3 - Cultivo de tejidos.doc

Agrobiotecnología. Curso 2011
Micropropagación comercial
La micropropagación masiva en la práctica comercial
Transparencias 3-22
En los últimos 20 años, el conocimiento sobre cómo propagar plantas creció en forma
considerable. Sin embargo, no se han encontrado todavía métodos de producción a
gran escala para la propagación masiva de plantas diferentes al método clásico de
división de vástagos axilares. En la mayoría de las especies, esta técnica requiere una
intensa labor de mano de obra en todos los estadios del cultivo de tejidos,
especialmente en las etapas que requieren mayor manipulación: las etapas de
iniciación del cultivo in vitro (Etapa I) y de la división de macollos e introducción de los
plantines en recipientes con medio de cultivo semisólido (Etapa II). Estas tareas
originan altos costos de mano de obra y hacen de la micropropagación masiva un
proceso relativamente caro. A pesar de ello, las plantas micropropagadas siguen
teniendo ventajas. Estas son: a) generación de vástagos pequeños a partir de
pequeñas porciones de tejido vegetal (lo que economiza espacio físico); b) obtención
de plantas libres de microorganismos contaminantes; c) clonado de especies difíciles
de propagar vegetativamente; d) producción continua durante todo el año. La mayor
desventaja son los altos costos implicados en establecer rutinariamente una operativa
óptima de multiplicación en cada una de las especies y variedades de interés. Uno de
los mayores riesgos del proceso se localiza en la etapa de aclimatación y rusticación
de los plantines que provienen del cultivo in vitro.
No existen muchas empresas dedicadas a la micropropagación comercial, ya que
resulta más económico reproducir plantas por semilla botánica o por propagación
vegetativa (“macropropagación”). La posibilidad de utilizar micropropagación se ve
muchas veces limitada por los costos asociados a esta técnica. Algunas estimaciones
indican que, si se lograse un 50% de reducción en los costos, la micropropagación
masiva podría expandirse 10 veces respecto del volumen actual. Si la reducción de
costos alcanzara un 90%, el mercado potencial se tornaría 1.000 veces mayor
respecto del actual. Actualmente, la micropropagación masiva se focaliza en las
especies que presentan dificultades para su propagación por técnicas convencionales,
ya sea por su velocidad de crecimiento, por ser susceptibles a contaminaciones
microbianas o fúngicas, por requerir la eliminación de contaminaciones virales o por la
necesidad de obtener una gran cantidad de plantas homogéneas en un corto período
de tiempo.
Antes de emprender la clonación masiva, se deben considerar minuciosamente las
características del material vegetal inicial (plantas madre; transparencia 6). Este debe
ser óptimo, tanto desde el punto de vista fenotípico como sanitario. Un primer paso
obligatorio es establecer fehacientemente la ausencia de patógenos. Si no se pudiese
disponer de plantas madres sanas, existen varias estrategias efectivas para eliminar
las enfermedades y lograr iniciar la micropropagación a partir de explantos sanos. Las
características del explanto (meristemas, segmentos internodales, yemas,
organogénesis, embriogénesis) se decidirán de acuerdo con la especie en cuestión y
según los objetivos de la micropropagación. Deberá constatarse el aspecto
morfológico de los vástagos regenerantes, así como ausencia de contaminantes en el
medio de cultivo. Una vez establecida la estrategia de clonación, se procederá a
obtener plantínes completos, implementando la etapa de enraizamiento. Esta puede
efectuarse in vitro o ex vitro.
Murashige, profesor de la Universidad de California (Riverside) definió inicialmente las
tres etapas principales (Etapas I a III) de la multiplicación in vitro de plantas
(transparencia 7). Esta definición se ha adoptado ampliamente tanto en investigación
como en los laboratorios comerciales de cultivo de tejidos, ya que no sólo describen
los pasos del procedimiento sino que también definen los puntos en que debe ser
modificado el medio de cultivo. Deberg y Maene propusieron que el tratamiento y
preparación de las plantas madres sea considerado una etapa separada y que por lo
tanto sea llamada Etapa 0. Más tarde se definió la Etapa IV, en la cual las plantas son
transferidas al ambiente ex vitro. Si bien las etapas sirven como guía general, no son
aplicadas de manera rígida.
