones, que pueden soportar las temperaturas de autoclave. 2 - Microscopios; hemos usado tanto el microscopio óptico común como el invertido y de contraste de fase . Medio de cultivo : MEM con .292g/L L Glutamina, 1g /L Glucosa, 2.2g/L NaHCO3 - 450ml Minimum Essential Medium w/ Earle’s salt (Life Technology 11095-080) - 50ml Fetal bovine serum (Life Technology 16000044 and Hyclone Characterized) -5ml Penicillin/Streptomycin (100x) (Life Technology 15140-122 or Sigma P4333) 10,000 mcg/ml Streptomycin; 10,000 units/ml penicillin “G” - 5ml Sodium Pyruvate PBS: El PBS es el tampón fosfato que te permite llevar el pH a 7 esto se hace gracias a que el fosfato ( PO4 3-) es capaz de captar o dar 3 protones con sus equilibrios, además el tampón lleva solución salina y agua, a veces se le agrega un acido fuerte para estabilizarlo. Normalmente en nuestro laboratorio se encuentra de forma no estéril y a una concentración 5x, para pasarlo a concentración 1x, usamos 400 ml de agua destilada y 100 ml de PBS 5x. Nosotros usamos este tampón para lavar las células, como disolvente para otras sustancias como tripsina etc. Siempre debemos de recordar que ha de estar estéril, para ello lo autoclavamos durante 20 min. a 120℃. Tripsina: La tripsina es una enzima peptidasa, que rompe los enlaces de las proteínas mediante hidrólisis para formar péptidos o aminoácidos de menor tamaño. En nuestro caso, utilizamos una dilución de tripsina, para degradar las proteínas de la superficie celular que, entre otras cosas, tendrá como consecuencia que las células que se encuentran adheridas a un soporte sólido, se despeguen y así poder disponer de ellas. Para diluir la tripsina usamos PBS (45 ml) + tripsina (una alícuota de 5 ml) 3 Precauciones en el uso del laboratorio: - - Para el buen funcionamiento del incubador de CO2 , es conveniente que se mantengan las condiciones de esterilidad, así como las de Tª y nivel de CO2, por ello es recomendable no mantener la puerta abierta durante mucho tiempo. Es conveniente antes de introducir las manos en la campana pulverizarlas con etanol, así como todos los objetos. Cuando vallamos a desechar un cultivo, no tirar por el desagüe, echar antes lejía. Conectar la luz ultravioleta, antes y después de usar la campana, es otro paso mas de esterilización NO INTRODUCIR LAS MANOS CON LA LUZ UV CONECTADA!!! y por supuesto, tampoco nuestro cultivo de células. Echar los productos químicos de desecho, a su correspondiente bote de residuos. Saber anticiparse a las situaciones y preparar los materiales de cada práctica. Lavado y cambio de medio: Las células consumen el medio de cultivo en 2-3 días, originándose metabolitos tóxicos, cambios en el pH y acumulo de detritus celulares, por lo cual procedemos a su limpieza y renovación de medio de cultivo tres veces por semana. Se aspira la totalidad del medio. A continuación, cubrimos las células con una solución salina tamponada. Nosotros usamos PBS: NaCl............................ 4 gr. KCl ............................. 0,1 gr. Na2HPO4 · 12 H2O ..... 1,2 gr. KH2 PO4 ...................... 0,1 gr. H2O hasta ................... 500 ml. Es recomendable esta solución porque no contiene glucosa y puede ser esterilizada por autoclave. Seguidamente, aspiramos la solución e incorporamos medio nuevo a temperatura adecuada cubriendo toda la superficie celular. Subcultivos celulares: El subcultivo implica desprender las células desde su sustrato y transferirlas a un nuevo recipiente de cultivo. Esto se hace cuando las células han utilizado la superficie de crecimiento disponible para ellas o se ha alcanzado una densidad de población que suprime su crecimiento. Debido a que la capacidad replicativa de una población celular cultivada declina cuando se alcanza la confluencia (inhibición por contacto), las células deben ser transferidas en "semiconfluencia," cuando todavía están en la fase de crecimiento. Para despegar las células de la superficie de cultivo empleamos el método de digestión parcial de la membrana celular por una enzima proteolítica. Nosotros usamos la tripsina y la preparamos en una solución salina tamponada (PBS), sin Ca++ ni Mg++, en combinación con EDTA (agente quelante de cationes divalentes responsables de la adhesión) del siguiente modo: 5 ml. de tripsina-EDTA 10X (Gibco) en 45 ml. de PBS. Luego se ajusta el pH entre 7,2 y 7,8. Así, conseguimos una concentración final de 0,5% de tripsina y 0,2% de EDTA. Para subcultivar procedemos del siguiente modo: - Retiramos por aspiración el medio de cultivo. - Lavamos las células completamente con PBS y lo retiramos por aspiración. - Añadimos la solución de tripsina a 37º C (2,5 ml. en placas; 5 ml. en botellas 4 grandes; 1 ml. en botellas pequeñas) y la introducimos en el incubador durante 3 a 4 minutos. - Observamos frecuentemente las células en el microscopio invertido para controlar su despegamiento. Cuando la mayoría de las células están redondeadas y flotando, damos golpes secos al frasco para que se desprendan el resto de células. Añadimos medio de cultivo (el doble que de tripsina) para frenar la reacción proteolítica. - Aspiramos el contenido con una pipeta y lo transferimos a un tubo de ensayo. - Centrifugamos a 800 r.p.m. durante 5 minutos. - Retiramos el sobrenadante por aspiración y resuspendemos el precipitado (pellet) con medio pipeteando varias veces para que se disgreguen bien las células. - Dividimos el contenido para pasarlo a otras placas, ya preparadas con medio. - Introducimos los recipientes subcultivados en la incubadora donde, en unas 2 horas, se habrán adherido las células. Congelación de Células. Cuando no necesitamos las células durante un largo periodo de tiempo, pasamos a congelarlas del siguiente modo: - Lavamos con PBS, levantamos las células con tripsina y las dejamos varios minutos a 37_C (igual que para subcultivar). - Paramos la reacción con medio de cultivo y pasamos el contenido al tubo. - Centrifugamos a 800 r.p.m. durante 5 minutos. - Retiramos el sobrenadante y resuspendemos con 1 ml. de medio de congelación: Cell Culture Freezing Medium-DMSO (Gibco). - Pasamos el contenido a un vial y lo sellamos. - La congelación debe ser progresiva (dos días hasta -80_C) para pasar luego al nitrógeno líquido. Descongelación de Células. Cuando volvamos a necesitar células, las descongelamos siguiendo los siguientes pasos: - Sacamos el vial del nitrógeno líquido y lo calentamos al “baño maría” a 37_C. - Mezclamos, en un tubo de ensayo, el contenido del vial descongelado con 9 ml. de medio. - Centrifugamos a 800 r.p.m. durante 5 minutos. - Retiramos el sobrenadante y resuspendemos el pellet con medio de cultivo. - Añadimos a una o varias placas ya preparadas con medio. Medio de congelación: - 25ml Fetal bovine serum (50%) (Life Technology 16000044) - 20ml MEM complete (40%) (Life Technology 11095-080) - 5ml DMSO (10%) (Sigma D2650) 5 Experimento 1: Curva de crecimiento. - Introducción: Una curva de crecimiento es una herramienta gráfica para