IA-MBA-PT-010 Escherichia coli O157:H7 en carne molida
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LANASEVE Rige a partir de: 15/06/11 Código: IA-MBA-PT- 010 Escherichia coli O157:H7 en carne molida y cortes de carne bovina usados en la preparación de carne molida y carne molida mezclada con otras carnes o productos de pollo. Versión 08 Página - 1 - de 11 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Coordinador Técnico de Sección Aprobado por: Jefe de Sección 1. Objetivo Disponer de un método para detectar la presencia de Escherichia coli O157:H7 en carne bovina. 2. Alcance Para aplicar en muestras de carne molida, cortes de carne bovina usados en la preparación de carne molida y carne molida mezclada con otras carnes o productos de pollo. 3. Responsabilidad y Autoridad Jefe de Sección: velar por el cumplimiento de las normas establecidas en este procedimiento. Coordinador Técnico de Sección: velar por el cumplimiento de las normas establecidas en este procedimiento. Analistas de laboratorio: realizar el ensayo según lo descrito en este procedimiento. 4. Definiciones No aplica 5. Abreviaturas y/o Siglas CTS m+n: Caldo Tripticasa de soya modificado + Novobiocina y Casáminoacidos 6. Referencias y/o Bibliografía IA-MBA-PE-009 Manejo de la muestra IA-MBA-PE- 015 Control de calidad de reactivos IA-MBA-PE-009-RE-012 Hoja de trabajo: Análisis de Escherichia coli O157:H7 SEG-PE- 005 Control de medios de cultivo USDA/FSIS Microbiology Laboratory Guidebook Online, capítulos 5A.02 y 5.05 (01/10/10) Instrucciones para la identificación de enteropatógenos con el sistema api 20E Instrucciones de Reveal Microbial Screening Test para E.coli O157:H7 NEOGEN ® Instrucciones de Dynal Anti-E.coli O157 ® Instructivo Kit prueba de látex RIM E. coli O157:H7 REMEL Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 15/06/11 Código: IA-MBA-PT- 010 Escherichia coli O157:H7 en carne molida y cortes de carne bovina usados en la preparación de carne molida y carne molida mezclada con otras carnes o productos de pollo. Versión 08 Página - 2 - de 11 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Coordinador Técnico de Sección Aprobado por: Jefe de Sección Instructivo Kit Shiga Toxina Premier EHEC Cat. # 608096 Meridian ® Instructivo Guía DuPont Qualicon BAX System 7. Descripción del procedimiento 7.1 Fundamento Teórico La muestra a analizar se le agrega un caldo de enriquecimiento selectivo que contiene los nutrientes necesarios para la supervivencia y multiplicación para E. coli O157:H7 así como un antibiótico para su selectividad. Después se realiza una prueba tamiz de PCR, por medio del BAX System y el kit BAX ® ® E. coli O157:H7 MP según instrucciones del fabricante. Opcionalmente se puede usar una prueba con dispositivo de flujo lateral, donde la muestra atraviesa una zona que contiene anticuerpos específicos conjugados con partículas coloidales. Si los antígenos de E.coli O157: H7 están presentes en la muestra se unirán estos por medio de una reacción antígenoanticuerpo y este inmunocomplejo se unirá a los anticuerpos anti E.coli O157: H7 que se encuentran en la zona de reacción y se formará un precipitado visual. A las muestras con reacción positiva se les realiza una prueba de separación inmunomagnética y luego se cultiva en medios selectivos y diferenciales para el aislamiento y posterior confirmación bioquímica, serológica y confirmación de Toxina/Gen. 7.2. Equipo, materiales, reactivos, kit y antisueros, medios de cultivo 7.2.1 Equipo Balanza electrónica sensibilidad 0.1 g Incubadora 35 ºC 2 ºC Incubadora 42 ºC 1 ºC Stomacher Micropipeteador 20 µl - 200 µl Mezclador de muestras Dynal MX4 Concentrador de partículas magnéticas Dynal ( MPC)S Pipeteador eléctrico Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 15/06/11 Código: IA-MBA-PT- 010 Escherichia coli