Si el objetivo es reproducir plantas idénticas a las seleccionadas, lo ideal es iniciar el
proceso con un tejido diferenciado como el meristema, los ápices caulinares o
segmentos internodales (transparencia 8). En la medida de lo posible, se trata de no
permitir la desdiferenciación de los tejidos, ya que ello aumenta la posibilidad de
variantes somaclonales. Se puede partir del meristema propiamente dicho (2-3 mm) o
aislar el meristema junto con los primordios foliares. Si solamente se cuenta con
plantas madres infectadas, es posible sanearlas mediante exposición de los
meristemas a altas temperaturas, o a sucesivos tratamientos con concentraciones
crecientes de agentes desinfectantes. Estos procedimientos pueden resultar letales
para porciones de tejido pequeñas, por lo que es conveniente realizarlos en paralelo
con segmentos más grandes (meristema más primordios foliares). Si se parte de una
planta sana factible de ser propagada por segmentos nodales, éstos se extraen y, se
exponen a agentes desinfectantes. Luego se cultiva el material in vitro y se procede a
su establecimiento y a su pasaje a la Etapa II.
La transparencia 9 muestra meristemas de caña de azúcar en crecimiento cultivados
en frascos separados para evitar la propagación de contaminaciones. De esta manera,
si algún explanto no ha sido correctamente desinfectado en la etapa inicial, se evita
que la contaminación alcance a otros explantos limpios. Las características de la
desinfección inicial implican una solución de compromiso entre lograr la eliminación de
todos los microorganismos externos y no dañar apreciablemente el explanto con el
agente desinfectante. El número ideal de explantos iniciales varía según la especie de
que se trate. Se tiene en cuenta la exposición a contaminantes, la supervivencia de los
tejidos a la desinfección y la tasa de multiplicación. Se parte de un número inicial
basado en la cantidad de plantines viables que quieran obtenerse en las etapas
posteriores. También ha de considerarse el estado fisiológico de la planta de la que se
extrae el tejido inicial.
Se puede considerar que el cultivo se ha establecido in vitro si se observa crecimiento
de tallos y de hojas. En este punto, la planta ha completado su desarrollo y es apta
para ser transplantada al medio de proliferación (Etapa II). En esta etapa, pueden
reunirse los plantines en recipientes comunes, aunque todavía es posible que afloren
contaminaciones tardías. Por lo tanto, conviene agrupar los plantines en números
pequeños e ir incrementando las cantidades en los pasajes sucesivos. La
transparencia 10 muestra un plantín de arándano ya desarrollado a los 30 días de
crecimiento in vitro.
La subdivisión (Etapa II) resulta sencilla para aquellas especies que pueden
micropropagarse mediante segmentos nodales, pero ofrece cierto grado de dificultad
en aquellas especies que crecen mediante regeneración adventicia de vástagos. En
este caso, la subdivisión debe ser realizada con criterio, dejando vástagos no muy
pequeños, capaces de dar origen a nuevos vástagos en el medio de cultivo donde van
a ser implantados. Un plantín separado de su macollo y de tamaño demasiado
pequeño, corre el riesgo de no proliferar y morir. Es en esta etapa que deben ajustarse
al máximo los tiempos de crecimiento y las tasas proliferativas de los plantines para
poder establecer un esquema productivo organizado. Este esquema debe satisfacer,
las necesidades del cliente en términos de cantidad y tiempos calendarios. Cabe
remarcar la importancia de los recaudos que se toman para asegurar condiciones
asépticas de trabajo, tanto desde el punto de vista ambiental como de los operarios
que realiza las subdivisiones. El incremento de la cantidad de plantines es geométrico
y un mínimo descuido en estos parámetros puede echar a perder toda una producción.
El escalado de la propagación debe realizarse en condiciones de absoluta esterilidad
(transparencia 11). Los vástagos o plantines en crecimiento son divididos para formar
vástagos individuales, que serán sembrados en un nuevo medio de cultivo. En la foto
de la transparencia se muestra la subdivisión de vástagos de arándano, una especie
que se propaga por segmentos internodales. Esto facilita una rápida multiplicación y
generalmente trae aparejada una alta productividad.
