Clase 16 Las plantas como biorreactores.doc

Agrobiotecnología.
Clase 16: Las plantas como biorreactores
Las plantas como biorreactores
Transparencias 3-7
La palabra biorreactor se relaciona habitualmente con los sistemas de producción de
proteínas recombinantes basados en fermentadores bacterianos. Sin embargo, la
mayor parte de las moléculas recombinantes de uso médico comercializadas en la
actualidad, son obtenidas en cultivos de células eucariotas. Esto se debe a las
dificultades técnicas que suelen aparecer cuando se intenta expresar un gen de origen
eucariota en un sistema procariota. La ausencia de modificaciones post-traduccionales
y el plegamiento incorrecto de los polipéptidos sintetizados, pueden transformarlos en
productos inactivos o que forman agregados insolubles cuyos costos de purificación y
renaturalización no son sostenibles. Además, aunque las líneas celulares permiten la
síntesis de proteínas eucariotas en un sistema similar al de origen, implican un alto
costo inicial para su obtención y grandes inversiones adicionales cuando se requiere
incrementar la escala de producción. Ambos sistemas emplean personal técnico
especializado y conllevan grandes riesgos económicos en caso de que ocurran
contaminaciones en la línea de producción, tanto si el contaminante es patogénico o
no para la salud humana. La búsqueda de sistemas de producción alternativos para la
síntesis de moléculas recombinantes en forma económica y segura condujo a la
exploración de las plantas como posibles biorreactores.
La principal ventaja de las plantas como sistema de producción es la disponibilidad
prácticamente ilimitada de biomasa que puede obtenerse utilizando la infraestructura
existente para la siembra, cosecha, almacenamiento y procesado de los cultivos. Esto
hace que el capital de inversión inicial y el costo del aumento en la escala de
producción sean relativamente bajos. Además, el volumen de producción es
extremadamente flexible y puede adaptarse rápidamente a las demandas del mercado
incrementando o disminuyendo la superficie sembrada. Por otra parte, no hay riesgos
de contaminación con patógenos animales o endotoxinas bacterianas y puede
aprovecharse el conocimiento previo de los sistemas de molienda y extracción en las
primeras etapas del proceso de purificación. Una ventaja adicional es que las plantas
permiten el almacenamiento estable de la proteína recombinante en semillas y
tubérculos, facilitando su conservación, transporte y distribución. Los mecanismos de
síntesis y secreción de proteínas y las modificaciones post-traduccionales son las
propias de las células eucariotas y permiten la producción y ensamblado de proteínas
multiméricas como por ejemplo, anticuerpos. Además, gozarían de una mayor
aceptación pública que la utilización de animales transgénicos.
Los costos de producción de proteínas recombinantes en distintos sistemas de
expresión han sido comparados en diversos estudios. Aunque las inferencias hechas
en cada caso son diferentes, en todos se demuestra que, a menos que los niveles de
expresión sean excesivamente bajos, los costos de producción en plantas son
generalmente inferiores a los de otros sistemas (transparencia 6). Los valores para la
producción de proteínas recombinantes en cultivos de la línea celular CHO, fluctúan
entre los 200 y los 2.000 U$S/g de proteína, dependiendo del rendimiento y de
factores operacionales. Asimismo, la producción de anticuerpos en hibridomas alcanza
costos de casi 5.000 U$S/g de proteína. Por el contrario, en una evaluación económica
completa para la producción de la enzima -glucuronidasa en semillas de maíz, se
calculó un costo de 43 U$S/g de enzima purificada, incluso con un nivel de expresión
tan bajo como el 0,015% de las proteínas solubles totales (% PST). Algunas
estimaciones consideran inclusive que, incrementando los niveles de expresión a
valores de entre el 0,5% y el 1% de las proteínas totales, los costos de producción en
plantas pueden reducirse a menos de 0,2 U$S/g de proteína recombinante.
Elementos a considerar en una estrategia de expresión
Transparencias 8-24
La optimización de los niveles de producción de la proteína recombinante puede
lograse siguiendo diversas estrategias (transparencia 9). La elección de una
determinada estrategia o la combinación de varias de ellas, dependerá de las
características de la proteína a sintetizar, de la especie vegetal utilizada y de las
necesidades del proceso de producción. Generalmente, es difícil predecir cual de
estos aspectos tendrá mayor peso para una proteína particular. Ello requiere, por lo
tanto, ensayar múltiples variables hasta alcanzar las mejores condiciones para un
procedimiento de producción determinado. Los elementos a tener en cuenta son la
elección del sistema de expresión y del germoplasma a transformar y el uso de
herramientas moleculares para el diseño de las construcciones que contengan las
secuencias de las proteínas a expresar.
Las características y el costo del proceso de purificación dependerán de las
propiedades de cada proteína recombinante y del sistema vegetal que se utilice para
la producción (transparencia 10). Más del 85% del costo de producción de una
proteína recombinante depende del proceso de purificación. En este sentido, las
plantas poseen ventajas propias que permiten reducir ampliamente estos valores, a
través de la expresión directa en tejidos comestibles, la rizosecreción o la acumulación
en tubérculos o semillas, lo que permite restringir el volumen inicial del tejido a extraer.