observar la evolución del crecimiento de células en cultivo. La curva de crecimiento de un cultivo celular, consta de 4 fases: Fase de adaptación o de latencia(A): Durante la que las células adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (de abundancia de nutrientes) para poder iniciar el crecimiento exponencial. Fase exponencial(B): en ella la velocidad de crecimiento es máxima y el tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las células consumen los nutrientes del medio a velocidad máxima. Fase estacionaria(C): en ella no se incrementa el número de células. Las células entran en fase estacionaria bien porque se agota algún nutriente esencial del medio, porque los productos de desecho que han liberado durante la fase de crecimiento exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el crecimiento u otras células que limiten su crecimiento por inhibición por contacto. En nuestro caso, el único factor que influye es la inhibición por contacto, puesto que el medio es cambiado cada 48 horas aproximadamente Fase de muerte(D): se produce una reducción del número de células viables del cultivo. C B A 6 - Objetivos: * Obtención de las curvas de crecimiento correspondientes a las líneas celulares CHO y MCF7. * Obtención del tiempo del ciclo celular a partir de estas curvas de crecimiento. - Materiales: * Campana de flujo laminar. * Centrífuga. * Tubos de centrífuga de fondo cónico no estériles. * Cámara de conteo. * Pipetas automáticas y puntas. * Pipeto. * Pipetas de vidrio (5ml, 10ml y 25 ml). * Bomba de succión con pipeta Pasteur. * Medio de cultivo completo. * Tripsina. * PBS 1X. * Microscopio óptico. * Microscopio óptico invertido de contraste de fases * Contador. - Procedimiento: * Coger una placa petri de cada línea celular, retirar el medio de cultivo, lavar con PBS 1X y tripsinizar con 3 ml de tripsina durante 5 minutos a 37ºC. * Comprobar que la tripsinización se ha efectuado visualizando las células al microscopio óptico invertido, debiéndose de observar células redondeadas y despegadas de la superficie. Despegar células mediante golpeo. * Pasar las muestras de cultivo tripsinizados a tubos de fondo cónicos de centrifugación y neutralizar la tripsina con medio de cultivo completo, uno por cada línea celular. Centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpm. * Aspirar el sobrenadante con la bomba de succión para quedarnos únicamente con el pellet. Resuspender pellet en un volumen conocido. * Calcular el número de células por mililitro mediante conteo de células con una cámara de conteo en un microcopio óptico. La cámara de conteo se compone de 9 celdas que presentan cada una el siguiente aspecto: 7 De cada celda se contará la celdilla central, y entre los 9 datos obtenidos se hará una media para calcular el número de células por ml. * Una vez conocido esto, calcula el volumen necesario para sembrar en cada placa 200000 células. * Dejar crecer 2 ó 3 días y el 4º día comenzar a contar 3 placas por línea celular durante 6 días. - Datos obtenidos y discusión de resultados: * Cálculo para la obtención de 200000 células para la siembra inicial y elaboración de las curvas de crecimiento. En CHO, el volumen de resuspensión de medio de los pellet fueron 900 μl. El número de células obtenido en cada celdilla fue el siguiente: 68-71-70-83-78-79-80-89-98-92. Con estos datos hacemos una media de los 9 valores cuyo valor es de 80.89 células, considerando los datos que expondré a continuación, multiplicamos este valor por 90000 para obtener el número de células por ml, que fue de 7280000. Entonces mediante la siguiente regla de tres calculamos cuantos ml coger para sembrar 200000 células. 200000----------------------x ml 7280000---------------------1ml x= 27.47 μl Para redondear vamos a echar 28 μl, que serían 203.840 células en el cultivo inicial. Para MCF7, realizamos el mismo procedimiento, pero resuspendemos el pellet en 900 μl, saliéndonos en el conteo los siguientes datos: 41-47-52-31-61-52-60-50-69, con un media de 51.54. Con ello calculamos el número de células por ml que fue 4630000. Entonces mediante la siguiente regla de tres calculamos cuantos ml coger para sembrar 200000 células. 200000----------------------x ml 4360000---------------------1 ml x= 43.2 μl Para redondear echamos 44 microlitos que serían unas 203720 células en el cultivo inicial. Esta siembra la realizamos un jueves y comenzamos a contar el lunes siguiente. A continuación vamos a exponer los datos obtenidos tras los seis días de conteo. 8 Día Línea celular Tiempo Dilución (horas) (ml) 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 0 0 20 20 52.5 52.5 76.5 76.5 97.25 97.25 123,5 123,5 CHO MCF7 CHO MCF7 CHO MCF7 CHO MCF7 MCF7 CHO CHO MCF7 0,6 0,5 0.8 0.8 1.2 1.2 1 1 2 1.5 2 1.5 Cámara 1 (células totales) 2340000 434700 2384000 3640000 4524000 2664000 6870000 4840000 7300000 8850000 8712000 6120000 Cámara 2 (células totales) 2030000 450000 3016000 3056000 7428000 1404000 8510000 5390000 9200000 5595000 7356000 4470000 Cámara 3 (células totales) 1999800 544000 800000 3087000 3828000 2052000 9372000 3400000 9400000 7905000 7800000 4785000 Media(número total) 2123267 476550 2700000 3261000 4176000 2040000 8250000 4543333 8633333 8377500 7956000 4627500 Para obtener el número total de células en cada cámara utilizada para el conteo, se aplica la fórmula: Teniendo en cuenta que el Nº células cuadrado pequeño, equivale a la media de 9 valores obtenidos en cada cámara. Nota: los números en rojo indican que hemos descartado ese dato, por que considerábamos que esos valores se alejaban mucho del resto de datos de la misma línea celular y del mismo día. 10000000 9000000 C 8000000 Nº células 7000000 B 6000000 CHO 5000000 MCF7 4000000 3000000 A 2000000 1000000 0 0 20 52,5 76,5 Horas 9 97.25 123,5 Como podemos observar en la gráfica superior la curva de CHO nos ha salido bien por que podemos distinguir las tres fases del crecimiento celular mencionadas en la introducción. Por lo que con los datos de la gráfica vamos a obtener su tiempo de ciclo. MCF7 sin embargo, nos ha salido muy irregular y no se distinguen bien las fases, no podemos fiarnos de esta gráfica para calcular el tiempo de ciclo. Por lo cual procedimos a repetir el experimento con MCF7. Datos de la repetición de la curva de crecimiento de MCF7: En este caso repetimos el experimento en placas petri pequeñas y sembramos alrededor de 80000. Cogimos una placa de MCF7 y calculamos el número total de células que contenía mediante cámaras de conteo obteniendo un valor medio de células por celdilla de 40.55 células. 