O157:H7 en carne molida y cortes de carne bovina usados en la preparación de carne molida y carne molida mezclada con otras carnes o productos de pollo. Versión 08 Página - 3 - de 11 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Coordinador Técnico de Sección Aprobado por: Jefe de Sección ® Equipo BAX System Microcentrífuga 7.2.3 Materiales y reactivos Bolsas plásticas para stomacher 7 ½ x 11 ¾ pulg (ancho x largo) con cierre de alambre Pipetas de 5 ml Puntas para micropipeta 20 µl -200 µl Asas de Drigalski Asas bacteriológicas api 20 E ® Kit de prueba de flujo lateral Reveal E. coli O157 NEOGEN ® Kit prueba de látex RIM E. coli O157:H7 REMEL Kit Shiga Toxina Premier EHEC Cat. # 608096 Meridian ® Kit BAX System PCR E. coli O157:H7 MP (Qualicon # 17720673) Microesferas paramagnéticas recubiertas con anticuerpos anti E. coli O157 (Dynal # 710.04 ) PBS con Tween 20 Tubos eppendorff 1,5 ml estériles 7.2.4 Medios de cultivo Caldo Tripticasa de soya modificado con novobiocina + casáminoacidos (CTS m+n) Agar Rainbow O157 + Telurito de Potasio y Novobiocina de Sodio Agar Tripticasa de soya con sangre de oveja al 5 % 7.2.5 Cepas de referencia E. coli génerica ATCC 25922 E. coli O157: H7 ATCC 700728 no toxigénica Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada Elaborado por: Jefe de Sección LANASEVE Rige a partir de: 15/06/11 Código: IA-MBA-PT- 010 Escherichia coli O157:H7 en carne molida y cortes de carne bovina usados en la preparación de carne molida y carne molida mezclada con otras carnes o productos de pollo. Versión 08 Página - 4 - de 11 Revisado por: Coordinador Técnico de Sección Aprobado por: Jefe de Sección 7.3 Procedimiento 7.3.1 Realizar el manejo de la muestra según lo establecido en el procedimiento IA-MBA-PE-009. 7.3.2 Pesar 325 g 32. 5 g de muestra y agregarle 975 19.5 ml de CTS m+n para una dilución 1:4. Agitar en stomacher por 2 minutos y seguir paso 7.3.3. Alternativamente pesar 5 muestras de 65 g 2 g cada una en bolsa plástica estéril. Agregar 585 ml de caldo CTS m+n a cada bolsa para una dilución 1:10. Agitar en stomacher por 2 minutos. Seguir paso 7.3.3 7.3.3 Incubar de 15 a 22 horas a 42ºC 1ºC. Incluir un control positivo (E. coli O157: H7 ATCC 700728), uno negativo (E. coli ATCC 25922) y un medio sin inocular. 7.3.4 ® A partir de la muestra diluida 1:4 hacer la prueba de PCR BAX E.coli O157:H7 MP siguiendo instrucciones del fabricante. Si se usa el dispositivo de flujo lateral seguir instrucciones del fabricante Reveal E. coli O157 NEOGEN. Si usa la muestra diluida 1:10 se debe tomar 5 ml de CTS m+n de cada bolsa de stomacher ® colocarlos en un recipiente estéril hacer la prueba de PCR BAX E.coli O157:H7 MP siguiendo instrucciones del fabricante. Si se usa el dispositivo de flujo lateral seguir instrucciones del fabricante Reveal E. coli O157 NEOGEN. 7.3.5 Hacer la prueba anterior de tamizaje a los controles. 7.3.6 Las muestras que den negativo la prueba de PCR BAX o con el dispositivo de flujo lateral se ® reportan como E. coli O157:H7 Ausencia en 325 g. 7.3.7 ® Las muestras que dan un resultado inválido o indeterminado en la prueba de PCR BAX se puede: -repetir la prueba con la opción de reanalizar del sistema BAX® -preparar nuevos tubos de BAX® y repetir el análisis de PCR -realizar la prueba de flujo lateral Reveal E. coli O157 NEOGEN 7.3.8 Si el resultado es negativo reportar como lo descrito en el punto 7.3.6, si es positivo pasar al punto 7.3.10 y reportar según apartado 7.4.1 a) 7.3.9 Si el control positivo da un resultado negativo, indeterminado o una señal de error en la prueba de PCR BAX , esto afecta el set de muestras que se analizó por lo que se puede: Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 15/06/11 Código: IA-MBA-PT- 010 Escherichia coli O157:H7 en carne molida y cortes de carne bovina usados en la