La utilización de sistemas de expresión integrativos permite la obtención de líneas
estables de plantas en las que la información genética introducida se transmite a las
generaciones sucesivas. Sin embargo, diversos factores que no pueden ser
controlados precisamente mediante el diseño de la construcción, conducen a una
expresión variable del transgen y en algunos casos a su completa inactivación. Tales
factores incluyen el sitio de integración, la estructura del locus transgénico, el número
de copias, y la presencia de copias truncadas o re-arregladas del transgen así como a
los mecanismos de silenciamiento génico transcripcional y postranscripcional
asociados a los factores antes mencionados. Aunque se están investigando formas de
mejorar la localización genética para eliminar estos efectos de posición, en la práctica
el desarrollo de plantas transgénicas comerciales requiere el análisis de una gran
cantidad de eventos de transformación para identificar variaciones fenotípicas y
agronómicas que determinen rendimientos económicamente viables. Es así como en
los últimos años se ha comenzado a explorar la transformación de cloroplastos, en los
que el alto número de copias del plastoma por organela y el número de cloroplastos
por célula conduciría, una vez lograda la homoplastía, a un potencial incremento de los
niveles de expresión de la proteína recombinante. Además, como en muchas especies
vegetales los cloroplastos son heredables sólo por vía materna, su ausencia en el
polen provee una efectiva contención biológica frente al riesgo de transmisión
horizontal a especies silvestres relacionadas. Una de las desventajas más importantes
de la transformación de cloroplastos es la carencia de modificaciones posttraduccionales (sin embargo, se ha observado la formación eficiente de puentes
disulfuro). Tanto en el caso de la transformación nuclear como de la plastídica, existen
técnicas de eliminación de los marcadores de selección. Aunque en el caso de las
plantas utilizadas como biorreactores, es poco probable que éstas ingresen a la
cadena alimentaria, esto agregaría un nivel más de seguridad ante riesgos eventuales
derivados de los mismos. La transparencia 11 enumera las principales ventajas y
limitaciones de los sistemas integrativos.
Los sistemas de expresión no integrativos o de expresión transitoria se basan en la
utilización de vectores virales o la técnica de agroinfiltración. Pese a que son más
rápidos de desarrollar, estos sistemas tienen aún poca difusión práctica debido a las
limitaciones generadas por la necesidad de infectar o infiltrar plantas en cada ciclo de
producción, los problemas de inestabilidad genética de los transgenes, el desarrollo de
síntomas y la alta tasa de silenciamiento que generan las infecciones virales. Aunque
existen formas de subsanar algunas de estas dificultades, como por ejemplo la
infección de plantas que expresen supresores del silenciamiento o la coinfección con
otros virus, estos sistemas son mayormente utilizados como una forma rápida para
probar una construcción genética antes de proceder a la transformación estable. La
transparencia 12 enumera las principales ventajas y limitaciones de los sistemas no
integrativos.
Un ejemplo interesante de la aplicación de los vectores virales para la expresión de
biofármacos, es la utilización del Tobacco mosaic virus (TMV) para la producción de
anticuerpos personalizados contra linfomas humanos. La estrategia se basa en el
hecho de que cada clon maligno de células B expresa una inmunoglobulina de
superficie única que constituye un marcador específico para cada paciente. Aunque la
producción de hibridomas que expresen inmunoglobulinas específicas es posible, el
proceso es largo, costoso y poco seguro. La utilización de un vector viral permite
obtener en pocas semanas cantidades de fragmentos Fv de simple cadena (scFv) de
cada anticuerpo a partir del gen específico para cada linfoma.
Los niveles de expresión de una proteína recombinante dependen de diversos
factores, entre ellos la combinación y utilización adecuada de las regiones reguladoras
de la transcripción y la traducción. Un ejemplo ilustrativo se muestra en la
transparencia 13. En este trabajo, en el que se evaluó la expresión de anticuerpos de
cadena simple en semillas de Arabidopsis thaliana, la utilización del promotor
constitutivo 35S del Cauliflower mosaic virus (CaMV) condujo a una expresión de la
proteína recombinante del 1% del total de las proteínas solubles (TPS), mientras que
al utilizar el promotor de la arcelina de Phaseolus vulgaris se obtuvo un orden de
diferencia en los niveles de expresión y hasta un 36% TPS en semillas cuando se
sustituyó por el promotor de la -faseolina. Asimismo este trabajo muestra que la
secuencia 5’ no traducida del gen de la arcelina de Phaseolus vulgaris es más
eficiente para incrementar los niveles de expresión que la secuencia enhancer
traduccional omega del TMV. La utilización de promotores tejido-específicos como los
de arcelina y -faseolina que dirigen la expresión en semillas, tiene la ventaja adicional
de que al limitar la expresión a determinados tejidos, evitan la exposición de la
proteína recombinante a herbívoros, insectos polinizadores y microorganismos de la
rizosfera, así como los efectos adversos de la expresión de la proteína recombinante,
si los hubiera, sobre el crecimiento y desarrollo de las partes vegetativas de la planta.
Una estrategia comúnmente utilizada para reducir los costos de purificación consiste
en acumular la proteína sintetizada en el espacio extracelular o apoplasto. El
transporte al apoplasto se logra fusionando el extremo amino terminal de la proteína
de interés a un péptido señal que determina el transporte de la proteína al retículo
endoplásmico y de allí a la vía de secreción. Estos tipos de péptidos señal se hallan
ampliamente conservados en su función y son procesados en forma co-traduccional
por una peptidasa específica presente en el lumen del retículo endoplásmico. Como el
apoplasto está en contacto directo con el medio que rodea las raíces, si la planta es
crecida en un sistema hidropónico, la proteína recombinante se acumulará en este
medio por rizosecreción, facilitando así el proceso de purificación puesto que el
número de proteínas totales secretadas es generalmente bajo. Si además la solución
que circula en torno a la rizósfera se renueva constantemente, puede desarrollarse un
sistema continuo de extracción de la proteína recombinante.
En la transparencia 15 se muestra un ejemplo en el que se utilizó la rizosecreción para
la producción de la xilanasa de Clostridium thermocellum en plantas de tabaco. En la
construcción genética utilizada en la transformación, la secuencia codificante de la
xilanasa se fusionó a la secuencia señal del inhibidor de la proteinasa II de tabaco,
bajo el control del promotor 35S del CaMV. La presencia de la proteína recombinante
secretada en la rizosfera se determinó mediante un ensayo de actividad, en el que el
RBB-xilano, un sustrato de color azul, es hidrolizado por la enzima. El halo de
degradación más claro, observado alrededor de las raíces de la planta transformada, y
ausente en el control no transgénico muestra la actividad de la xilanasa rizosecretada.
Las xilanasas son enzimas que se utilizan ampliamente en las industrias de fabricación
del papel, pulpa, textil y de alimentación animal. La enzima proveniente de C.
thermocelum tiene un óptimo de actividad a 70oC. La transparencia 16 muestra un
caso similar de rizosecresión. En este caso, las plantas de tabaco han sido
transformadas con una construcción que permite acumular factor de crecimiento
epidérmico humano a nivel del apoplasma.
Otra estrategia que permite reducir los costos de purificación se basa en la fusión de la
proteína de interés a una oleosina (transparencia 17). Las oleosinas son proteínas
pequeñas que se encuentran insertadas en la monocapa de fosfolípidos que
constituyen los cuerpos grasos. Estas proteínas se acumulan en las semillas de las
plantas oleaginosas a niveles elevados. En colza, representan entre el 8 y el 20% del
total de las proteínas de la semilla y son inducibles por estrés osmótico, ácido
jasmónico y ácido absícico. La construcción genética mostrada en la transparencia 17
incluye una secuencia de reconocimiento específica para una proteasa. Una vez
realizada la purificación, la proteína de interés se rescata de la fusión por tratamiento
con la proteasa que reconoce esta secuencia peptídica.
La purificación de la proteína fusionada a oleosinas es sumamente sencilla y permite
concentrar varias veces el producto de interés (transparencia 18). Básicamente,
consiste en el procesado y homogeneización del material vegetal (semillas de la planta
oleaginosa) seguido de una centrifugación en que se separan las fases acuosa y
lipídica. Esta última, que contiene los cuerpos grasos con la proteína de fusión es
separada, resuspendida y tratada con la proteasa que reconoce la secuencia que
permite liberar la proteína recombinante. La suspensión es luego centrifugada para
separar nuevamente la fase acuosa de la lipídica. La proteína de interés se concentra
así en la fase acuosa, la cual se utilizará para su purificación posterior.
La hirudina, que se obtiene de las glándulas salivales de la sanguijuela Hirudo
medicinalis, es uno de los más potentes inhibidores de trombina conocidos y se utiliza
en medicina como anticoagulante. En el trabajo que se resume en la transparencia 19,
se transformaron plantas de Brassica napus con una construcción en la cual la fusión
de la oleosina y la hirudina están bajo el control de un promotor de oleosina de
Arabidopsis thaliana, especie emparentada con B. napus. Los niveles de expresión
alcanzaron el 1% del total de las proteínas solubles de la semilla. Luego de la
purificación por centrifugación y flotación, se midió la actividad anti-trombina en un
ensayo colorimétrico. En el gráfico de barras puede observarse como la actividad de la
trombina decae cuando se incuba con la fase acuosa luego del tratamiento con la
proteasa (factor Xa) que permite liberar la hirudina de los cuerpos grasos. El panel de
la derecha de la transparencia 19 muestra la inmunolocalización de la hirudina unida a
los cuerpos grasos y cómo la misma es liberada por el factor Xa para pasar a la fase
acuosa. Las transparencias 20 a 22 ilustran la producción de insulina humana
mediante fusión a oleosinas en plantas transgenicas de cártamo. Este trabajo fue
desarrollado por la empresa canadiense SemBiosys.
Uno de los factores críticos a tener en cuenta cuando se diseña una estrategia de
expresión en plantas es la elección de la especie vegetal a transformar. Muchas veces
la elección se hace sobre la base de la experiencia previa en un cultivo en particular
sin tener en cuenta cuál será el destino final de la proteína sintetizada, sus
características intrínsecas y las necesidades de producción, lo que puede conducir al
fracaso de la estrategia de expresión. La transparencia 23 enumera las principales
ventajas asociadas a distintas plantas que se han utilizado para la producción de
proteínas heterólogas. Algunas de estas especies, como es el caso de Lemma, han
sido propuestas como particularmente apropiadas para su utilización como
biorreactores.
Una de las diferencias más importantes en las modificaciones post-traduccionales
entre plantas y animales es el patrón de N-glicosilación (transparencia 24). Las
proteínas recombinantes humanas sintetizadas en plantas tienden a incorporar grupos
carbohidratos del tipo (1,2)-xilosa y (1,3)-fucosa, los cuales están ausentes en
mamíferos y carecen de los residuos terminales galactosa y ácido siálico (ácido Nacetilneuranímico) encontrados en muchas proteínas nativas humanas. La unión de
carbohidratos a un polipéptido afecta sus propiedades físico-químicas, incluyendo su
resistencia a la desnaturalización térmica, degradación proteolítica y solubilidad, y sus
funciones biológicas esenciales, tales como su inmunogenicidad, su actividad
específica y sus interacciones ligando-receptor. Aunque algunos trabajos han
demostrado que los anticuerpos expresados en sistemas vegetales conteniendo
glicanos específicos de plantas, no son inmunogénicos en mamíferos y que las
proteínas recombinantes expresadas en otros sistemas animales (incluyendo células
en cultivo de mamífero como las CHO de ovario de hamster chino) presentan
diferencias en los patrones de glicosilación respecto del humano, el uso terapéutico
seguro impone producir proteínas con las mismas características. Por ello, se ha
volcado un gran esfuerzo en diseñar estrategias que permitan la “humanización” de las
proteínas sintetizadas en plantas. Estas incluyen: a) expresión de la (1,4)galactosiltransferasa humana en plantas transgénicas para la producción de
anticuerpos recombinantes con glicanos extendidos en galactosa; b) retención de la
proteína en el retículo endoplásmico (la diferenciación en los patrones de glicosilación
entre plantas y mamíferos ocurren a nivel del aparato de Golgi); c) inactivación de la
(1,3)-fucosiltransferasa y la  (1,2)-xilosiltransferasa de plantas.
La transparencia 25 enumera las principales aplicaciones en las que se han utilizado
plantas como biorreactores. Cada una de estas aplicaciones será ilustrada con
ejemplos en las transparencias siguientes.
Aplicaciones. Expresión de antígenos para la producción de vacunas
Transparencias 26-39
El desarrollo de las vacunas a subunidades conlleva un margen de seguridad
considerable, pues implica la utilización de sólo una parte del patógeno. Ello permite
eliminar los riesgos asociados a la producción de las vacunas basadas en agentes
atenuados o relacionados, los que pueden mutar y volverse infecciosos y que son
particularmente relevantes en casos de inmunosupresión por malnutrición o
enfermedades como el SIDA. Sin embargo, las vacunas a subunidades no son
eficaces para generar una respuesta inmune por vía oral y deben ser inyectadas en
todos los casos. Esto conduce a un aumento de su costo final, lo que limita su
distribución en países en desarrollo, donde las enfermedades infecciosas son
precisamente las de mayor importancia epidemiológica. Una de las aplicaciones más
prometedoras de las plantas como biorreactores es su potencial uso para la
producción de antígenos en tejidos comestibles, lo que combinaría las ventajas de las
vacunas orales con las de las vacunas recombinantes. A su potencial bajo costo de
producción se sumaría la necesidad de requerimientos relativamente simples para su
distribución y administración. La expresión en tejidos de almacenamiento, en los que
las proteínas son estables a temperatura ambiente, permitiría obviar la necesidad de
establecer y mantener una cadena de frío, otra de las limitaciones económicas
importantes para la distribución de las vacunas en muchas regiones geográficas del
mundo. Aunque el desarrollo de este tipo de vacunas tendría un enorme impacto en
las poblaciones de los países pobres, es posible que, debido a la complejidad de las
regulaciones involucradas en su desarrollo, éstas estén disponibles primero para su
uso en salud animal. La transparencia 27 enumera estas y otras ventajas que podrían
derivar de la producción de vacunas de este tipo.
La producción de proteínas antigénicas en el tejido vegetal brindaría la posibilidad de
protegerlas mejor de la degradación en el ambiente del tracto gastrointestinal, un
requerimiento crítico para desarrollar una vacuna oral exitosa. El vehículo vegetal
utilizado no debe generar una respuesta inmune por sí mismo y el antígeno no debe
generar tolerancia. Hasta la fecha, se ha expresado en plantas un número
considerable de antígenos y, en por lo menos cuatro casos, se están realizando
ensayos clínicos en humanos con resultados promisorios. Esto abre la perspectiva de
que las vacunas orales de este tipo puedan desarrollarse en un futuro cercano.
Aunque en un principio se pensó utilizar tejido vegetal sin procesar para la vacunación
oral, las variaciones en el nivel de expresión del antígeno en un cultivo determinado, y
la necesidad de controlar la dosis ingerida en forma precisa, han llevado a plantear la
producción de cápsulas de tejido liofilizado obtenidas a partir de un homogenato del
cultivo (transparencia 28). Esto permite un dosaje preciso de la dosis a administrar y,
en algunos casos, utilizar compuestos naturalmente presentes en las plantas a modo
de adyuvantes.
La hepatitis B es una viremia persistente de amplia distribución mundial que se
transmite por vía sexual y sanguínea. Causa hepatitis aguda y crónica que puede
derivar en complicaciones que van desde disfunción hepática y cirrosis hasta
hepatocarcinoma y muerte. Dado el limitado rango de huéspedes de este virus
(humanos y chimpancés) y la dificultad para su propagación en cultivos celulares, las
primeras vacunas estuvieron basadas en la purificación del antígeno de superficie
(HBsAg) a partir sueros de pacientes infectados. El HBsAg, una glicoproteína de 24
kDa, es capaz de formar partículas virales vacías altamente inmunogénicas. La
producción del HBsAg en levaduras por métodos de ingeniería genética condujo al
desarrollo de una de las primeras vacunas recombinantes. Sin embargo, esta vacuna
debe administrarse por inyección y requiere una cadena de frío eficiente durante su
transporte, lo que hace que su costo sea inaccesible para una gran parte de la
población mundial.
Existen diversos trabajos en los que se procura optimizar la expresión de HBsAg en
plantas. Para que el procedimiento sea viable en términos económicos, se requieren
altos niveles de expresión del antígeno recombinante y, en lo posible, preservar su
capacidad de formar partículas seudovirales. Por ello, el objetivo perseguido en la
mayoría de los trabajos es incrementar la acumulación de HBsAg en el tejido vegetal.
La transparencia 30 ejemplifica la importancia de seleccionar secuencias reguladoras
apropiadas para obtener altos niveles de expresión de la proteína recombinante.
Además del promotor y de los enhancers traduccionales, que fueran mencionados
previamente, también es importante la elección de la región terminadora. En el caso
que se ilustra, los mayores niveles se alcanzaron utilizando una secuencia 3´ no
codificante de un gen de Solanum tuberosum. Cuando este terminador es
reemplazado por uno proveniente de un gen de soja o por el del gen de la nopalina
sintetasa de Agrobacterium tumefaciens (uno de los más ampliamente utilizados) los
niveles de expresión caen notablemente. La incorporación de secuencias de
exportación al retículo endoplásmico o a la vacuola mostró un menor efecto sobre los
niveles de expresión que el atribuido al terminador.
La transparencia 31 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. Los
trabajos de inmunización de animales con HBsAg producido en plantas representaron
la primera etapa para estudios posteriores en humanos. La respuesta inmune
generada en ratones alimentados con tubérculos crudos de la línea transgénica de
Solanum tuberosum HB114-16 se comparó con la respuesta generada por la vacuna
recombinante comercial. Tanto cuando se utilizó el antígeno producido en papa para
inmunizar primariamente los ratones, como cuando se lo utilizó para inmunizar ratones
previamente tratados con la vacuna comercial, los títulos de anticuerpos fueron
superiores a los logrados con el antígeno purificado de levaduras. Esto sugiere que, en
el caso del antígeno obtenido en plantas, existe una protección conferida por el
vehículo vegetal que le permitiría resistir mejor la degradación en el tracto digestivo
respecto del antígeno obtenido de levaduras.
La transparencia 32 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. La
gráfica muestra como la respuesta inmune inducida por el antígeno expresado en
tubérculos, disminuye en forma notable al eliminar el adyuvante utilizado en los
esquemas de inmunización o al cocinar los tubérculos previamente para incrementar
su palatabilidad. Es importante destacar que a pesar de esta disminución la respuesta
sigue siendo cercana a la obtenida con el antígeno expresado en levaduras (175
mIU/mL). Como ya se mencionó, esta dificultad puede subsanarse al utilizar liofilizados
del material vegetal crudo para la inmunización, sin embargo, se está explorando la
posibilidad de expresar el HBsAg en tejidos vegetales que normalmente se consumen
crudos, como las hojas de lechuga (trabajo que se presenta en la siguiente
transparencia) y frutos, como tomates o bananas.
Esta transparencia 33 ilustra un ensayo de inmunización oral en humanos realizado en
base a hojas de lechuga que expresaban el HBsAg. En dos de los tres voluntarios
inmunizados con las hojas de las plantas transgénicas, hubo respuesta protectiva
(más de 10 mIU/mL) luego de la segunda dosis de inmunización. Aunque esta
respuesta decae luego de 12 semanas, estos resultados introducen la posibilidad de
desarrollar una vacuna contra HBV basada en un vegetal comestible. En ninguno de
los dos voluntarios que ingirieron hojas de plantas no transformadas hubo respuesta
inmune.
La amplia distribución mundial de las diarreas provocadas por distintos tipos de
agentes bacterianos y virales, especialmente en los niños de los países no
desarrollados, impone la necesidad de desarrollar una vacuna eficaz y de bajo costo.
La mayor parte de los trabajos desarrollados en esta dirección han sido realizados
utilizando tres antígenos principales: la toxina LT-B de la Escherichia coli enterotóxica,
la toxina CT-B de Vibrio cholerae y la cápside del virus Norwalk.
La enterotoxina de Escherichia coli esta formada por 6 monómeros de la subunidad A,
las que ingresan a las células epiteliales del intestino e inician los cambios metabólicos
que conducen a la pérdida de agua y 5 monómeros de la subunidad B (LT-B),
enzimáticamente inactivas. Estas subunidades forman un pentámero que se une a los
gangliósidos GM1 en las membranas de las células epiteliales y contribuyen al
transporte de la subunidad A activa, pero no son tóxicas en forma aislada. En el
trabajo que se ilustra en la transparencia 35, se transformaron plantas de Solanum
tuberosum con una construcción que lleva la secuencia codificante de la subunidad B
bajo el control transcripcional del promotor 35S del Cauliflower mosaic virus (CaMV).
La secuencia 5’ no traducida pertenece al Tobacco etch virus (TEV) y el terminador es
el del gen de la proteína de almacenamiento vegetativo de soja (VSP). Se inmunizaron
voluntarios humanos con tres dosis de tubérculos crudos de papas transgénicas que
expresan el antígeno LT-B y se midió la respuesta inmune en mucosas, suero y heces.
Los gráficos de la transparencia 35 muestran la respuesta de las células secretoras de
IgG e IgA en la mucosa intestinal. Estas células secretan anticuerpos específicos,
aparecen en la circulación aproximadamente 7 d después de la inmunización oral y no
son detectables luego de 14 d. La presencia de estas células 7 a 10 d después de la
inmunización refleja la respuesta positiva del sistema inmune intestinal.
La transparencia 36 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. En las
mediciones de la respuesta inmune realizadas en suero y heces, se consideraron
positivos aquellos individuos que mostraron aumentos de al menos 4 veces en el título
de anticuerpos luego de la inmunización. La tabla muestra aumentos de al menos 50%
en el nivel de IgA y de más del 90% en el nivel de IgG en los individuos tratados. En
todos los individuos positivos, los títulos de IgG se mantuvieron altos hasta 59 d luego
de la ingestión de la primera dosis. Se observó que el contenido de LT-B en las papas
ingeridas no correlaciona con la duración o tasa de respuesta en suero o heces y que
incrementos en la dosis en rangos de 2 a 3 veces no incrementaron la respuesta en
este grupo de voluntarios. El gráfico inferior muestra el fuerte incremento en el título de
anticuerpos neutralizantes en los voluntarios que consumieron papas transgénicas.
El virus Norwalk es el principal agente causal de gastroenteritis no bacteriana en
humanos. Se contagia a través de los alimentos y el agua y de persona a persona. La
expresión en células de insectos de la cápside viral (NVCP), una proteína de 58 kDa,
forma partículas virales vacías que carecen de ARN. Estas partículas, formadas por 90
dímeros de la NVCP, son morfológica y antigénicamente similares a las auténticas
partículas virales y son seguras e inmunogénicas cuando se administran a voluntarios.
En el trabajo que se ilustra en la transparencia 37, se utilizaron tubérculos de papas
transgénicas que expresan la cápside viral en un ensayo de inmunización realizado en
voluntarios humanos. El tratamiento generó un incremento particularmente alto de IgA
en mucosas. Aunque las respuestas en suero y heces fueron moderadas, los autores
plantean que las mismas podrían incrementarse aumentando la dosis de antígeno
administrada, ya que sólo una pequeña proporción de las moléculas de la cápside viral
se ensamblan para formar partículas virales en los tubérculos.
Se han expresado múltiples antígenos en distintos sistemas vegetales. Los ejemplos
que se presentan en la tabla de la transparencia 39 constituyen sólo una pequeña
parte de los datos disponibles. Debe destacarse que, además de los tres casos
mencionados que se encuentran ya en fase clínica, se han publicado ensayos en
humanos alimentados con hojas de espinaca infectadas con un vector viral que
expresa determinantes antigénicos del virus de la rabia fusionados a la cápside del
Alfalfa mosaic virus (AMV).
Aplicaciones. Producción de anticuerpos
Transparencias 40-46
Los anticuerpos séricos de mamíferos están constituidos por dos cadenas pesadas y
dos cadenas livianas, unidas entre sí por puentes disulfuro. El extremo amino terminal
de las cuatro cadenas es variable y determina la especificidad, reconocimiento y unión
al antígeno. En mamíferos se producen cinco clases de inmunoglobulinas (G, M, A, D
y E) con distintas propiedades efectoras. Los anticuerpos secretorios son más
complejos que sus contrapartes en suero. Son dímeros de los anticuerpos séricos
unidos por un componente adicional llamado cadena de unión o J. Además, hay un
polipéptido extra, el componente secretorio, que protege al anticuerpo de la acción de
proteasas. Las fuentes tradicionales de anticuerpos son los hibridomas, líneas de
células B murinas que son inmortalizadas por fusión a un mieloma. Al igual que en
otros sistemas basados en células en cultivo, los costos de establecimiento,
mantenimiento y aumento en la escala de producción son altos. El 14% de los
tratamientos clínicos actuales requieren anticuerpos y sólo 4 moléculas ocupan casi el
75% de la capacidad de producción actual. Se calcula que hay más 100 anticuerpos
monoclonales en investigación con probabilidades de ser incorporados al mercado en
los próximos años, lo que superaría ampliamente la capacidad de producción actual.
Estas perspectivas han promovido la búsqueda de otros sistemas de producción de
anticuerpos. Al ser moléculas que requieren el ensamblaje de varias subunidades, su
expresión en bacterias es extremadamente difícil. Por otra parte, y aunque se investiga
su producción en animales transgénicos, tanto la fase de desarrollo como el aumento
en la escala de producción son lentos en este sistema, dependiendo del ciclo normal
de crecimiento y cría de los animales. La producción de estas moléculas complejas en
plantas transgénicas resulta una alternativa sumamente promisoria. El ensamblaje
final in planta se logra por cruzamiento genético de las plantas transgénicas
precursoras que producen cada una de las subunidades. La transparencia 41 presenta
un esquema de este proceso.
Uno de los ejemplos más avanzados de expresión de anticuerpos en plantas es el
caso de una IgA secretoria utilizada en la profilaxis de Streptococcus mutans, el
principal agente causal de la caries dental. El antigeno AgI/II interviene en la
interacción hidrofóbica entre S. mutans y un complejo de glicoproteínas de alto peso
molecular presente en la superficie dental. La estrategia planteada consiste en aplicar
el anticuerpo en forma tópica, luego del tratamiento con un agente antiséptico, para
evitar la recolonización de nichos por S. mutants. Se diseñó una estrategia en la que
plantas de tabaco transformadas con cada uno de los componentes de la IgA
secretoria (cadenas pesadas y livianas, componente secretorio y cadena J) se
cruzaron entre sí para obtener una planta que expresa los cuatro componentes
ensamblados como una inmunoglobulina secretoria. La transparencia 43 muestra un
esquema de la estrategia mencionada.
Esta transparencia 44 muestra el mecanismo de acción del anti AgI/II. La aplicación
tópica del anti AgI/II actúa al alterar la dinámica de repoblación de los nichos presentes
en la superficie dental. El procedimiento consiste en eliminar toda la flora dental con un
antiséptico, la clorohexidina, y en aplicar posteriormente el anticuerpo anti-AgI/II, de
modo tal que la flora normal no patogénica pueda repoblar los nichos desplazando a
Streptococcus mutants.
La transparencia 45 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. Los
gráficos muestran los resultados de la inmunización local con el anticuerpo anti-AgI/II
expresado en plantas. Se tomó como 100% el número de bacterias presentes antes
del tratamiento antiséptico con clorohexidina (CHX) y se siguió la dinámica de
repoblación de Streptococcus mutants luego de la eliminación de la flora oral. Se
observó que el título de S. mutants en placas y en saliva aumenta en los individuos
control (tratados con solución salina o con un anticuerpo no relacionado), mientras que
en los individuos a los que se aplicó el anticuerpo anti AgI/II murino o el producido en
plantas se mantuvo sin cambios.
La transparencia 46 presenta un listado de algunos anticuerpos que han sido
expresados en plantas. El listado no es exhaustivo y es posible contabilizar ya una
extensa serie de ejemplos en este campo.
Aplicaciones, Producción de proteínas de interés farmacológico y medicinal
Transparencias 47-55
La transparencia 50 muestra un ejemplo de transformación de plantas de tabaco con
una construcción que lleva la secuencia codificante del factor estimulante de
granulocitos y macrófagos humano (hGM-CSF) bajo el promotor y la secuencia señal
del gen de la gluteína de arroz Gt1. La gluteína es una proteína que se expresa
normalmente en el endosperma de la semilla de arroz. Los niveles de hGM-CSF
alcanzados en semilla se cuantificaron en un ensayo de ELISA en los transformantes y
en la generación F1. Además de expresarlo en plantas transgénicas, otros grupos han
explorado con éxito la posibilidad de producir hGM-CSF en el medio de cultivo de
suspensiones celulares de tabaco.
La transparencia 51 muestra los resultados de un trabajo en que se evaluó la actividad
biológica del hGM-CSF recombinante en extractos de semillas transgénicas por su
capacidad de inducir la proliferación de células TF-1 humanas (una línea celular que
sólo crece en presencia de medio suplementado con hGM-CSF). La figura muestra
que el factor sintetizado en semillas de tabaco posee una actividad biológica
comparable al factor comercial, lo que indica que es funcional y que mantiene una
conformación adecuada para interactuar con el receptor de hGM-CSF. Nótese que al
suplementar el medio de cultivo con el hGM-CSF comercial y con un extracto de
plantas no transformadas se observa menor proliferación. Esto sugiere que en el
extracto vegetal existe algún factor que inhibe la actividad de hGM-CSF, y que la
actividad biológica o la potencia del factor expresado en semillas de tabaco podría
haber sido subestimada en este ensayo.
El factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF) maduro es un péptido pequeño no
glicosilado de 6 kDa que posee un amplio rango de tejidos blanco y que se utiliza en
los tratamientos de úlceras gastrointestinales y como tópico en la reparación de tejido
epitelial dañado por quemaduras. La transparencia 52 ilustra la expresión de hEGF en
plantas de tabaco y mediante la utilización de un vector viral derivado del Potato virus
X. Se diseñaron dos versiones del vector viral: en una de ellas la expresión de hEGF
es citoplasmática y en la otra hEGF es fusionado al péptido señal de AP24, una
osmotina de tabaco, lo que permite el envío de la proteína recombinante al retículo
endoplasmático y de éste al espacio extracelular o apoplasto. En ambos casos, la
transcripción del gen de hEGF está dirigida por una duplicación del promotor
subgenómico de la cápside viral. Se utilizaron extractos de plantas infectadas con el
virus recombinante para infectar plantas de Nicotiana tabacum. La versión viral que
dirige el factor al apoplasto permite alcanzar un nivel de 0,015% del total de las
proteínas solubles. En cambio, en las plantas infectadas con la versión citoplasmática
del virus, los niveles de hEGF están por debajo de los límites de detección del ensayo
de ELISA (1 ng/g de tejido fresco).
La transparencia 53 muestra los resultados obtenidos al expresar hEGF en plantas
transgénicas. Se siguió la misma estrategia de expresión que se describe en la
transparencia anterior. Se observa nuevamente que la localización de la proteína
transgénica en el apoplasto resultó crucial para lograr buenos niveles de acumulación.
Los niveles obtenidos con una construcción que permite la exportación al espacio
apoplástico son varios órdenes mayores que los observados en las plantas
transformadas con dos versiones citoplasmáticas. No se detectaron diferencias
significativas en los niveles de expresión de hEGF al utilizar el promotor 35S nativo del
Cauliflower mosaic virus (p35EGF) o una versión mejorada del mismo (p35S(L)EGF),
ni al incorporar la secuencia enhancer traduccional omega del Tobacco mosaic virus.
La transparencia 54 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. Se
realizaron dos ensayos de actividad biológica para demostrar que el hEGF producido
en tabaco tiene propiedades comparables a las del péptido comercial. Las células del
cumulus que rodean al ovocito responden al hEGF aumentando su tamaño. Se
observó que estas células responden de manera similar al tratarlas con extractos de
plantas transgénicas o con el producto comercial. No se observaron efectos en
experimentos control realizados con medio sin suplementar, con extractos de plantas
no transformadas, o con extractos de plantas infectadas con Potato virus X no
recombinante. El panel de la derecha muestra dos ensayos para determinar la cinética
de unión de hEGF a su receptor en membranas de placenta humana. Tanto en el caso
de los extractos de las plantas trangénicas, como en el caso del hEGF purificado a
partir de las plantas infectadas con el vector viral apoplástico, la cinética de unión fue
comparable a la generada por el hEGF comercial.
La tabla de la transparencia 55 muestra sólo algunos ejemplos de las proteínas de
interés farmacológico y medicinal que se han expresado en distintos sistemas
vegetales. Nuevas estrategias de expresión y nuevas proteínas son evaluadas año
tras año. Algunas revisiones recientes se presentan en las referencias, sin embargo se
recomienda consultar periódicamente las actualizaciones de las mismas.
Otras aplicaciones. Producción de enzimas de interés industrial, suplementos
alimenticios y biopolímeros
Transparencias 56-73
La primera proteína recombinante producida en plantas que se comercializó fue la
avidina de pollo expresada en maíz (transparencia 59). La estrategia de expresión
tiene en cuenta varias de las recomendaciones mencionadas en las primeras
transparencias: optimización de codones, uso de promotor específico de
monocotiledóneas, incorporación de un intrón, envío al apoplasto y secuencias 3’
específicas. Con estas consideraciones se obtuvo un 2,3% del total de las proteínas
solubles del grano.
La transparencia 60 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. La
producción de avidina en semillas de maíz permitió almacenar la proteína transgénica
por períodos de tiempo prolongados, sin que se observaran pérdidas significativas en
la actividad de la misma. El gráfico superior muestra la actividad de la avidina extraída
de semillas de maíz almacenadas a distintas temperaturas en períodos de hasta 3
meses. La comercialización de la avidina requirió de un análisis exhaustivo de las
características de la misma en comparación con la proteína sintetizada en el sistema
de origen. Algunos de los parámetros comparados se muestran en la tabla inferior.
Otro tema de gran interés para la utilización de plantas como biorreactores es la
producción de plásticos biodegradables como sustitutos de los derivados del petróleo.
Mientras que estos últimos permanecen decenas de años en el medio ambiente, los
plásticos degradables producidos por algunas bacterias pueden ser degradados en
términos de meses. El polihidroxibutirato (PHB) es un miembro de una clase de
polímeros termoplásticos llamados polihidroxialcanoatos que sirven a muchas
bacterias como moléculas de almacenamiento intracelular de carbono y energía. La
síntesis a partir de acetil CoA se realiza en tres pasos, catalizados por enzimas
codificadas por los genes phbA, phbB y phbC. El PHB constituye una fuente renovable
de material termoplástico biodegradable, aunque el proceso de obtención por
fermentación en tanques es todavía demasiado caro en relación a los plásticos
derivados del petróleo. La posibilidad de producir grandes cantidades de biomasa,
llevó a encarar la producción en plantas como una alternativa a esta situación. Aunque
los niveles de acumulación en vegetales no son todavía satisfactorios, se continúa
trabajando activamente en esta dirección.
En uno de los primeros trabajos publicados sobre síntesis de PHB en plantas, se
generaron plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana para los genes phbB y phbC
bacterianos. Estas plantas se cruzaron para obtener una descendencia que expresa la
vía metabólica completa de síntesis de PHB. La primer enzima de esta vía, la 3cetotiolasa, ya está presente en el citoplasma de A. thaliana, formando parte de la vía
de síntesis de isoprenoides. Aunque se observó la acumulación de gránulos de PHB,
la expresión del gen phbB provocó una severa reducción en el crecimiento y en la
producción de semillas respecto de las plantas no transformadas. En un intento por
aumentar los niveles de expresión de PHB, se dirigió su síntesis a los cloroplastos de
A. thaliana. Nuevamente, y aunque hubo un incremento en la producción (hasta un
4% del peso fresco), éste estuvo acompañado por una reducción en el crecimiento y la
aparición de hojas cloróticas. En trabajos más recientes, se exploró la posibilidad de
utilizar otras plantas, como tabaco y papa, y de incorporar promotores inducibles en un
intento por eliminar o reducir los efectos deletéreos de la expresión constitutiva de
estos genes. Sin embargo, los niveles de PHB alcanzados son aún demasiado bajos
para que el producto sea económicamente competitivo. Las transparencias 64-68
ilustran algunos de los trabajos desarrollados para expresar PHB en plantas.
La producción de proteínas heterólogas en plantas presupone medidas especiales de
bioseguridad y controles adecuados de inocuidad alimentaria. En principio, la mayor
parte de los riesgos potenciales podría controlarse adecuadamente si la producción se
realiza en cultivos restringidos a invernaderos o recintos cerrados. Para el caso de
moléculas que requieran una gran producción de biomasa y por lo tanto deban ser
cultivados en el campo, lo recomendable es utilizar especies vegetales que no
participan de las cadenas alimentarias humanas o animales. La transparencia 73
resume una serie de recomendaciones apropiadas para estos casos.