40.55 x 90000 =3650000 células/ml. Conociendo que en un 1 ml tenemos 3650000 células: 3650000 células-------------1ml 80000 células---------------- x x=22 μl Esta siembra la realizamos un jueves y comenzamos a contar el lunes siguiente. A continuación vamos a exponer los datos obtenidos tras los seis días de conteo. Línea celular Día Tiempo (horas) Dilución (ml) MCF7 MCF7 MCF7 1 2 3 0 29 53 0.2 0.4 0,65 MCF7 MCF7 MCF7 4 5 6 77 97 123.5 0.8 0.9 1.5 Cámara 1 Cámara 2 (células totales) (células totales) 350000 322000 580000 604000 Destrucción del 1189500 pellet 2190000 1970000 2421000 2997000 3585000 6210000 Cámara 3 (células totales) 362000 596000 1566500 Media (número total) 344667 593333 1378000 1960000 3744000 5385000 2040000 3054000 5797500 Con estos datos obtuvimos la siguiente gráfica: MCF7 7000000 Nº células 6000000 5000000 4000000 Nº células 3000000 2000000 1000000 0 0 29 51 75 Tiempo(h) 10 95 121,5 Como observamos hemos obtenido una fase de latencia y una exponencial, como se debería esperar. La fase estacionaria no se da en células MCF7 puesto que carecen de inhibición por contacto, por lo cual tardarán más tiempo en llegar a la fase estacionaria. Una vez obtenidas las correspondientes curvas de crecimiento de ambas líneas celulares, se procede al cálculo del tiempo de ciclo. Para ello utilizamos las siguientes expresiones: Tiempo de ciclo de CHO: Ni*2n = Nf 2700000*2n=8250000 n=1.611 Tiempo de ciclo=56.5 horas/1.611=35.3 h. Tiempo de ciclo de MCF7: Ni*2n = Nf 2040000*2n=5797500 n =1.5 Tiempo de ciclo: 46.5 horas/1.5 = 31 h. 11 Experimento 2: SUPERVIVENCIA - Introducción: Esta técnica se trata de comprobar la supervivencia de una extirpe celular, cuando se realiza la siembra. - Materiales: - 18 Cajas petri Medio de cultivo - Procedimiento: 1) Sembramos en 3 cajas 100 células, en otras 3 cajas 500 y en otras 3, 1000 células (esto se realiza para cada extirpe), con abundante medio 2) Se introducen en el incubador de CO2 durante 8 días 3) Se tiñen siguiendo el siguiente protocolo: TINCIÓN DE COLONIAS CELULARES 1.- Fijar en metanol puro, 10 minutos a temperatura de laboratorio. 2.- Lavar en PBS, 5 minutos. 3.- Teñir con solución de Giemmsa al 10%-20%, 10 minutos. 4.- Lavar en PBS. 5.- Secar. 4) Contar las colonias. - Resultados y cálculos: CHO 12 12 14 13 19 20 10 21 18 media = 15,4 - si en 1 ml hay 15,4*90000= 1386000cel /ml en 7 ml existen 9702000 células totales: 7 ml ------- 9702000 células X = 0,0007 ml = 0,7µl X -------- 1000 células 7 ml ------- 9702000 células X = 0,0004 ml = 0,4 µl X -------- 500 células 12 7 ml ------- 9702000 células X = 0,00007 ml = 0.07 µl X -------- 100 células Nos salen volúmenes muy pequeños, así que tenemos que hacer diluciones, vamos a realizar una dilución de 1/10 usando 6,3ml de medio y 700µl del cultivo, así pues: 7 ml ------- 970200 células X = 0,007 ml = 7 µl X -------- 1000 células 7 ml ------- 970200 células X = 0,004 ml = 4 µl X -------- 500 células De la anterior dilución, volvemos a diluir a 1/5 añadiendo 600 µl de la dilución anterior y 2,4 ml de medio: 7 ml ------- 194040 células X = 0,004 ml = 4µl X -------- 100 células MCF 7 6 13 28 8 16 9 2 2 23 media = 11,8 - si las células por ml son 11,8 *90000= 1070000cel/ml las células totales son 1070000*6= 6420000 células. 6 ml ------- 6420000 células X = 0,0009 ml = 0,9 µl X -------- 1000 células 6 ml -------6420000 células X = 0,0005 ml = 0,5µl X -------- 500 células 6 ml ------- 6420000 células X = 0,00009 ml = 0,09 µl X -------- 100 células 13 Vamos a hacer una dilución 1/10 con 600 µl de cultivo y 5,4 ml de medio 6 ml ------- 642000 células X = 0,009 ml = 9 µl X -------- 1000 células 6 ml ------- 642000 células X = 0,005 ml = 5 µl X -------- 500 células De la dilución anterior volvemos a realizar otra dilución 1/5, añadiendo 833 µl mas 5,17ml: 6 ml ------- 128400 células X = 0,005 ml = 5 µl X -------- 100 células MCF7 100 58 57 59 media = 58 % 267 268 297 500 1000 media = 55% 305 426 355 media = 36 % CHO 100 26 30 35 media = 30% 500 168 177 187 1000 media= 36% 262 301 293 media = 29 % Comentarios: La supervivencia media de MCF7 ha sido de 50% y CHO del 32%. Teniendo en cuenta que la supervivencia suele ser del 30 – 60% , el experimento ha salido como era de esperar. Este experimento lo hemos repetido 4 veces, las 3 primeras veces siempre son salía una supervivencia mayor del 80%, incluso a veces mayor del 100%, eso pudo haberse debido a: 14 - Fallo de cálculos o en el conteo de células. Fallo de pipeteo; ya que si hay que coger un volumen muy pequeño (menor de 5µl) es aconsejable hacer diluciones, para que no existan este tipo de problemas. Puede que las placas se movieran y una de las células de una colonia formara una colonia nueva, cercana a la anterior. Lo único extraño de nuestros resultados, es que el crecimiento disminuye con respecto al numero de células sembradas es decir, que en las placas de 1000 ha existido menos porcentaje de supervivientes que en las de 100 y menos que en las de 500. Lo que debería haber sucedido es que al sembrar mas células, se favorece la supervivencia mediante señales paracrinas. 15 Experimento 3: OBTENCIÓN DE METAFASES DE CHO Y MCF7 - Introducción: Vamos a obtener metafases de MCF7 y CHO para observar el número de cromosomas. Las metafases se obtienen utilizando colcemida, que actúa sobre el citoesqueleto, impidiendo que polimericen, por lo que no se forma el uso mitótico, y este es el motivo por el cual las células permanecen en metafase, pero hay que ser cautos con la concentración de colcemida adecuada ya que es una droga que al actuar sobre el citoesqueleto, puede crear otro tipo de daños. - Materiales y reactivos: * Colcemida * KCl * Metanol * Acético - Método: PREPARACIÓN DE LOS CROMOSOMAS 1.- Tratar las células con 0.4 μg/ml. colcemida a 37 ºC durante 4 horas. 2.- Suspender las células en mitosis por golpeo, y formar un pellet por centrifugación a 800 r.p.m., 4-5 min. 3.- Tirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μl KCl 75 mM (0.558g/100ml agua destilada) a 37°C. Llevar el volumen a 10 ml. con ClK 75 mM para resuspender bien el pellet. Dejar a 37º C, 10 min. 4.- Centrifugar a 800 r.p.m. durante 5 min. - Eliminar el sobrenadante, resuspender el pellet y fijar en 5 ml. de metanol:acético (3:1) recién preparado a 4ºC. - Centrifugar de nuevo y repetir 2-3 veces, durante 10 min. a 4ºC. (en este punto se puede parar la técnica. Halkka et al., 1987 lo dejan hasta varios meses a -20ºC) 5.- Centrifugar y resuspender de nuevo en metanol-acético en un volumen suficiente para tener una buena densidad de células. 6.- Con una pipeta Pasteur coger un poco de células con fijador y sobre un porta frío humedecido con vaho dejar caer 3 ó 4 gotas que se esparcirán solas. 7.- Una vez secas las preparaciones, estarán listas para que se les aplique cualquier técnica de tinción; ya sea la FPG, el Giemmsa, inmuno, etc. 16 1 COLCEMIDA - Solución stock: ...... 0.1μg/1μl. (Eppendorf en congelador). - Solución trabajo .....0.4μg/ml. Incubar los cultivos celulares durante 4-6 horas a 37ºC. Ejemplo: C * V = C’ * V’ 100 μg/ml * V = 0.4μg/ml. * 5ml V = 0,02 ml = 20 μl - Resultados: Este experimento hemos tenido que repetirlo dos veces para CHO y tres para MCF7. La primera vez el problema estuvo en un choque osmótico muy débil, ya que las células no se reventaron, además de un fallo en los cálculos a la hora de añadir la colcemida, ya que tomamos la concentración del stock como 0,01μg/μl. La segunda vez que repetimos MCF7 todo el proceso se dio correctamente pero el fallo se dio al montar sin xilol, así que nos resultó imposible tomar fotos de esas preparaciones. Los resultados de las CHO son los siguientes: 17 Experimento 4: CARIOTIPO DE LINFOCITOS - Introducción: Vamos a ver el cariotipo de linfocitos humanos, utilizando nuestra sangre. El procedimiento es parecido al del experimento anterior solo que hay que tener en cuenta que los linfocitos deben de ser tratados de forma algo distinta. - Materiales y reactivos : * Colcemida * KCl * Metanol * Acético - Método: 1.- Extracción de la sangre en esterilidad (0.5 ml / 4.5 ml medio RPMI). 2.- Añadir de 2-10μg/ml de PHA e incubar en estufa de cultivo. (La PHA estará siempre presente después de cada lavado hasta llegar a la fijación de las células). 3.- Lavado de linfocitos (Opcional): a) Decantar el medio con la sangre en tubos de cetrífuga, estériles de 10 ml., flameando el cuello antes del vertido. 18 b) Centrifugar a 1000 r.p.m. durante 6 minutos y quitar el sobrenadante con "pipeta estéril" dejando un poco en el tubo para evitar perdida de las células. c) Resuspender suavemente a mano. d) Añadir nuevo medio RPMI hasta 10ml para hacer una segunda centrifugación. e) Finalmente añadir 5ml de medio RPMI con PHA a cada tubo, resuspender y pasar a frascos de cultivo rotulados, estériles. 4.- Recogida de metafases (Chromosome arrest): Añadir 0.4 μg/ml de colcemida en cada frasco de cultivo de 5ml., mantener a 37 º C y fijar a las dos horas. 5.- Fijación: a) Pasar la sangre a tubos de centrifuga de 10 ml. b) Centrifugar a 1000 r.p.m., durante 6 minutos y extraer el sobrenadante dejando un poco sobre el pellet. Resuspender. c) Choque hipotónico con KCl 0.075 M: Añadir 3 gotas al resuspendido y agitar suavemente; ir añadiendo, poco a poco, gotas de KCl hasta los 5 ml aproximadamente y mantener en el baño a 37ºC durante 10 minutos. d) Centrifugar a 1000 r.p.m., durante 6 min., y extraer el sobrenadante. e) Fijar con Acido acético-metanol (1:3) añadiendo gota a gota igual que con el choque hipotónico. f) Centrifugar a 1000 r.p.m., durante 6 min., y extraer el sobrenadante. Repetir los dos últimos pasos dos veces más (en total son 3 fijaciones). 6.- Preparaciones: Hacer los extendidos dejando caer una gota del resuspendido final, desde la máxima altura posible, sobre un porta frío y mojado. Dejar secar una noche y teñir con Giemmsa (3 % en tampón fosfato, pH=6.8. 5 min.). Resultados: Los resultados en general fueron buenos, pero en las preparaciones de algunos de los compañeros también hubo problemas con el choque osmótico y los cromosomas no estaban bien extendidos, a continuación aparecen además de algunas fotografías, el cariotipo humano: 19 20 Experimento 6: Daño al ADN. - Introducción: El agente que hemos utilizado para dañar el ADN ha sido la bleomicina, que es un antibiótico que se usa para combatir el cáncer; desacelera o detiene el crecimiento de las células cancerígenas en el cuerpo. Se piensa que ésta inhibe el síntesis del ADN, y en un nivel menor la síntesis del ARN y las proteínas. ESTRUCTURA DE LA BLEOMICINA Las bleomicinas comparten la misma estructura central, pero pueden diferir en el tipo de carbohidratos y cadenas cargadas positivamente que contienen. Presentan diferentes dominios funcionales: a) Dominio de unión a metales: este dominio contiene átomos de nitrógeno que coordinan al metal, formando un complejo octaédrico con éste. La unión de la bleomicina con metales de 21 transición como Fe (II) y Cu (I) y en presencia de oxígeno puede catalizar el corte del DNA de cadena sencilla y de cadena doble, además de generar especies de oxígeno reactivas. b) Dominio de unión al DNA: la pirimidina de la bleomicina, en colaboración con el grupo bitiazol, son responsables de la unión con el DNA. Las cargas positivas del grupo bitiazol favorecen la unión electrostática de la bleomicina con el DNA; esta unión puede ocurrir por intercalación o a través de interacciones con el surco menor. c) Carbohidratos: la bleomicina puede estar glicosilada con α–D–manosa y α–L–glucosa. No se conoce con precisión el papel de los carbohidratos, pero existen evidencias de que pueden modular la afinidad de la bleomicina por el DNA. MECANISMOS DE ACCIÓN DE LA BLEOMICINA Para activarse la bleomicina requiere de la unión con un metal de transición reducido [Fe (II) o Cu (I)], la presencia de una molécula de oxígeno y un agente reductor. La bleomicina activa ejerce su efecto citotóxico a través de la generación de especies de oxígeno reactivas y por daño directo al DNA y RNA. Daño al DNA: estudios in vitro han mostrado que la bleomicina puede cortar directamente el DNA de cadena sencilla y cadena doble, causando cambios globales en la morfología de los cromosomas. El daño de la bleomicina sobre el DNA es dosis–dependiente. Además, se ha determinado que el efecto de la bleomicina es dependiente del ciclo celular (el cual es mayor en las células que se encuentran en la fase G1 y G2/M del ciclo celular) y del estado de activación transcripcional, siendo más susceptible la eucromatina que la heterocromatina. La bleomicina no interfiere directamente con la replicación del DNA, ni con la síntesis del RNA y de las proteínas. Daño al RNA: recientemente se ha propuesto que el RNA es un blanco potencial de la bleomicina. Se ha demostrado in vitro que el RNA puede ser degradado por hidrólisis directa o en forma indirecta por la generación de radicales libres. Generación de especies de oxígeno reactivas: la bleomicina activa puede generar radicales hidroxilo, superóxido y peróxido de hidrógeno, que reaccionan rápidamente con cualquier molécula en forma inespecífica, oxidando lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. - Objetivos. * Obtención de las curvas de crecimiento correspondientes a las líneas celulares CHO y MCF7, tanto con agente mutante como sin él, para poder observar el daño producido - Materiales. * Campana de flujo laminar. * Centrífuga. * Tubos de centrífuga de fondo cónico no estériles. * Cámara de conteo. * Pipetas automáticas y puntas. * Pipeto. * Pipetas de vidrio (5ml, 10ml y 25 ml). * Bomba de succión con pipeta Pasteur. 22 * Medio de cultivo completo. * Tripsina. * PBS 1X. * Microscopio óptico. * Microscopio óptico invertido de contraste de fases * Contador. * Sulfato de Bleomicina en suero (1.5 U/ml). - Procedimiento. * Coger 1 placa petri de cada línea celular, retirar el medio de cultivo, lavar con PBS 1X y tripsinizar con 3 ml de tripsina durante 5 minutos a 37ºC. * Comprobar que la tripsinización se ha efectuado visualizando las células al microscopio óptico invertido, debiéndose de observar células redondeadas y despegadas de la superficie. Despegar células mediante golpeo. * Pasar las muestras de cultivo tripsinizados a tubos de fondo cónicos de centrifugación y neutralizar la tripsina con medio de cultivo completo, uno por cada línea celular. Centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpm. * Aspirar el sobrenadante con la bomba de succión para quedarnos únicamente con el pellet. Resuspender pellet en un volumen conocido. * Calcular el número de células por mililitro mediante conteo de células con una cámara de conteo en un microcopio óptico. * Una vez conocido esto, calcula el volumen necesario para sembrar en cada placa 150000 células, como hicimos en el primer experimento * Dejar crecer 2 ó 3 días y el 4º día comenzar a contar 3 placas por línea celular durante 6 días mediante las cámaras de conteo. Los agentes se introducirán en el medio de cultivo a las 48 horas del primer día de cultivo, para tenerlos en fase exponencial y ver así los efectos de dicho agente en cada una de las líneas. En nuestro caso el agente utilizado es bleomicina. * Elaboración de las curvas de crecimiento. - Datos obtenidos y discusión de resultados. * Cálculo para la obtención de 150000 células para la siembra inicial y elaboración de las curvas de crecimiento. En MCF7, el volumen de resuspensión de medio de los pellet fueron 4000 μl. El número de células obtenido en cada celdilla fue el siguiente: 26-24-26-16-14-36-26-37-33. Con estos datos hacemos una media de los 9 valores cuyo valor es de 26,44 células, considerando los datos que expondré a continuación, multiplicamos este valor por 90000 para obtener el número de células por ml, que fue de 2380000. Entonces mediante la siguiente regla de tres calculamos cuantos ml coger para sembrar 150000 células. 150000----------------------x ml 23 x= 57,7 μl 2380000---------------------1ml Para CHO, realizamos el mismo procedimiento, pero resuspendemos el pellet en 6000 μl, saliéndonos en el conteo los siguientes datos:27-26-21-27-29-31-28-43-27 con un media de 28,89. Con ello calculamos el número de células por ml que fue 2592000. Entonces mediante la siguiente regla de tres calculamos cuantos ml coger para sembrar 150000 células. 150000----------------------x ml 2592000---------------------1 ml x= 84,03 μl * Cálculos para la determinación de cantidad de bleomicina a usar en el volumen de medio que vamos a utilizar. Para ello utilizamos la relación: C*V=C´*V´ Siendo: C: Concentración final de bleomicina. V: Volumen final. V´: Volumen de bleomicina 1.5 U/ml a coger para obtener la concentración final de bleomicina que queremos. C´: Concentración inicial de bleomicina. Aplicamos la relación: 4 ml de volumen final * 1.5 mU/ml de bleomicina= x ml de bleomicina 1500mU/ml * 1500 mU/ml de bleomicina x= 0.004 ml es decir 4 microlitros de bleomicina. Y de medio tendremos que añadir 3996 microlitros de agua. * Resultados obtenidos y discusión de resultados. A continuación se exponen los resultados obtenidos tras el conteo. Día Línea celular Tiempo (horas) Media(número total) 1 CHO (agente) 24 535000 1 MCF7 (agente) 24 304800 1 CHO (Control) 24 345000 1 MCF7 (Control) 24 296550 2 CHO (agente) 48 563400 24 2 MCF7 (agente) 48 354420 2 CHO (Control) 48 599400 2 MCF7 (Control) 48 412596 3 CHO (agente) 72 1159200 3 MCF7 (agente) 72 1344000 3 CHO (Control) 72 1128600 3 MCF7 (Control) 72 1420200 4 CHO (agente) 96 3020000 4 MCF7 (agente) 96 2032000 4 CHO (Control) 96 4690000 4 MCF7 (Control) 96 2206000 5 CHO (agente) 120 4649666 5 MCF7 (agente) 120 2790666 5 CHO (Control) 120 5746000 5 MCF7 (Control) 120 2617333 6 CHO (agente) 144 4575000 6 MCF7 (agente) 144 2962500 6 CHO (Control) 144 5550000 6 MCF (Control) 144 3170000 Con estos resultados procedimos a realizar las gráficas que representaran el crecimiento celular obteniendo los siguientes resultados: 25 CHO 7000000 6000000 5000000 4000000 CHO control CHO agente Bleomicina 3000000 2000000 1000000 0 24 48 72 96 120 144 MCF7 3500000 3000000 2500000 Bleomicina 2000000 MCF7 control MCF7 agente 1500000 1000000 500000 0 24 48 72 96 120 144 Como observamos en CHO al añadir el agente, se produce un declive en el crecimiento celular, creciendo más lento en las horas posteriores al añadir el agente, ello nos indica que la bleomicina habría producido daño, y que por tanto antes de la división celular el sistema de reparación de CHO habría actuado, por lo cual se tardaría más tiempo en completar el ciclo y por lo tanto el crecimiento celular es menor, de ahí que haya crecido menos que en el caso de control. También pude plantearse la hipótesis de que las células afectadas muriesen, de ahí que al dividirse las supervivientes diesen un número menor a la curva control, aunque esta hipótesis es menos probable, ya que deberían haber muerto un mayor número de células. 26 En el caso de las MCF7 esto no ocurre, ya que posiblemente al ser células cancerosas, el daño que provoque la bleomicina ya los tenga estas células de la línea MCF7 por lo que no deberíamos esperar una diferencia entre la curva control y la agente, de echo, solapan una con la otra tal y como debería esperarse. Experimento7: Binucleadas 27 - Introducción: En este experimento vamos a utilizar una droga, llamada citocalasina B, que inhibe la polimerización de los filamentos de actina, por lo que no se formaría el anillo de contracción de citocinesis, obteniéndose células binucleadas. El objetivo es calcular, con otro método, el tiempo de ciclo y observar micronúcleos. - Materiales: * Campana de flujo laminar. * Centrífuga. * Tubos de centrífuga de fondo cónico no estériles. * Pipetas automáticas y puntas. * Pipeto. * Pipetas de vidrio (5ml, 10ml y 25 ml). * Bomba de succión con pipeta Pasteur. * Medio de cultivo completo. * Microscopio óptico. * Microscopio óptico invertido de contraste de fases. * Cámara de fotos. * Colcemida. * Citocalasina. * KCl. * Metanol acético. * Giemsa 20% (en tampón fosfato pH = 6.8. * PBS 1X no estéril. * Agua destilada. * Xilol. * DPX. * Portaobjetos. * Cubreobjetos. - Procedimiento: * Hay que tratar con colcemida durante 2 o 3 horas y posteriormente obtener, por golpeo, células en mitosis que, tras centrifugar y resuspender, sembraremos, en placas petri pequeñas, para partir de un cultivo sincrónico. A partir de este paso empezamos a contar el tiempo de ciclo. * Tratamos con citocalasina cuando calculemos que estamos en G2, que es unas 6 horas antes de que finalice el ciclo( el tiempo de ciclo de cada línea celular ya lo tenemos calculado). La citocalasina no la echamos desde el principio para no estresar a las células demasiado. * Observar las células cada cierto tiempo para ver cuando aparecen binucleadas. Cuando aparezcan será el final de nuestro ciclo celular. * Tomar fotos de binucleadas en el microscopio invertido de contraste de fase. * Posteriormente seguir el mismo protocolo que el de preparación y tinción de cromosomas. - Resultados y discusión: 28 Lo primero antes de empezar el experimento fue planificar las horas a las que íbamos a venir. Echamos la colcemida un viernes a las 7:30 de la mañana y sembramos a las 9:30. Como CHO nos salió un ciclo de 35 horas, echamos la citocalasina a las 29 horas (a las 14:30) y durante las 6 horas restantes observamos las células para anotar cuando aparecen las binucleadas. MCF7 debería tener un ciclo, según lo que nosotros calculamos con la curva de crecimiento, de 31 horas, por lo que echamos la citocalasina a las 25 horas (a las 10:30 de la mañana), y observar durante las siguientes seis horas hasta que aparezcan las binucleadas. También tenemos que hacer dos tipos de cálculos: -Cuanta colcemida echar: Concentración inicial de colcemida = 10 μg/ml (C), en placa tenemos que dejar una concentración de colcemida de 0,4 μg/ml (C’). Para 4 ml de volumen total (V’): C x V = C’ x V’ 10 μg/ml x V = 0,4 μg/ml x 4 ml V = 0,16 ml = 160 μl de colcemida En cada placa (2 placas, 1 por cada línea celular). 4ml – 0,16ml = 3,84 ml de medio (aproximadamente 4ml) -Cuanta citocalasina echar: En este paso cometimos un error, porque partimos de una concentración inicial de citocalasina equivocada, 2 μg/ml (C), la verdadera concentración inicial era de 2 μg/ μl (C), por lo que echábamos 1000 veces más de lo necesario. La concentración a la que tenemos que dejar la citocalasina en placa es de 0,3 μg/ml (C’). Para un volumen de 4 ml de volumen final en placa de petri (V’). C x V = C’ x V’ 2 μg/ml x V = 0,3 μg/ml x 4ml ; V = 0,6ml = 600 μl de citocalasina en cada placa (2, una por cada línea celular). Esto esta mal. 2 μg/ μl (2.103 μg/ ml) x V = 0,3 μg/ml x 4ml ; V = 6.10-4ml = 0,6 μl citocalasina. Esto es lo que deberíamos haber hecho. Este primer intento no nos salió bien, porque salieron algunas binucleadas, pero había muchas más células que no estaban binucleadas, por lo que no teníamos un cultivo sincrónico y el experimento no valía. Posiblemente por que al golpear nos se levantaron células que no estaban en mitosis, por lo que al sembrarlas no partiremos de un cultivo sincrónico. -Segundo intento: 29 Esta vez echamos la colcemida a las 7:00 a.m y sembramos a las 9:00 a.m. A MCF7 le echamos la citocalasina a las 10:00 a.m. del día siguiente, y a CHO a las 14:00 de la tarde. Aparecieron binucleadas de MCF7 a las 16:20, por lo que si contamos desde las 9:00 a.m., del día anterior, hasta las 16:20 de este día, el tiempo de ciclo que nos sale es de 30horas y 40 minutos. En la curva de crecimiento celular nos dio 31 horas, como son muy parecidos podemos fiarnos algo más de nuestros tiempos de ciclo. MCF7, binucleadas MCF7, binucleadas Las binucleadas de CHO aparecieron a las 21:00 horas del día siguiente a la siembra. Como se sembró a las 9:00 a.m. del día anterior, nuestro tiempo de ciclo sería de 36 30 horas, Como en la curva de crecimiento celular de CHO nos salió un tiempo de ciclo de 35,3 horas, nos dan tiempos de ciclo parecidos, por lo que parece que nuestros datos son algo fiables. CHO, binucleadas. CHO, binucleadas. CHO, binucleadas. -Fotos tinción de cromosomas: 31 CHO, tinción (binucleadas) CHO nos salió mal al teñirlo porque le dimos dos choques osmóticos. MCF7, tinción (binucleadas) MCF7, tinción (binucleadas)con la flecha aparece indicado un micronúcleo MCF7, tinción (binucleadas) Experimento 8: INMUNOLOCALIZACIÓN A MICROSCOPÍA ÓPTICA DE 32 FLUORESCENCIA -Introducción: La inmunocitoquímica usa anticuerpos para localizar una molécula específica, tras esto los anticuerpos pueden visualizarse por algún tipo de técnica. Puede usarse solo un anticuerpo que reconozca a la molécula y a la vez sea localizable, pero es raro, ya que lo común es usar dos tipos de anticuerpos, uno que tenga como diana tu molécula problema y otro que tenga como antígeno este primer anticuerpo, llevando este segundo algún tipo de señal de localización, por ejemplo fluorescencia o radiactividad. -Procedimiento: 1.- Fijar las células crecidas en cubres con una solución de formaldehído al 3% en PBS (4.1 ml de formaldehído 35-40% + 46 ml de PBS). A esta solución fijadora se le añade Tritón X-100 al 1%. 20 min. a Tª ambiente. 2.- Lavar los cubres en PBS, 5 min. 3.- Bloquear en BSA al 3% en PBS, 15 min. (Mínimo). 4.- Incubar en el primer anticuerpo a la dilución adecuada en PBS de 1 a 24 horas, en ambiente húmedo y temperatura de 37 ºC. (Depositar una gota de aproximadamente 60 μl de la dilución de anticuerpo sobre papel Parafina). 5.- Lavar en PBS durante un mínimo de 15 min. 6.- Incubar en el segundo anticuerpo a la dilución adecuada en PBS, 45 min., en ambiente húmedo y temperatura de 37 ºC. (Depositar una gota de aproximadamente 60 μl de la dilución de anticuerpo sobre papel parafina). - GAH-FITC. Dilución 1: 30 en PBS. - Anti Rabbit-FITC. Dilución 1 : 200 en PBS. 7.- Lavar en PBS durante un mínimo de 15 min. 8.- Montar en Hoechst 33342, 10 μg / ml, en PBS-glicerol (1 : 9). Poner una gota de 3 - 5 μl por porta. - Solución stock: 4 mg Hoechst. 1 ml PBS. Filtrar y guardar a 4 ºC. - Solución uso: 25 μl solución stock en 10 μl de PBS-glicerol (1:9) -Resultados: 33 Los resultados que aparecen en las fotografías corresponden a cuatro de las 8 preparaciones que realizamos, que estaban hechas con las siguientes diluciones del suero (anticuerpo 1): - Dilución 1/50 ------- 490 µl PBS + 10 µl de suero - Dilución 1/100 ------300 µl PBS + 200 µl de la dilución 1/50 - Dilución 1/500 ----- 400 µl PBS + 100 µl de la dilución 1/100 El segundo anticuerpo estaba a una concentración de: - 1: 32 --- 248 µl PBS + 8 µl de suero De este segundo anticuerpo no se hacen diluciones, en todos los cubres se echaba lo mismo, incluso en el control. CHO Las fotografías superiores pertenecen a la preparación de la dilución 1/100.A la izquierda tenemos las CHO de color azul gracias al Hoechst, y a la derecha aparecen las células en verde intenso debido al tratamiento con el anticuerpo tipo A código 177836, ya que estas células fueron tratadas con los dos anticuerpos. En el control (fotografía inferior) aparece como una pequeña tonalidad verde que puede ser debida a uniones inespecíficas del segundo anticuerpo, ya que esta preparación solo fue tratada con este. La inmunolocalización se ha dado en una molécula del citosol, ya que como se observa en la foto (marcado con flechas) en la imagen de la de la derecha, aparece muy poca intensidad del verde, en la zona que en la foto de la izquierda se ve que pertenece al núcleo. 34 MCF 7 Las fotografía superior pertenece a la preparación con dilución 1/50. En esta extirpe usamos otro anticuerpo primario (el segundo anticuerpo es común), fue el tipo B código 178180, y por lo que se puede apreciar no ha sido tan efectivo como en CHO. Esto pudo deberse a un fallo nuestro a la hora de realizar las preparaciones o a que este anticuerpo este mal, pero se aprecia perfectamente como esta mucho menos intenso que en CHO. Aun así, se aprecia como el antígeno se encuentra en el citosol, al igual que se explicó para CHO. El control, fotografía inferior, como era de esperar ha salido muy poco marcado, y ese marcaje poco intenso puede deberse a uniones inespecíficas del anticuerpo 2º. 35 Experimento 9: OBSERVACIÓN MORFOLÓGICA A MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA INCLUSIÓN EN RESINA EPOXY -Introducción: Un microscopio electrónico es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales (hasta 500.000 aumentos comparados con los 1000 de los mejores microscopios ópticos) debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones. Un microscopio electrónico funciona con un haz de electrones generados por un cañón electrónico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnéticas (todo ello al alto vacío ya que los electrones son absorbidos por el aire). Los electrones atraviesan la muestra (debidamente deshidratada) y la amplificación se produce por un conjunto de lentes magnéticas que forman una imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la pantalla de un ordenador. Los microscopios electrónicos sólo se pueden ver en blanco y negro, puesto que no utilizan la luz, pero se le pueden dar colores en el ordenador. Como se puede apreciar, su funcionamiento es semejante a un monitor monocromático. -Materiales: Células Animales Cultivadas en monocapa. Frasco Rous pequeño. Resina Matraces Erlenmeyer Pipetas Coplins Estufa de calefacción a 60ºC Tampones (descritos en el protocolo) -Procedimiento: 1- Fijar en glutaraldehído al 1.6% en tampón cacodilato 0.1 M pH 7.4. 2 horas. Tampón cacodilato: - Cacodilato sódico........ 2.14 g. - Cloruro de calcio......... 0.05 g. - Agua destilada hasta .. 100 ml. Ajustar a pH 7.2-7.4 con HCl 1 N. 2- Lavar con tampón cacodilato sódico 0.1 M. 3- Tetróxido de Osmio (OsO4) al 1%, 1 h, 4ºC. 4- Lavar con tampón cacodilato + sacarosa 7.5%. 5- Deshidratación (a 4ºC): - Etanol 30% ................... 15 min. - " 50% ................... 15 min. - " 70% ................... 15 min. - " 80% ................... 15 min. - " 90% ................... 15 min. - " 100% ................... 15 min. (2 pasos). 36 6- Inclusión (a 4ºC): - Etanol/resina (3:1) ........... 60 min.(Este paso es prescindible) - " / " (1:1) ........... 60 min. - " / " (1:3) ........... 60 min. (este paso es prescindible) - Resina .......................... 12 horas (solamente la cantidad suficiente para cubrir las células). 7- Polimerizar a 60ºC, 12 horas. * Nota: 1.- Se puede sustituir el tampón cacodilato por el PBS. 2.- En ningún paso las células pueden quedar secas. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA OBSERVACIÓN EN EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO: 1) Romper el frasco Rous y extraer la lámina de resina 2) Preparación de los extremos para el ultramicrotomo, dejando la superficie totalmente plana y los laterales formando una pirámide. 3) Recogemos las muestras del micrótomo y observamos una parte que nos interese en el microscopio óptico 4) Retallamos para obtener la preparación de la zona deseada 5) Recogemos las muestras, que tienen que ser de un tamaño apropiado para que no sobresalgan de la rejilla. 6) Observar al microscopio electrónico Ultramicrotomo Maquina cortadora de vidrios, que son utilizados como cuchillas para el ultramicrotomo Microscopio electrónico 37 - Resultados: Célula apoptótica Nucleolos en los que se distinguen los centros fibrilares (menos densa) y la granular (mas densa) y los componentes fibrilares densos, que son las zonas mas densas a los electrones 38 Desmosomas: son uniones célula-célula, mediadas por cadherinas. Es raro en células en cultivo, pero típico de las MCF7 Mitocondria Membrana nuclear en la que se observan los complejos del poro 39 Mitocondria Célula en la que se observan los complejos de poro Mitocondrias de muy distintas morfologías. Se observan gran cantidad de componentes del citoesqueleto 40 Experimento 10: ENSAYO COMETA: - Introducción. El Ensayo Cometa, es un método que permite extraer el ADN de la célula para evaluar los daños presentes en él. Ha dado luz sobre la relación existente entre las afectaciones que puede sufrir el material genético y la aparición de enfermedades como el cáncer. Igualmente ha permitido apreciar las posibilidades reales que existen para la reparación de muchos de los perjuicios ocasionados al ADN. El método lleva consigo la introducción de agarosa en un portaobjetos para permitir el movimiento del ADN cuando se le expone a un campo eléctrico (electroforesis). Antes de someter las células a un campo eléctrico se hace un tratamiento con moléculas que rompan la membrana para que se pueda liberar el material genético. Para visualizar el resultado al microscopio se utiliza DAPI para teñir el ADN procedente del núcleo celular. Esta técnica nos permite hacer aproximaciones estadísticas y cuantificar el daño en el ADN. - Objetivos. Provocar daño en el ADN mediante agentes mutagénicos, y observación del resultado del ensayo cometa al microscopio óptico, para evaluar si se ha producido daño en el ADN. - Procedimiento 1.-Preparación de los portaobjetos. Se utilizan portaobjetos con borde esmerilado que se cubren con agarosa de punto de fusión normal preparada en agua destilada al 1% y disuelta en caliente. Los portaobjetos se dejan secar verticalmente y luego se guardan en la nevera. Duran hasta un mes desde su preparación. 2.-Inclusión de las células en agarosa. El número correcto de células oscila entre las 50000 y las 80000 por porta. Una vez contadas y depositadas en un tubo eppendorf se le añade 85 μl de agarosa de bajo punto de fusión preparada al 0,7% en PBS y mantenida en el baño María a 37ºC. La mezcla se deposita en el centro del porta, se coloca rápidamente un cubreobjetos largo (24 x 66 mm) y se deja gelificar en el frigorífico durante 10 minutos. Posteriormente se quita el cubre cuidadosamente y se añaden 75 μl de agarosa de bajo punto de fusión. De nuevo se coloca otro cubre y se deja gelificar 10 minutos. Quitar el cubre con cuidado y someter las células a la fase de lisis. 41 3.-Lisis de las membranas celulares. Se sumergen los portas en una solución de lisis de pH alcalino conteniendo 10mM Tris pH= 10, 2.5 M NaCl, 100mM Na2EDTA y 0.25 M NaOH a la que se le añade 1% (v/v) Tritón X-100 y 10% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO) justo en el momento de usarla. Los portas se pueden dejar en esta fase de lisis de 1 a 12 horas siempre a 4ºC. 4.-Pre-electroforesis y electroforesis. La cubeta de electroforesis debe estar fría, dentro de una bandeja con hielo o en una cámara de 4ºC, y se echa el tampón electroforético un poco antes de que termine la fase de lisis para que la temperatura de la solución sea de aproximadamente 12ºC. El tampón de electrforesis consiste en 1mM de Na2EDTA y 300 mM de NaOH (pH= 12.8). Se sacan las preparaciones de la solución de lisis y se colocan horizontalmente sin dejar espacios entre los portas en la cubeta de electroforesis previamente llenada. El tampón debe cubrir las preparaciones aproximadamente unos 2 mm. La fase de electroforesis es para permitir el desenrollamiento del ADN antes de que se sometan las células a la corriente eléctrica. Las preparaciones deben dejarse 20 minutos en la cubeta con el tampón frío. Transcurrido este tiempo se inicia la electroforesis en frío. Las condiciones de electroforesis son de 1V/cm y máximo de 300mA durante 20 minutos. El amperaje se regula con el volumen de tampón que cubre los portas, a más volumen mayor amperaje. 5.-Lavado de los portaobjetos. Al cabo de los 20 minutos se sacaron los portas y se colocaron horizontalmente sobre dos puntos de apoyo para no perder la capa de agarosa. Posteriormente se lavaron tres veces con tampón de neutralización 0.4 M Tris pH= 7.5. Cada lavado dura cinco minutos y es para eliminar las sales y detergentes que podrían interferir en la posterior tinción. 6.-Tinción de las preparaciones. Las preparaciones se pueden: a) teñir nada más acabarse la técnica. b) dejar secar las preparaciones y teñir después. c) Dejar secar las preparaciones y fijarlas en metanol absoluto durante cinco segundos; teñir después. Las células se tiñen con 50 μl del colorante elegido, que puede ser Bromuro de etidio (2 μg/ml en H2O destilada) o DAPI (5 μg/ml en H2O destilada), y se le coloca un cubre a cada preparación. Se ponen en cámara húmeda y se guardan a 4ºC. -Soluciones. 1.-Solución de lisis. Para un volumen total de 100 ml de tampón de lisis: 2.5 M NaCl ------------14.61 g Na2 EDTA--------------3.72 g 0.01 M Tris-------------0.12 g 0,25 M NaOH----------1 g 42 Añadir H2O destilada, ajustar a pH= 10 con HCl puro y completar al final hasta un volumen total de 1 litro con más H2O. Esta solución se esteriliza en el autoclave y se guarda a 4ºC. La solución de lisis se completa con DMSO y Tritón en el momento de ser usada y se coloca en el frigorífico para la lisis de las membranas. Para 100 ml: 89 ml tampón lisis 10 ml DMSO 1 ml Tritón X-100 2.-Tampón de electroforesis. Para un volumen total de 1.5 litros: 1mM de Na2EDTA----------0.555g 300mM de NaOH------------18.0 g Añadir H2O muy fría y ajustar a pH= 12.8 con HCl puro (hay que añadir como 20 ml). Completar al final hasta 1.5 litros y guardar en la nevera hasta que se ponga en la cubeta. 3.-Tampón de neutralización. Para un volumen de 50 ml: 0.4 M Tris---------------48.44 g Ajustar a pH= 7.5 y completar hasta 50 ml con H2O destilada. 4.-Geles de agarosa. A) Agarosa de bajo punto de fusión (LMA) al 0.7%: 0.035 g en 5 ml de PBS 1X; mantener a 37ºC B) Agarosa de punto de fusión normal (NMA) al 1%: 0.5 g en 50 ml de H2O destilada; mantener a 45ºC -Protocolo de trabajo con sangre completa: 1º.- Obtención de la muestra: Sacarse sangre del dedo con una lanceta estéril, unas 3 ó 4 gotas que hacen aproximadamente un volumen de 500 µl. Añadir 4,5 ml de tampón PBS 1X. 2º.- Tratamiento: Repartir la sangre en tubos eppendorfs, 500 µl en cada tubo. Un tubo será control y otro tratado con agente mutante. La dosis de m-Amsa es de 10 µM = 5 µM de m-Amsa 10-3 M en 500 µl de sangre. Incubar durante 1 / 2 hora a 37ºC. 43 3º.- Lavado: Coger de cada tubo 1 muestra de 50 µl y lavar con 300 µl de PBS. Centrifugar a 2000 rpm durante 7 min. Eliminar el sobrenadante con cuidado quedándose con el pellet rojo de eritrocitos y un poco de sobrenadante por encima, que es donde se depositan los leucocitos. 4º.-Inclusión: Dejar los tubos eppendorf en el baño a 37ºC. Mezclar las células con 60 µl de agarosa de bajo punto de fusión y mover un poco con la punta de la micropipeta pero sin hacer burbujas. Depositar la muestra sobre el centro de un porta previamente preparado con otra capa de agarosa y colocar un cubre y aplastar un poco. Dejar en el frigorífico durante 10 min. Al cabo de ese tiempo quitar el cubre con cuidado y añadir 75 µl de agarosa de bajo punto de fusión y volver a poner otro cubre. Dejar gelificar de nuevo 10 min. en el frigorífico; al cabo de ese tiempo quitar el cubre y colocar las preparaciones en la solución de lisis. Continuar la técnica como en el protocolo estandard. -Protocolo cometas en linfocitos. 1º.-Coger 6 gotas de sangre (500 µl) y mezclarlas con 3,5 ml de PBS. 2º.-Repartir en eppendorfs cada uno con 500 µl o 1 ml y dar el tratamiento correspondiente. 3º.-Una vez finalizado dicho tratamiento, coger 50 µl de sangre para cada porta y echarlo en otro eppendorf. 4º.-Añadir 250 µl de PBS para lavar el agente; centrifugar a 2000 rpm durante 7 minutos. 5º.-Eliminar el sobrenadante, hay que quedarse con el pellet y con un poco de sobrenadante justo por encima ya que ahí es donde se quedan los linfocitos. 6º.-Repetir esta operación (pasos 4 y 5). Al finalizar el lavado último, resuspender el pellet y colocar los eppendorf en el baño de 37ºC. 7º.-Añadir a cada eppendorfs aproximadamente 50 µl de agarosa de bajo punto de fusión, mezclar bien y depositar la mezcla sobre el porta colocando un cubre rápidamente. 8º.-Dejar enfriar 10 minutos en el frigorífico (4ºC). 9º.-Retirar el cubre con cuidado y volver a echar 75 µl de agarosa de bajo punto de fusión y poner otro cubre. 10º.-Dejar enfriar (4ºC) durante 10 minutos y volver a retirarlo con cuidado. 11º.-Poner las preparaciones en solución de lisis. 44 - Resultados obtenidos y discusión de resultados. * Cálculos de bleomicina y peróxido utilizado para realizar el daño. Bleomicina 1500 mU/ml * V = 15 mU/ml * 0,5 ml V = 5 * 10^-3 ml Peroxido de hidrógeno PM = 34 g/ mol M = Nº moles / l 60 µM = 34 / v V= 0,57µl 30% H2O2 0,57---- 100% X ---- 30% X = 0,171 µl 0,171 µl ----- 1000 ml X ------ 0,5 ml X= 8,55 * 10^-5 µl Diluimos 5 veces a 1/10 y al final cogimos 8,5 µl * Imágenes del ensayo cometa obtenidas en el microscopio óptico. Tras realizar la electroforesis de los portaobjetos con los linfocitos en agarosa se procedió a su visualización al microscopio electrónico. Se obtuvieron varias fotos de los diferentes portas: Control, Con bleomicina y con peróxido de hidrógeno. Las imágenes obtenidas las expongo a continuación: CONTROL Como se observa no existe daño o existe un pequeño daño basal en los linfocitos que no han sido tratados con agente mutágeno. El daño basal puede deberse a malos hábitos de vida tales como la consumición de tabaco. 45 LINFOCITOS TRATADOS CON BLEOMICINA Observamos una estela de ADN parecido a la cola de un cometa, ello nos indica que se ha producido daño en el ADN de la célula al ser tratadas con bleomicina, ello podemos deducirlo comparándolo con el control, en el cual no había una estela de ADN porque no se había producido daño. Ello esclarece que la técnica se ha realizado correctamente y que el resultado es positivo. LINFOCITOS TRATADOS CON PERÓXIDO DE HIDRÓGENO Observamos una estela de ADN indicándonos que se ha producido daño en el ADN de la célula al ser tratadas con peróxido de hidrógeno, ello podemos deducirlo comparándolo con el control, en el cual no había una estela de ADN porque no se había producido daño. A su vez, si comparamos las “colas” con el caso de tratamiento con bleomicina, las colas con tratamiento de peróxido de hidrógeno son más pequeñas, por lo que podemos deducir que con las cantidades utilizadas den cada mutágeno, la bleomicina causa mayor daño en el ADN que el peróxido de hidrógeno. 46