preparación de carne molida y carne molida mezclada con otras carnes o productos de pollo. Versión 08 Página - 5 - de 11 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Coordinador Técnico de Sección - repetir la prueba con la opción de reanalizar del sistema BAX Aprobado por: Jefe de Sección ® ® - preparar nuevos tubos de BAX y repetir el análisis de PCR - realizar la prueba con el dispositivo de flujo lateral Reveal E. coli O157 NEOGEN 7.3.10 Los caldos CTS m+n que dieron positivo a la prueba de tamizaje se les realiza la prueba de separación inmunomagnética de acuerdo a las instrucciones (anexo1) y se siembra en agar Rainbow O157. 7.3.11 Incubar las placas a 35 ° C 2° C por 24-26 horas 7.3.12 Lectura de las placas: - Colonias típicas E. coli O157:H7 : crecimiento de colonias negras o grises - Las colonias de E. coli O157: H7 pueden presentar una tonalidad azulada si están rodeadas de colonias color rosado o magenta. Nota: Si no hay colonias típicas reincubar las placas por 6- 24 horas a 20 ºC– 24ºC y reexaminar la placa. 7.3.13 A las colonias sospechosas aisladas, si es posible una por submuestra (5 por muestra) hacer ® prueba de látex RIM E. coli O157 REMEL de acuerdo a instrucciones del fabricante.(anexo 2) ® 7.3.14 Si la prueba látex RIM E. coli O157 REMEL es positiva rayar las colonias sospechosas en agar sangre de oveja al 5%. Incubar a 35 ºC 2 ºC por 16 -24 horas. 7.3.15 De acuerdo al resultado , reportar de la siguiente manera: a) Si el resultado de la prueba es negativo se reporta como ausencia en 325 g b) Si el resultado es positivo se reporta según el apartado 7.4.1 b). 7.3.16 A partir de las colonias en agar sangre realizar las siguientes pruebas: 1) Bioquímica api 20 E ® ® 2) Prueba de látex RIM E. coli H7 REMEL siguiendo las instrucciones del fabricante. 3) Determinación de Shiga toxinas I y II por la prueba Premier EHEC Cat. # 608096 Meridian de acuerdo a instrucciones del fabricante.( anexo 3) 4) Determinación por PCR de los genes para Shiga Toxina; el cual se llevará a cabo en laboratorio de Referencia INCIENSA del Ministerio de Salud. Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 15/06/11 Código: IA-MBA-PT- 010 Escherichia coli O157:H7 en carne molida y cortes de carne bovina usados en la preparación de carne molida y carne molida mezclada con otras carnes o productos de pollo. Versión 08 Página - 6 - de 11 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Coordinador Técnico de Sección Aprobado por: Jefe de Sección 7.4 Reporte de resultados 7.4.1 Reportar de la siguiente forma: a) Positivo potencial: Si presenta reacción positiva en la prueba de tamizaje. b) Positivo presuntivo: Si se aíslan colonias típicas en el agar Rainbow O157 y da prueba positiva con antisuero O157. c) Presencia en 325 g: Si la cepa es identificada bioquímicamente como E. coli, es confirmada como O157 y presenta al menos uno de los siguientes criterios. a) Producción de Shiga toxina b) Positivo para genes Shiga toxina c) Se determina que genéticamente es H7 7.5 Control de Calidad 7.5.1 El control de calidad de los medios de cultivo utilizados se debe llevar a cabo de acuerdo al procedimiento SEG-PE-005. 7.5.2 Realizar control de calidad a cada lote de reactivos críticos utilizados, según el procedimiento IA-MBA-PE-015 de control de calidad de reactivos. 