Es común emplear técnicas de micropropagación para multiplicar muchas especies
ornamentales, como el Syngonium rosado que se observa en la transparencia 12. Ello
se debe a que: a) permite eliminar bacterias endógenas de las plantas madres, lo que
facilita la propagación por macollos realizada habitualmente por los viveristas; b)
permite abastecer incrementos de la demanda, produciendo una gran cantidad de
plantas homogéneas en un período de tiempo relativamente corto; c) permite la
obtención de plantas más vigorosas. Esto se debe a la aparición de vástagos
adventicios que se van formando en cada nuevo subcultivo por la acción de las
citoquininas.
Además de una buena tasa proliferativa, se busca lograr calidad y homogeneidad en el
aspecto de los plantines que están siendo multiplicados (transparencia 13). Esto
puede realizarse mediante una observación minuciosa de todos los plantines en
crecimiento. Si el número de subcultivos in vitro es elevado, la observación visual
puede acompañarse por un muestreo al azar de plantines transferidos a condición ex
vitro para realizar observaciones fenotípicas y comparaciones con los parámetros
característicos de las plantas madre. La situación puede ser muy diferente para cada
especie. Por ejemplo, en el caso de la caña de azúcar, los subcultivos no pueden
superar los 6 ó 7, ya que es frecuente la aparición de variantes somaclonales en
cultivo in vitro.
La transparencia 14 muestra otras vías de obtención de plantines completos a partir de
tejidos diferentes de los meristemas, yemas apicales o yemas axilares. Esto puede
ocurrir a través de dos vías morfogéneticas: la morfogénesis directa o indirecta. En la
morfogénesis directa, el crecimiento del nuevo vástago se inicia desde segmentos de
hoja o pecíolos sin pasar previamente por un estadio de callo (células indiferenciadas).
Esto acarrea beneficios en términos de disminuir la aparición de variantes
somaclonales. Esta estrategia de clonado puede emplearse en distintas especies, de
acuerdo con su morfología y siempre que la planta se encuentre en buen estado
fitosanitario. En la morfogénesis indirecta, se forma primero un agrupamiento de
células sin diferenciación (llamado comúnmente callo), que es previo a la formación
del vástago. Tanto la concentración como el tipo de regulador de crecimiento presente
en el medio de cultivo, afectan el grado de aparición de variantes entre los
regenerantes. Una concentración elevada de auxinas sintéticas, como el 2-4D, o su
uso prolongado en el tiempo, puede originar variantes genéticas.
La transparencia 15 muestra un esquema de la vía morfogenética directa, por medio
de la cual los plantines se desarrollan sin que el tejido pase previamente por el estadio
de callo. Un ejemplo de esta vía es el desarrollo de vástagos a partir de nervaduras de
hoja. Esto genera una cantidad de plantines mayor a la que se obtiene por crecimiento
de yemas adventicias, lo cual permite acortar los tiempos del proceso de
multiplicación. La factibilidad de esta técnica depende de la morfología de la especie
en cuestión. La embriogénesis directa (o embriogénesis somática), permite obtener
plantines completos mediante un proceso similar al de la formación de embriones en
las semillas. Esta vía de morfogénesis ocurre mayoritariamente cuando se utilizan
explantos derivados del gametofito femenino. La tendencia de estos tejidos a generar
embriones somáticos adventicios es alta en aquellas plantas en que ocurre
naturalmente poli-embrionía, como es el caso de muchas variedades de Citrus y otros
géneros cercanamente relacionados. En el cultivo de anteras, donde el objetivo es la
obtención de plantas haploides, éstas pueden obtenerse directamente a partir del
polen por embriogénesis somática. La transparencia 16 muestra plantines de Begonia
rex obtenidos mediante morfogénesis directa. Los plantines se desarrollan a partir de
las nervaduras de las hojas, generando una gran cantidad de nuevos vástagos, sin
que el tejido haya pasado previamente por un estadio de callo.
En la morfogénesis indirecta, como se grafica en la transparencia 17, las células
diferenciadas de un explanto, son inducidas a dividirse como un agrupamiento
indiferenciado para luego reprogramarse hacia la formación de un órgano. A partir de
este callo, pueden originarse yemas adventicias que darán origen al plantín completo.
Un medio subóptimo puede prolongar la duración de la fase callosa antes de la
regeneración, y probablemente perturbe la mitosis en las células del callo para dar
origen a variantes. Esto podría ser una alternativa a utilizar en el caso en que se desee
obtener variantes somaclonales. En algunas especies, como Daucus carota, se
favorece el crecimiento desdiferenciado cultivando las células en medio líquido. Este
tipo de cultivos se denominan cultivos en suspensión. A continuación, se puede inducir
la formación de embriones somáticos modificando los reguladores de crecimiento o
introduciendo cambios físicos (luz/oscuridad). Los embriones somáticos son
estructuras bipolares que tienen un polo de crecimiento de vástago y otro de raíz. Los
embriones pueden originarse de una sola célula sin conexión vascular con los tejidos
maternos, o de una masa globular de tejido, dando origen luego a un plantín completo.
Los métodos que permiten la regeneración de plantas completas constituyen un
complemento indispensable de los métodos de transformación genética. Debido a que
la eficiencia de regeneración a partir de embriones somáticos es muy alta, esta vía es
utilizada muy frecuentemente en especies en que este proceso es ineficiente por otras
vías. La eficiencia de la etapa de regeneración incide directamente sobre el número de
plantas transgénicas que pueden recuperarse y tiene fuerte incidencia sobre la
viabilidad y reproducibilidad de un protocolo de transformación. Ejemplos típicos de
especies que han sido transformadas siguiendo esta vía de regeneración son el maíz,
la soja y la caña de azúcar. La transparencia 18 muestra el crecimiento diferencial en
medio selectivo de callos embriogénicos de caña de azúcar que han sido
transformados por técnicas de biobalística. El desarrollo de callos en este medio es
fuertemente indicativo de la presencia de callos transgénicos. El tejido pasará luego
por la etapa de desarrollo de embriones somáticos a partir de los cuales se
regenerarán plantines completos.
La transparencia 19 muestra un callo embriogénico de una especie dicotiledónea
(alfalfa), iniciando la regeneración. Para las dicotiledóneas, los pasos en la formación
de embriones somáticos son más marcados que para las monocotilidóneas, en las
cuales el callo embriogénico no siempre adquiere un aspecto que permita distinguirlo
frente al callo de crecimiento en masa no embriogénico. Para las dicotiledóneas, los
pasos en la formación de embriones somáticos comprenden: a) formación de proembriones de 6-8 células; b) estadio globular, formado por células que aún carecen de
características embrionarias; c) estadio de corazón, en que el aspecto del embrión es
trilobulado y los inicios cotiledonares se separan del polo radicular; d) estadio de
torpedo, donde se elonga el estadio anterior; e) embrión con clara diferenciación de
vástago y raíz. Los callos embriogénicos se desarrollan en un medio sin contenido de
auxinas. Sin embargo, la inducción de la embriogénesis requiere un medio de cultivo
con auxinas, pues estos reguladores estimulan la división celular y la formación de
embriones.
En la transparencia 20 se esquematiza la Etapa III del proceso de micropropagación,
en la que se inicia el enraizamiento y se muestran los distintos caminos que pueden
seguirse en la transición de in vitro a ex vitro. Hay especies que enraízan
espontáneamente in vitro, como es el caso de muchas ornamentales (por ejemplo,
begonias, Syngonium, Spathyphillum, Aloe que se observa en la transparencia 21),
mientras que otras deben ser inducidas a enraizar in vitro, con medios especiales de
enraizamiento, para luego ser transferidas a rusticación ex Vitro en sustrato (por
ejemplo, espárragos, caña de azúcar). Otras especies pueden no ser inducidas a
enraizamiento in vitro y llevarse sin raíz a condición ex vitro e inducir formación
radicular ya en el sustrato (por ejemplo, arándano). La inducción del enraizamiento
implica generalmente el uso de auxinas.
La rusticación-aclimatación de la planta (Etapa IV) es tal vez la etapa más crítica. El
desarrollo in vitro ya ha finalizado, como vemos en la transparencia 22, y ahora deben
procurarse condiciones adecuadas para la adaptación gradual a las condiciones ex
vitro. Las instalaciones requeridas para ello no implican costos elevados, pero es
fundamental el ajuste de las condiciones ambientales para que los plantines continúen
su crecimiento en una atmósfera no controlada. En algunas plantas (por ejemplo,
Malus, Prunus) los estomas de las hojas formadas in vitro comienzan a adquirir una
función normal durante la aclimatación en invernáculo. En otras plantas (por ejemplo,
Brassica) las hojas que no han desarrollado mecanismos efectivos de cierre de
estomas no logran recuperarse en la aclimatación. Respecto al desarrollo de raíces,
una buena inducción radicular contribuye a la aclimatación del plantín. Para establecer
un calendario apropiado de entregas de material, se deben establecer los tiempos
necesarios para que las plantas alcancen un tamaño comercial. Esto a su vez
determina el resto del esquema de producción, incluyendo las épocas convenientes de
plantación.
Costos versus productividad
Transparencias 23-32
Los costos de micropropagación están afectados por los siguientes factores: a) los
costos de instalación del laboratorio; b) los costos de mano de obra; c) los costos de
materiales e insumos; d) las características de la planta in vitro; e) las pérdidas
ocasionales que ocurran en las distintas etapas del proceso de producción (pérdidas
por contaminación, por hiperhidricidad irreversible; por falta de enraizamiento, por
muerte durante la aclimatación). Entre las características propias de la planta, se debe
considerar su facilidad para multiplicarse a lo largo del tiempo en condiciones de
cultivo. En el caso de plantas leñosas, se requiere un tiempo para rejuvenecer
parcialmente el cultivo y obtener así un crecimiento suficientemente rápido para
encarar la multiplicación. A su vez, la frecuencia con que puede ser multiplicado un
cultivo dependerá del número de nuevos vástagos producidos en cada subcultivo, así
como del intervalo de tiempo entre cada subcultivo. Otra característica a considerar es
si los vástagos necesitan ser enraizados in vitro o pueden hacerlo ex vitro.
El laboratorio de micropropagación a escala comercial implica una estructura
productiva mínima, con instalaciones que permitan el manejo de al menos unos 10.000
plantines diarios, una capacidad de albergar 1.000.000 de plantines por año en
cámaras de crecimiento y sistemas automatizados de control de fotoperíodo,
temperatura y humedad (transparencia 24). Estas instalaciones deben estar diseñadas
considerando la gran cantidad de recipientes contenedores de plantines que fluyen por
el laboratorio: esto implica pasillos aptos para desplazar carros y estantes con
medidas ajustadas para la ubicación de canastos que contengan los recipientes con
plantines. Es importante considerar que cada movimiento implica un tiempo y un
determinado riesgo de manipulación y que la calidad de las instalaciones contribuye a
un desarrollo más eficiente, más higiénico y menos costoso de la actividad. Una buena
disposición de los recipientes en las cámaras de crecimiento para que puedan ser
periódicamente revisados por el personal a cargo también resulta indispensable. En el
área destinada a los flujos laminares, es importante contar con suficiente espacio para
el ingreso de carros con plantines. Entre el instrumental necesario para la
micropropagación, es conveniente disponer de esterilizadores eléctricos, lo cual evita
los riesgos de incendio asociados la utilización de mecheros y de alcohol.
La tarea de subdividir los plantines en forma manual es la más costosa. Un elemento
clave para lograr calidad y rapidez es el entrenamiento del personal. Un operario bien
capacitado puede realizar en una jornada de trabajo entre 1.600 y 2.800 plantines
diarios, dependiendo de la especie que esté siendo micropropagada. Pese a los
intentos de automatización y de incorporación de nuevas tecnologías, la
micropropagación por división manual de vástagos axilares sigue siendo hasta el
presente el método por excelencia de micropropagación masiva. La infraestructura y el
instrumental deben apoyar y hacer más eficiente la labor manual. Por ejemplo, es
importante llevar un registro detallado de los procesos que se realizan. Esto permite
hacer seguimientos detallados en los casos en que se registran desarrollos anómalos
en las plantas micropropagadas.
Dentro de los objetivos de producción, es clave: a) la calidad de la división de los
plantines, de forma tal que todos tengan potencialidad de crecimiento y proliferación.
Como se mencionó anteriormente, una especie que pueda subdividirse por segmentos
nodales, será más productiva (se producen más plantines/hora) que otra cuya división
requiera separación de macollos y vástagos adventicios; b) la manipulación de las
plantas en total esterilidad, evitando contaminaciones accidentales que sean
arrastradas en siguientes subcultivos. La transparencia 26 ilustra el proceso de
subdivisión de plantines en un área estéril.
Para elaboración a gran escala de medios de cultivo, un laboratorio necesita contar
con aparatos que permitan el procesamiento de grandes volúmenes de líquidos. Las
soluciones madres que sirven para suplementar los medios con distintos
micronutrientes y vitaminas pueden preparase en concentraciones de 10, 100 y 1000x.
Entre el instrumental necesario para la elaboración y manejo (transparencia 27), se
cuentan contenedores de 5, 10 y 20 L, agitadores magnéticos, hornos de microondas
para facilitar la solubilidad de algunos compuestos, balanza y un medidor de pH. Las
autoclaves deberán tener una capacidad suficiente para ingresar los grandes
volúmenes a ser esterilizados y un registro de los tiempos y temperaturas alcanzadas.
Los recipientes utilizados para el crecimiento in vitro de plantines pueden ser de
formatos variables.
Los recipientes contenedores de plantines, son una elección que a simple vista puede
ser considerada trivial, pero que sin embargo requiere cuidadosa atención. Las
preferencias de los laboratorios difieren en esto; algunos utilizan recipientes grandes
capaces de contener un alto número de plantines (lo que incrementa la rapidez de las
tareas manuales). Otros prefieren utilizar recipientes pequeños con poca cantidad de
plantas (lo que disminuye los riesgos de contaminación). Un recipiente grande permite
menor acumulación de etileno, lo que disminuye la aparición de fenómenos de
senescencia y facilita la proliferación en algunas especies. Los recipientes deben ser
traslúcidos para visualizar a simple vista la aparición eventual de contaminaciones. Su
diseño debe permitir que el manipuleo se realice con facilidad y rapidez (transparencia
29). En caso de no ser descartables, deben poder ser esterilizados por algún método
que asegure esterilidad total (calor, radiación, gases).
La transparencia 29 muestra un ejemplo de recipiente circular de plástico descartable.
Este modelo se encuentra más fácilmente en el mercado. También existen recipientes
rectangulares, traslúcidos, altos y con buen cierre de tapa, pero no se encuentran tan
fácilmente disponibles. La ventaja de éstos últimos es que resultan más apropiados
para su ordenamiento y para la manipulación por parte del operario.
La transparencia 30 muestra un área de trabajo apta para que el operador pueda
realizar su tarea con máxima eficiencia. Los siguientes elementos deben estar
fácilmente disponibles: a) carro con recipientes conteniendo las plantas a ser
subdivididas y recipientes con los medios frescos para recibir los nuevos vástagos; b)
alcohol y gasa estéril para limpiar los recipientes a ser introducidos al área de flujos
laminares; c) pinzas y bisturíes; d) soporte donde serán subdivididos los plantines; e)
esterilizador eléctrico (en lo posible, evitar mecheros a gas y alcohol para reducir los
riesgos de incendio).
La transparencia 31 muestra las condiciones de rusticación necesarias para la
aclimatación gradual de los plantines obtenidos in vitro. Esta debe realizarse en
condiciones controladas, particularmente de temperatura y humedad. Es importante
dedicar un tiempo a rotular las nuevas plantas que ingresan. Dichos rótulos deberán
permitir la trazabilidad de los plantines que están siendo procesados en su etapa final.
Además, para preservar la sanidad obtenida mediante el proceso in vitro, debe
restringirse el acceso de cualquier planta no testeada en su condición fitosanitaria al
ambiente en que se realiza la rusticación.
Si bien en la etapa de laboratorio se considera que un plantín está completo cuando
ha desarrollado su parte radicular, en términos comerciales el plantín “completo” es
aquel que cumple las expectativas del solicitante. Un ejemplo típico que ilustra este
punto es el de las plantas fruti-hortícolas. Se consideran que éstas están listas para la
comercialización cuando han alcanzado un buen crecimiento y son aptas para su
desarrollo en las condiciones ambientales naturales. En la transparencia 32 se
observa la última fase de invernáculo, donde las plantas están bajo media sombra, en
su etapa final, previo a ser entregadas.
Control fitosanitario y varietal
Transparencias 33-36
El control fitosanitario es esencial en todas las etapas de la micropropagación, ya que
cualquier agente infeccioso se reproducirá en forma exponencial conjuntamente con el
aumento del número de plantines (transparencia 34). El material contaminado se debe
eliminar lo más temprano posible del stock de plantas a micropropagar para evitar
incurrir en graves pérdidas económicas. Las contaminaciones bacterianas o fúngicas
suelen detectarse mediante simples observaciones visuales. Las mismas son más
frecuentes en las primeras etapas de la micropropagación, y se originan en los
microorganismos que no han sido eliminados en la etapa de desinfección. Por otra
parte, existen bacterias endógenas que permanecen latentes dentro de la planta y
afloran en subcultivos avanzados. Según cómo las mismas afecten al crecimiento de
la planta y a la intensidad de su aparición, puede tratarse al cultivo con algún
compuesto antibacteriano para eliminar o reducir su crecimiento. Respecto de las
contaminaciones virales, el diagnóstico se realiza en las plantas madres, antes de
introducirlas en el cultivo in vitro. Generalmente, se realizan ensayos
inmunoenzimáticos (ELISA) o con plantas indicadoras para detectar presencia o
ausencia de micoplasmas o virus conocidos en cada cultivo particular. Los métodos de
PCR son más aptos para detectar cantidades mínimas de estos agentes infecciosos.
Cuando sólo se dispone de plantas infectadas para iniciar un proceso de
micropropagación, una estrategia eficaz y relativamente inocua es tratar a la planta
madre o a los meristemas ya extraídos con incubaciones a alta temperatura. Luego de
dicho tratamiento y de la desinfección inicial para introducir el material en el cultivo in
vitro, los meristemas en crecimiento se analizarán nuevamente para detectar
presencia/ausencia de virosis. Dependiendo del grado de infección de la planta madre,
siempre será posible eliminar un cierto porcentaje de los agentes infecciosos en los
meristemas tratados. No deben escatimarse cuidados para establecer la sanidad del
stock material inicial. El criterio principal en esta etapa es asegurarse que el material
que sirve como base a todo el proceso de micropropagación es sano por todos los
criterios disponibles.
Antes de iniciar un proceso de micropropagación masiva, es fundamental constatar la
identidad de las plantas madres con patrones varietales bien establecidos. Como es
obvio, la introducción de material poco caracterizado al comienzo de la
micropropagación puede tener graves consecuencias económicas en la medida que se
avanza en la multiplicación. Los procedimientos más empleados en la actualidad
hacen uso de distintos tipos de marcadores moleculares, tales como RAPDs, AFLPs y
SSRs. En la transparencia 36 vemos un gel de poliacrilamida mostrando bandas
obtenidas por microsatélites que permiten diferenciar variedades de arándanos.
La caracterización de variedades por técnicas de biología molecular garantiza un
control interno eficaz sobre la uniformidad del material vegetal que se está
produciendo. Existen diversos métodos con distintas ventajas y desventajas según la
facilidad de su implementación; su reproducibilidad y los costos involucrados.
Gestión productiva
Transparencias 37-42
Para llevar adelante un plan de micropropagación masiva, es fundamental optimizar la
gestión en todas las etapas y coordinar las mismas en forma precisa (transparencia
38) Se deben considerar parámetros como: a) las tasas de proliferación de las plantas;
b) la posibilidad de decaimiento de las tasas proliferativas; c) las épocas de
multiplicación de las distintas especies para mantener una labor continuada; d) el
requerimiento de mano de obra para la multiplicación de cada variedad/especie.
Resulta clave la observación constante del estado de los plantines para poder predecir
cambios en las tasas de proliferación y visualizar la aparición de contaminaciones. En
base a las mismas, se podrán anticipar cambios en los rendimientos esperados y
modificar anticipadamente los períodos de multiplicación para ajustar la producción.
Asimismo, el conocimiento de tasas y de rendimientos permite prever la cantidad de
medio de cultivo a elaborar. Es conveniente contar siempre con medio de cultivo listo
para anticipar eventuales incrementos en la tasa proliferativa, o para el caso de que se
adelante la multiplicación de algún cultivo que presente buen crecimiento. Sin
embargo, no conviene tener medios en stock por más de 30 d sin ser utilizados. Las
consideraciones sobre la etapa de enraizamiento dependen del tipo de planta y de si el
mismo se realizará in vitro o ex vitro. El enraizamiento ex vitro es siempre más
conveniente, ya que implica un paso menos de cultivo in vitro y menos utilización de
cámaras de crecimiento. Finalmente, una gestión eficaz de la aclimatación es crítica
para lograr un plantín completo bien terminado.
La introducción de alternativas al cultivo en medio semisólido en alguna etapa del
proceso de micropropagación puede incrementar la productividad y la calidad de las
plantas. Los biorreactores que permiten inmersión temporaria, facilitan la oxigenación
de los cultivos, así como la dilución de compuestos tóxicos que puedan acumularse
alrededor del plantín en crecimiento en un medio semisólido. La transparencia 39
muestra un conjunto de biorreactores de tipo RITA en el que se cultivan plantines de
caña de azúcar. El flujo de medio y la aireación son controlados por un temporizador.
Durante el seguimiento de la micropropagación pueden implementarse cambios que
tiendan a una mejora en la calidad de las plantas o un incremento en la productividad.
Algunos ejemplos están mencionados en la transparencia 40. Utilizar un agregado de
medio de cultivo líquido sobre la base de un medio semisólido implica una reposición
de nutrientes para los plantines sin que ello requiera un subcultivo a medio fresco, con
el consiguiente ahorro de mano de obra. También pueden alternarse los medios de
cultivo, mediante modificaciones en la composición de reguladores de crecimiento u
otros componentes del medio. Debe considerarse que una prolongada exposición a un
único medio de cultivo puede producir un acostumbramiento o agotamiento de los
plantines a los reguladores de crecimiento empleados. También pueden contribuir a
incrementar el crecimiento los cambios en la aireación de los recipientes o en la
intensidad lumínica.
El calendario de producción debe ajustarse a los requerimientos de los productores o
de los viveristas, quienes generalmente requieren las plantas en una determinada
época del año (transparencia 41). Tanto la preparación de las plantas como la
expedición de las mismas, deben ser conducidas con sumo cuidado. El cliente debe
recibir las plantas encargadas en excelente estado. Es importante realizar un
seguimiento post-venta del material vegetal entregado, lo que permitirá obtener un
mayor conocimiento del mercado y de sus posibles alcances. Puede ocurrir que el
cliente solicite exclusividad en cuanto a la propagación de un determinado material
vegetal proporcionado por él mismo. En este caso, si las cantidades permiten fijar
costos razonables, se realizan contratos exclusivos de propagación.
La micropropagación comercial, ha tenido profundo impacto social en muchas
regiones de Latinoamérica (transparencia 42). Por ejemplo, en la localidad de Simoca,
situada a 60 km de San Miguel de Tucumán, un grupo de pequeños productores
cañeros minifundistas decidieron cambiar su estrategia productiva y se volcaron al
cultivo del arándano. Se requieren como mínimo 5 ha de este cultivo para tener una
producción rentable. La micropropagación de material sano y de calidad comercial les
permitió vincularse con el mercado de exportación a los países del hemisferio norte,
con el consiguiente incremento de sus beneficios económicos. Asociaciones como
está pueden organizarse en el caso de muchas otras producciones especializadas
(frutícolas, hortícolas, ornamentales y forestales) en que la provisión de materiales
propagativos de calidad certificada constituye un requerimiento productivo importante.
Como es obvio, el impacto social y regional de este tipo de experiencia es,
potencialmente, muy grande.
Otras aplicaciones de la micropropagación
Transparencias 43-50
Las transparencias 45 a 50 muestran otras aplicaciones en que se puede utilizar la
micropropagación masiva como un instrumento auxiliar de otros procedimientos. Uno
de los ejemplos se relaciona con la utilización de la técnica de micropropagación
vinculada al caso de una planta transgénica (en este caso, plantas de papa resistentes
al virus PVY). Para poder evaluar dicha planta y hacer selecciones y ensayos a
campo, se necesita multiplicar la línea transgénica en cantidades suficientes y obtener
plantas en idénticas condiciones para su evaluación a campo en diferentes localidades
y bajo distintas condiciones ambientales. Estos ensayos son imprescindibles para
satisfacer las exigencias de los organismos responsables de la evaluación y liberación
de OGMs al medio ambiente (transparencia 49).