7.5.3 Toda la información generada por el análisis de la muestra se registra en el formulario IA-MBAPE-009-RE- 012 Hoja de trabajo: Análisis de Escherichia coli O157:H7 8. Anexos Anexo1. Diagrama de prueba Dynal® Anti-E.coli O157. Anexo 2. Instructivo de prueba de serología E.coli O157:H7 Remel. Anexo 3. Shiga Toxina Premier EHEC Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada Elaborado por: Jefe de Sección LANASEVE Rige a partir de: 15/06/11 Código: IA-MBA-PT- 010 Escherichia coli O157:H7 en carne molida y cortes de carne bovina usados en la preparación de carne molida y carne molida mezclada con otras carnes o productos de pollo. Versión 08 Página - 7 - de 11 Revisado por: Coordinador Técnico de Sección Aprobado por: Jefe de Sección Anexo 1 Uso de Dynabeads Anti- E.coli O157 Remover el plato magnético del concentrador de partículas magnético Dynal ( MPC-S) y colocar en la gradilla tubos eppendorf de 1,5 ml. estériles. Agregar 20 ul de Dynalbeads Anti-E.coli O157 (que previamente han sido resuspendidas por vortex) a cada tubo eppendorf que se vaya a usar. Agregar a cada tubo eppendorf 1 ml de muestra. Hacer lo mismo con el control positivo y negativo Agitar por 10- 15 minutos a temperatura ambiente en el mezclador Dynal MX4 Colocar el plato magnético en la gradilla del MPC-S. Invertir los tubos eppendorf varias veces. Dejarlos reposar por 3 minutos Sin quitar el plato magnético de la gradilla del MPC-S elimine el sobrenadante de los tubos eppendorf. Quitar el plato magnético de la gradilla del MPC-S agregar a los tubos eppendorf 1 ml de PBS con Tween 20. Invertir varias veces para resuspender Poner el plato magnético a la gradilla del MPC-S. Dejar los tubos eppendorf reposar por 3 minutos. Sin quitar el plato magnético de la gradilla del MPC-S elimine el sobrenadante de los tubos eppendorf. Quitar el plato magnético de la gradilla del MPC-S y agregar a los tubos eppendorf 1 ml de PBS con Tween 20. Invertir varias Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada Elaborado por: Jefe de Sección LANASEVE Rige a partir de: 15/06/11 Código: IA-MBA-PT- 010 Escherichia coli O157:H7 en carne molida y cortes de carne bovina usados en la preparación de carne molida y carne molida mezclada con otras carnes o productos de pollo. Versión 08 Página - 8 - de 11 Revisado por: Coordinador Técnico de Sección Aprobado por: Jefe de Sección Poner el plato magnético a la gradilla del MPC-S. Dejar los tubos eppendorf reposar por 3 minutos Sin quitar el plato magnético de la gradilla del MPC-S elimine el sobrenadante de los tubos eppendorf Quitar el plato magnético de la gradilla del MPC-S y agregar a los tubos eppendorf 500 ul de PBS con Tween 20. Agitar en vortex. Seguir los pasos 1, 2, 3 en su orden. 2 Hacer dilución 1:10 con (01 del complejo Beads-bacteria ) y 0.9 de PBS Tween 20. (Si se requiere se puede hacer dilución 1:100) 3 1 Centrifugar por 2 minutos el remanente y descartar el sobrenadante. Agregar 0.1ml PBS Tween 20, resuspender Colocar 0.1 ml de complejo Beads-bacteria. Con asa de Drigaski estéril rayar las placas de MACS –CT. Seguir instrucciones del procedimiento MBA-PT-010. E. coli O157 Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 15/06/11 Código: IA-MBA-PT- 010 Escherichia coli O157:H7 en carne molida y cortes de carne bovina usados en la preparación de carne molida y carne molida mezclada con otras carnes o productos de pollo. Versión 08 Página - 9 - de 11 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Coordinador Técnico de Sección Aprobado por: Jefe de Sección Anexo 2 Diagrama Serología E. coli O157:H7 remel Para la muestra y los controles positivo y negativo, depositar una gota de E. coli O157 Test Latex en círculos separados de la lámina desechable que provee el fabricante. A su vez en un círculo aparte se deposita una gota del Control de Látex (sólo para la muestra) Usando un palito desechable o una asa remover una porción de las colonias sospechosas y emulsionar en el círculo que contiene la gota de E. coli O157 Test Latex. Hacer el mismo procedimiento con el círculo que contiene el Control de Latex. Depositar una gota del control positivo y una del negativo en los círculos correspondientes que contengan una gota de E. coli O157 Test Latex Mezcle bien por rotación por un minuto. La prueba es positiva si hay aglutinación Si la cepa aglutina tanto con el E.coli O157 Test Latex y el Control Latex se hace una suspensión de la cepa en solución Salina al 1 de McFarland y se hierve por 10 minutos. Se toma 30-50 ul de la suspensión y se vuelve a realizar la prueba para O157 Si la cepa aglutina tanto con el E.coli O157 Test Latex y el Control Latex y es bioquímicamente E. coli se envía a un laboratorio de referencia. Si aglutina solo con el E. coli O157 Test Latex. Si hay aglutinación con el E.coli O157 Test Latex y no con el Control Latex se reporta como positivo para E. coli O157. Se procede a rayar las colonias en agar sangre. Incubar 18 a 24 h a 35 °C. Repita el test pero esta vez usando E. coli H 7 Test Latex en lugar del E.coli O157 Test Latex. El Control Latex es omitido en este paso Una aglutinación indica presencia de E. coli H7. La prueba se reporta positivo para E. coli O157:H7. Si no aglutina con H7 hacer pasajes de la cepa en medio motilidad y repetir la prueba. Si la cepa no aglutina con H7 se reporta E. coli O157/NM Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 15/06/11 Escherichia coli O157:H7 en carne molida y cortes de carne bovina usados en la preparación de carne molida y carne molida mezclada con otras carnes o productos de pollo. Versión 08 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Coordinador Técnico de Sección Código: IA-MBA-PT- 010 Página - 10 - de 11 Aprobado por: Jefe de Sección Anexo 3 Prueba Premier EHEC Shiga Toxina I y II E.coli O157 Separar el # de micropocillos requeridos para la muestras y 1 para el control positivo y uno para el control negativo. Colocarlos en la tira de micropocillos y registrar su posición Colocar varias colonias sospechosas del agar sangre en 200 ul de diluente Premier EHEC. Agitar vortex 15 segundos . Tomar 100 ul de la dilución de las colonias y agregarlo al micropocillo que corresponda. Para los controles positivo y negativo colocar 2 gotas de cada uno en los micropocillos rotulados para tal fin. Mezclar bien durante 30 segundos agitando en forma circular Sellar los micropocillos e incubar durante una hora a temperatura ambiente ( TA ). Desechar el contenido de los micropocillos y lavar 5 veces con buffer de lavado 1X Añadir a cada micropocillo 2 gotas de anticuerpo de detección mezclar agitando circularmente por 30 segundos. Sellar los micropocillos e incubar a TA por 30 minutos Desechar el contenido de los micropocillos y lavar 5 veces con bufer de lavado 1X Sellar los micropocillos e incubar a TA por 30 minutos Desechar el contenido de los micropocillos y lavar 5 veces con buffer de lavado 1X Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada Elaborado por: Jefe de Sección LANASEVE Rige a partir de: 15/06/11 Escherichia coli O157:H7 en carne molida y cortes de carne bovina usados en la preparación de carne molida y carne molida mezclada con otras carnes o productos de pollo. Versión 08 Revisado por: Coordinador Técnico de Sección Código: IA-MBA-PT- 010 Página - 11 - de 11 Aprobado por: Jefe de Sección Añadir 2 gotas de la solución sustrato. Mezclar por agitación circular por 30 segundos Añadir 2 gotas de conjugado enzimático a cada micropocillo. Mezclar por agitación circular por 30 segundos Incubar por 10 minutos a TA. Añadir 2 gotas de solución de parada y leer la reacción dentro de los 15 minutos después de añadir la solución de parada Negativo: Incoloro Positivo: Amarillo definido Si se presenta un color amarillo poco visible se evalúa por espectrofotometría a 450 nm contra blanco de reactivos: Negativo: OD < 0,180 Positivo : OD > 0,180 Preparación de la solución de lavado 1X Hacer dilución 1:20 del tampón de lavado 20X II. Preparar el volumen necesario de acuerdo al Nº de muestras. La solución de lavado 1X es estable por 3 meses a temperatura ambiente. Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada
