B-C-53 - Secretaría de Ambiente y Desarrollo Sustentable

PROYECTO PNUD ARG/02/018 SUBPROYECTO
B-C-53
Enero de 2008
INFORME FINAL
para el
PROYECTO PNUD ARG/02/018 SUBPROYECTO
Enero de 2008
B-C-53
I. Título del Proyecto:
Indicadores de contaminación por TBTs (disruptores endocrinos) y por la
explotación petrolera en costas patagónicas. Efectos sobre organismos marinos de la
zona y estudios de estrategias alternativas de desarrollo sustentable.
II. Resumen del Proyecto
El uso de TBTs (trialquil-estaños) ha provocado una marcada contaminación en el
ecosistema costero, daños irreversibles en organismos acuáticos, y es el compuesto más tóxico
arrojado deliberadamente por el hombre en aguas naturales, por lo que su uso está siendo
restringido en varios países desarrollados, pero no en Argentina ni en ningún otro país de
Latinoamérica. El propósito de este sub-proyecto fue realizar un mapeo de sitios a lo largo de la
costa patagónica, determinando el contenido de TBT en aguas y sedimentos y evaluando los %
de “imposex” y otros daños en organismos marinos.
Se diseñó un plan de muestreo abarcando desde las zonas de Mar del Plata hasta
Trelew, en sitios localizados fundamentalmente en las Pcias. de Río Negro, Chubut y Santa
Cruz. Se capacitó a colaboradores de dichas provincias para realizar muestreos significativos,
escogiendo fundamentalmente zonas de intenso tráfico marítimo. Nuestros resultados han
demostrado la existencia de TBT en cantidades variables, en todos los sitios muestreados, lo
que evidencia claramente la amplia difusión del tóxico y la urgente necesidad de
reglamentaciones de control. En algunos casos, las [TBT] halladas en aguas y sedimentos de
sitios portuarios, son las más altas que registra la literatura internacional actual. Cabe destacar
que los métodos cuantitativos han sido desarrollados en nuestro laboratorio, y fueron validados
por precisas curvas de calibración en distintos niveles de contaminación. Se participó en un
ejercicio de intercalibración de TBT organizado por la Univ. de Texas (USA) y los resultados
obtenidos en nuestro grupo arrojaron un 100% de confianza con los datos de las muestras
incógnitas reales, lo que demuestra la confiabilidad de todos los valores determinados en este
sub-proyecto.
Determinaciones realizadas en espejos de agua dulce, también indicaron TBT, por lo
que se realizaron estudios de efectos de TBT en organismos Pomacea caniculata (ampularias)
y fisas. A los efectos de obtener resultados reproducibles y confiables, dichas especies se
cultivaron en el laboratorio y todos los estudios se realizaron con especies de cultivo. Se
deteminaron CL50, LOEC y NOEC para organismos desde 1 semana a 2 meses de edad.
También se realizaron estudios de cinética de degradación/bioacumulación de TBT con
Pomacea caniculata y de efectos sobre la reproducibilidad en individuos en edad fértil a fin de
determinar el grado de daños endocrinos. Todos estos estudios mostraron la dependencia entre
TBT y varios indicadores biológicos y aportan información a los organismos de control y de
empresas pesqueras sobre la necesidad de legislación al respecto.
Por otro lado, se determinarán indicadores de la estabilización y de la toxicidad de
residuos de petróleo basados en mediciones de RMN y se compararon con otros parámetros de
mediciones más convencionales. Los resultados indican que las mediciones por RMN son más
últiles para una mejor definición del riesgo ambiental en el ecosistema costero-marino. Se
realizaron también estudios de fitotoxidad de los residuos sobre la germinación de semillas de
especies autóctonas. Los efectos encontrados permitirán un mejor diseño de estrategias
alternativas de remediación y sustentabilidad.
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III. Antecedentes:
Se denomina “fouling” en inglés (que se podría traducir como incrustaciones, en un sentido
amplio en este contexto) al conjunto de organismos que crece sobre estructuras sumergidas de
origen antrópico.
Estos organismos se fijan eficazmente al substrato desarrollando un rápido crecimiento y vasto
potencial reproductor. Como consecuencia, se producen daños sobre estructuras móviles y
estacionarias afectando a embarcaciones, plataformas petrolíferas o de gas, plantas de
conversión de energía térmica, instrumentos de investigación oceanográfica, y equipos de
sondas subacuáticas.1,2 También daña las instalaciones de acuicultura (acuarios, jaulas,
conductos, bombas) y a los propios organismos cultivados.3
El “fouling” acelera los procesos de corrosión de los materiales y provoca pérdidas en la eficacia
operativa de las estructuras. Así, en las embarcaciones se incrementa la fricción entre el casco
y el agua lo que conduce a un aumento del consumo de combustible (hasta un 40-50% con un
fouling poco denso) y la pérdida de velocidad y capacidad de maniobra. Un barco no protegido
puede acumular, durante seis meses en el mar, hasta 150 kg de estos organismos por metro
cuadrado lo que en un petrolero con 40.000 m2 de obra viva supone incrementar su peso en
6.000 tm. Todo ello se cifra en cuantiosas pérdidas económicas.3
Por esa causa, y desde hace mucho tiempo, distintos biocidas se han utilizado como antiincrustantes, entre los cuales merecen especial mención los derivados de sales de cobre como
principal biocida, pero también se usaban aditivos con arsénico y con DDT. A partir de la
década del ‘60 se introdujeron aditivos basados en compuestos organoestánnicos, mucho
menos dañinos que los anteriores. El acronimio TBT (del inglés “tributyltin”= tributil-estaño) se
utiliza para denominar a un considerable número de compuestos de trialquil-estaño, siendo los
contra-iones más comunes: metacrilato, cloruro y óxidos. En los ’70 las pinturas con TBTs,
especialmente en la formulación con copolímeros auto-limpiantes (SCP), marcaron un impacto
revolucionario en la industria de los grandes barcos; para mediados de los ’80 ya se usaban en
el 80% de toda la flota comercial mundial. Como resultado, la producción de compuestos
organo-estánnicos que era de 50 tm en los ’50 superó las 40.000 tm a mediados de los ’80.4 El
impacto económico fue tan importante que no puede soslayarse. En la tabla 1 se muestran
algunos índices comparativos. Antes de la introducción de TBTs, los barcos debían pintarse
cada año, (pues ya a los 6 meses gastaban un 40% más de combustible), con pinturas con TBT
el mantenimiento se redujo a pintura cada 8-10 años.5 El ahorro financiero debido a la mayor
eficiencia del combustible; reducción en los costos de mantenimiento; períodos mucho más
prolongados de tiempos hábiles; etc. supera los 3 billones de u$/año para la flota mercante
marina.6a
Tabla 1. Cuadro comparativo de las ventajas económicas de aditivos de TBT
Consideraciones económicas del “fouling”
Antecedentes

Consumo de combustible: aumenta 40 % en
6 meses debido al “fouling” (incrustaciones)
’70 copolimeros autolimpiantes

Limpieza y re-pintado frecuentes (6-8 meses)
’80s más del 80% de los barcos usan
estas pinturas

Pérdida de rédito por demoras en diquessecos

’60 Pinturas basadas en estaño


Producción de Organoestánnicos
Barcos pintados con aditivos de TBT
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
’50 : aprox. 50 ton/año

’90 : 60.000 ton/año

Mercado actual TBT > USD 3.000 millones
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
2-4 veces mayor eficiencia del combustible

Menor mantenimiento (pintura 8-10 años)

Reducción de tiempo en diques-secos.
Las pinturas basadas en TBT se usan en embarcaciones de todos los tamaños y en muchas
otras estructuras inmersas en agua marina, lo que ha provocado una dispersión global de TBTs
en el ambiente marino desde las zonas costeras hasta el océano abierto.7 Publicaciones
recientes demuestran que la contaminación con TBT dejó de ser un problema exclusivo de las
zonas costeras, un impactante trabajo publicado en el año 2005 en Alemania8 revela niveles de
concentración detectable de TBT aún en el polvo hogareño del 50% de las casas analizadas en
Berlín y Hamburgo, datos similares se han obtenido también en Inglaterra y en Holanda.9
Efectos en organismos vivos. Los derivados de TBTs son compuestos extremadamente
dañinos, son los compuestos más tóxicos deliberadamente introducidos por el hombre en el
ambiente.10 La literatura reciente11 es muy abundante en la información de severos daños
causados por TBTs, incluso a concentraciones de pocos nanogramos por litro, y en los países
desarrollados es, en la actualidad, el tópico más conspicuo de discusión pública referida a la
protección ambiental de los puertos.12 Causa a los seres vivos (desde bacterias a peces) una
amplia gama de efectos dañinos desde subletales hasta letales, tales como: daños al ARN,
neurotoxicidad, alteraciones en el crecimiento, producción de anomalías anatómicas y
reproductoras, bioacumulación tisular e inducción de cambios de comportamiento. Los
macroinvertebrados que resultan más afectados son los moluscos debido a su alta tasa de
bioacumulación y a su baja tasa de depuración. Dentro de éstos, los grupos más sensibles son
gasterópodos y bivalvos. Trabajos recientes informan del hallazgo de TBT también en peces y
en sangre humana13.
Los daños más importantes en organismos marinos son: engrosamiento de concha en ostras e
“imposex” en gasterópodos.7b En la década del ’80 se detectaron los primeros daños causados
por el TBT: la deformación de las ostras del Pacífico Crasotrea gigas tuvo un gran impacto
público y político: el engrosamiento de la concha provocó una disminución del tamaño del
cuerpo inaceptable para fines comerciales y una declinación en las ventas de ostras
provenientes de zonas de Francia.14 Abundantes publicaciones actuales y de la década del ‘90
informan la observación de calcificaciones de conchas en especies de Nueva Zelandia,
Australia, Canadá, Japón y España.15
Otro de los efectos notorios e impactantes de la contaminación por TBT es el llamado
“imposex”, descrito como la superposición de caracteres sexuales masculinos sobre las
hembras, la cual se manifiesta por la formación de un pene y vaso deferente que bloquea la
salida de las cápsulas de huevo, de forma tal que las hembras se vuelven funcionalmente
estériles, la acumulación de cápsulas abortadas puede conducir a la muerte del animal,
llevando, a la extinción local de esas especies. El primer informe de extinción correspondió a
Nucella lapillus en la costa de Inglaterra,16 la más reciente a Nucella lima en Vancouver,17 y la
casi extinción de Buccinanops monilifer en las costas de Mar del Plata debido a la alta
concentración de TBT, recientemente informado por nosotros.1
La literatura reciente18 es muy abundante en la información de severos daños causados por
TBTs, incluso a concentraciones de pocos nanogramos por litro. Dado que los derivados de
TBTs son compuestos extremadamente dañinos, y son los compuestos más tóxicos
deliberadamente introducidos por el hombre en el ambiente19 en los países desarrollados es,
en la actualidad, el tópico más conspicuo de discusión pública referida a la protección ambiental
de los puertos.20 Como publicaciones más recientes, merecen especial mención estudios
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recientes relacionados con la degradación del TBT, especialmente con la determinación de DBT
y MBT.21 No hay otra fuente de estos compuestos en el ambiente, y su presencia es una
medida de la degradación del TBT y de su tiempo de permanencia, especialmente en
sedimentos. Otros trabajos recientes, también han determinado estos productos en cantidades
importantes en India, 22 Australia, 23 e Inglaterra. 24 Por otro lado, es interesante señalar que
recientemente han aparecido algunos artículos de zonas sobre las cuales había muy poca
información, e.g. Cantabria (España),21 India,22 Brasil,25 y nuestro nuevo artículo sobre datos de
TBTs en Argentina;26 estas publicaciones demuestran una creciente preocupación por el tema
en países en vías de desarrollo.
Además del uso intensivo de compuestos organoestánnicos como aditivos antiincrustantes (“anti-fouling”) en pinturas; recientemente se han publicado también aplicaciones
como pesticidas, herbicidas, agentes antibacterianos y antifúngicos en agricultura, 27 y en la
producción de materiales con cloruro de polivinilo (PVC) como estabilizantes ante la luz y el
calor. Su uso tan extendido ha contribuido a la polución de los ecosistemas terrestres,28 son
extremadamente daninos y considerados los compuestos más tóxicos deliberadamente
introducidos por el hombre en el ambiente.19 Estos compuestos son absorbidos sobre la
materia orgánica y minerales, como silicatos de aluminio y otros compuestos, se acumulan en el
suelo29 y además han sido detectados en materiales marinos destinados al consumo humano30,
en cultivos y alimentos en niveles de concentración en que pueden ejercer efectos subletales y
aún letales sobre organismos y mamíferos, como consecuencia de la extendida utilización.
Factores ambientales como pH, capacidad de intercanbio catiónico y concentración de materia
orgánica alteran la movilidad y biodisponibilidad en aguas superficiales. La exposición humana
al TBT
proviene principalmente del consumo de productos contaminados con dicho
compuesto.31 TBT es tóxico en el sistema respiratorio, digestivo, neuronal inmune y
reproductivo de seres humanos.32 Se cree que la apoptosis (muerte celular juega un rol
importante en la toxicidad inducida por TBT, 33 y se ha estudiado el papel del TBT en los
cambios bioquímicos relacionados con la apoptosis) en células amnióticas humanas.34 Se
encontró que el TBT es degradado por filamentos del hongo Cunninghamella elegans. En estos
filamentos la presencia de TBT inhibe la conversión de ácido esteárico (18:0) en ácido oleico
(18:1n9).
Los cambios en la composición de los ácidos grasos revelan que el grado de
saturación está correlacionado con la biotransformación del TBT a DBT y MBT.35
La intensa actividad petrolera ha provocado un apreciable deterioro del ecosistema
marino-costero en la Patagonia. El petróleo en el ambiente sufre cambios durante el tiempo de
exposición, propiedades tales como la viscosidad, la solubilidad, la cinética de desorción, y los
coeficientes de distribución de la mezcla, se modifican durante la exposición ambiental.36 Los
índices basados en información de Cromatografía Gaseosa (CG) permiten la obtención de una
huella digital (“fingerprint”).37, 38 Las técnicas de CG y CG-MS pueden detectar solamente a los
hidrocarburos volátiles y semivolátiles, lo cual podría sugerir un desconocimiento implícito de lo
que sucede con los demás. Las alteraciones globales de los componentes que resultan ser
resistentes a la biodegradación o los productos de degradación de naturaleza no volátil no son
convenientemente caracterizadas mediante GC y/o GC-MS.39
Por esta razón, en el presente estudio se ha realizado la caracterización de mezclas
complejas de hidrocarburos por Resonancia Magnética Nuclear (RMN). Esta técnica permite
realizar un análisis estructural de petróleos, sus subproductos y residuos, basados en la
clasificación de átomos de hidrógeno y carbono, según sus entornos físicos y químicos y se
puede aplicar a fracciones de alto peso molecular, y/o de muestras de hidrocarburos no
fraccionados; la aplicación de RMN para el análisis de petróleos en el ambiente es reciente. 40
En RMN de petróleos crudos, un primer análisis fue utilizar la señal de los grupos metílicos y
metilénicos, que son claramente predominantes en relación con las demás, y los hidrógenos
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aromáticos. Los índices que relacionan la ocurrencia de los distintos tipos de hidrógeno brindan
información estructural, por ejemplo, en relación al grado de ramificación de los componentes
alifáticos y la aromaticidad, definida como la relación de hidrógenos aromáticos respecto al
total. Nosotros hemos informado recientemente que, para el caso de residuos expuestos en la
Patagonia, resultan ser de interés, además, regiones del espectro no tradicionalmente
evaluadas que pueden relacionarse con el grado de estabilización del residuo.41 La asignación
de señales correspondiente a otros tipos de hidrógenos también es posible y, en este sentido,
la utilización de 1H RNM conjuntamente con RMN de 13C ha permitido un análisis estructural
más detallado.42,43 En nuestro país se siguen utilizando los métodos convencionales de
caracterización pero, a nivel internacional, han aparecido numerosos trabajos de la aplicabilidad
de RMN en relación a la actividad petrolera. 44, 45, 46 Muy recientemente, se utilizó RMN para la
medición de propiedades relacionadas con la saturación residual de petróleo,47 concentraciones
de fracciones aromáticas, olefínicas y alifáticas en muestras de gasolina y la determinación
simultánea de algunos compuestos individuales como el benceno, metil-terbutil eter y dienos,
así también como para la caracterización de dispersiones de petróleo en presencia de
materiales asfalténicos.48
Por otro lado y en relación a la fotodegradación de sedimentos contaminados, es sabido
que los procesos de oxidación avanzados (AOP = Advanced Oxidation Processes), pueden
degradar a los contaminantes orgánicos en sustancias menos peligrosas tales como el dióxido
de carbono, agua y ácidos minerales. Los AOPs se caracterizan por la generación de radicales
hidroxilos (OH·), que son especies extremadamente inestables y reactivas (E° = 2.8 V),49
además poseen una escasa selectividad, propiedad útil para un oxidante, principalmente en el
tratamiento de muestras complejas, como lo son el petróleo y aguas residuales.50 Dada la
elevada inestabilidad y reactividad de los radicales hidroxilos, estos deben ser generados
continuamente “in situ” a través de reacciones químicas o fotoquímicas. La generación de los
mismos a través de los AOPs, puede llevarse a cabo con la utilización de agentes oxidantes
(ozono, O3, peróxido de hidrógeno, H2O2) y/o catalizadores (Fe, Mn, TiO2) y/o la utilización de
radiación UV o combinaciones de los mismos, tales como Reactivo de Fenton (H2O2/Fe+2),
fotocatalisis (TiO2/UV en presencia de oxígeno) O3/UV, O3/H2O2, UV/H2O2, entre otros.51 El
principal problema de los AOPs radica en el alto costo de alguno de los reactivos como el ozono
y el peróxido de hidrógeno y la utilización de fuentes de energía como la radiación UV; sin
embargo, el empleo de radiación solar, como fuente de energía reduce sensiblemente los
costos involucrados.52 Los AOPs se han usado previamente en el tratamiento de agua y aguas
residuales,53 en la biodegradación de fenoles, 54 en la purificación del agua por fotocatalisis, 55
en la degradación de compuestos orgánicos en agua como, clorofenoles nitrobencenos, 56 en la
fotodegradación de residuos de petróleo en suelos,57 en la mineralización de PAH sorbidos en
suelos,58 en la degradación de colorantes,59 en el tratamiento de residuos provenientes del
aceite de oliva,60 entre otros. Según surge de la bibliografía, el empleo de los mismo se ha
llevado a cabo en diferentes ambientes (suelo, agua), y con diferentes contaminantes (fenoles,
petróleo, colorantes, entre otros), en este estudio se ha evaluado la factibilidad de su utilización
en sedimentos costeros.
Además, en este proyecto, se ha avanzado en el estudio de los efectos toxicológicos de
los residuos de petróleo en sedimentos. En este sentido, durante la evaluación del riesgo
ambiental en relación a la contaminación por la actividad petrolera, tradicionalmente se han
utilizado datos provenientes del análisis químico para cuantificar la presencia de un compuesto
o grupo de compuestos químicamente relacionados; no obstante estos datos no brindan
información sobre la posible toxicidad de los mismos61, resultando en una sub o sobre
estimación del riesgo ambiental real.62 Debido a esto, en los últimos años se comenzó a utilizar
como instrumento alternativo y complementario de los análisis químicos, los bioensayos para
determinar la toxicidad de muestras ambientales, también denominados ensayos biológicos o
ensayos ecotoxicológicos.63 Los bioensayos son herramientas de diagnóstico adecuadas para
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determinar el efecto de agentes físicos y químicos sobre organismos de prueba. Estos efectos
pueden ser tanto de inhibición como de magnificación, evaluados por la reacción de los
organismos, tales como muerte, crecimiento, proliferación, multiplicación, cambios morfológicos,
fisiológicos o histológicos.64 Las determinaciones ecotoxicológicas sobre muestras ambientales,
han llevado al uso de diversos organismos, correspondientes a diferentes niveles tróficos, como
microorganismos, organismos invertebrados, plantas acuáticas y terrestres, entre otros. 65, 66 Las
especies mas frecuentemente ensayadas fueron de origen animal aún para ambientes marinos
o acuáticos de agua dulce. Sin embargo, el uso de plantas acuáticas o terrestres es reconocido
en la evaluación de la calidad del ambiente (biomonitores, especies centinelas), y en la
remoción de sólidos suspendidos, nutrientes y tóxicos orgánicos en distintos tipos de
efluentes. Dentro de las especies vegetales, las plantas superiores son ampliamente utilizadas
por ser organismos eucariotas, y por lo tanto los resultados pueden ser comparables con la
mayoría de las especies de la flora y fauna superior. Constituyen una eficiente herramienta de
trabajo para medir alarma de peligro ambiental, son más sensibles a estrés que otros ensayos,
de fácil manipulación y mantenimiento, bajo costo y buena correlación con otros sistemas de
pruebas.67
El petróleo en el ambiente es una mezcla compleja termodinámicamente inestable, que
sufre cambios durante el tiempo de exposición,68 numerosos estudios muestran como se han
incorporado a los análisis químicos tradicionales, los ensayos de ecotoxicidad, 69 los mismos se
han utilizado, para realizar el seguimiento de las tareas de biorremediación,70, 71 evolución de
derrames en el ambiente72 y en el estudio de los factores que afectan en la germinación y
crecimiento de plantas,70, 73 entre otros. Los bioensayos pueden ser clasificados de acuerdo
con: su duración, el método utilizado para incorporar la muestra al sistema de ensayo y el
propósito para el cual son utilizados. El bioensayo con semillas de Lactuca sativa L. es un
ensayo estático de toxicidad aguda (120 horas de exposición) en el que se evalúan los efectos
fitotóxicos de un compuesto puro o mezcla compleja en el proceso de germinación de las
semillas. Como punto final para la evaluación del efecto fitotóxico, se determina la inhibición en
la germinación y la inhibición en la elongación de la raíz. Esta prueba de toxicidad ha sido
recomendado y aplicado por diferentes organismos de protección ambiental, como la EPA,
para la evaluación ecotoxicológica de muestras ambientales y compuestos puros, además de la
evaluación del efecto fitotóxico de pesticidas sobre especies no blanco necesarios para el
registro de pesticidas.74, 75
En la región patagónica, nuestro grupo ha realizado estudios de toxicidad de derrames
de petróleos en suelos, en la etapa de germinación con la especie, Grindella chiloensis
(nombre vulgar: botón de oro), a los fines de examinar posibles indicadores de riesgo
ambiental que sirvan en las evaluaciones de impacto y a la gestión, en general, de los residuos.
Se encontró que EC50 estaba comprendido entre 9,2 y 11,3% p/p de petróleo en suelo. El
tiempo de permanencia del petróleo en el suelo, pareció mejorar, en algunos casos, los índices
de germinación lo cual podría aprovecharse, por ejemplo, para determinar las condiciones
óptimas de implementación de las tareas de repoblamiento vegetal en las zonas afectadas.76
IV.
Justificación:
Nuestros trabajos previos realizados en las costas de la zona de Mar del Plata, 1 y los
realizados durante el desarrollo de este sub-proyecto en numerosos sitios costeros de las Pcias.
de Río Negro, Chubut y Santa Cruz han mostrado eficazmente la existencia de TBT en
cantidades variables, en aguas y sedimentos de dichos sitios, aún en zonas supuestamente no
contaminadas. Llama la atención, en particular, el hallazgo de TBT en sitios “limpios” de Puerto
Madryn, y también en espejos de agua dulce como la Laguna de Chascomús, donde se da
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solamente el tráfico de pequeñas embarcaciones de paseo y pesca artesanal. Los resultados
de las determinaciones cuantitativas realizadas, con métodos desarrollados en nuestro
laboratorio y validados por ejercicios de intercalibración internacionales deben ser un
significativo llamado de alerta a las organizaciones gubernamentales, ONGs y empresas
navieras y de la industria pesquera sobre la inquietante diseminación de estos aditivos
“antifouling” considerados los elementos más tóxicos arrojados deliberadamente por el hombre
al ambiente. Nuestros estudios también han demostrado la total dependencia entre el contenido
de TBT y los daños causados en especies de las costas marplatenses, donde determinamos
grados de “imposex” muy altos en B.monilifer (85%) y A. brasiliana (38.9-50%), que están
provocando la casi extinción de esas especies en la zona. Determinaciones de TBT a lo largo
de la costa desde MdP hasta Mar Chiquita, mostraron una declinación constante: el menor dato
cuantificable fue 2.5 ng/g en sedimentos de Valeria del Mar, desde allí hasta Mar Chiquita
[TBT]=0 y no se han observado casos de imposex. Determinaciones sobre especies colectadas
en Puerto Madryn y en la Bahía de San Antonio mostraron también casos de imposex en B.
globinossum. Nuestro laboratorio es actualmente el único en Latinoamérica en condiciones de
realizar determinaciones de TBT: los métodos desarrollados tienen límites de cuantificación de:
80ng/L en agua; 2.5 ng/g en sedimentos; 5.7 ng/g en hígado y ng/g en ovicápsulas, que han
sido validados por ejercicios de intercalibración internacionales.
En el desarrollo de este sub-proyecto se ha diseñado y realizado un plan de muestreo de
determinación de TBT en sitios todo a lo largo de la costa patagónica, con especial énfasis en
lugares de alto tráfico marítimo, pesquero, etc y de aquellos lugares donde ya se han detectado
casos de imposex. En algunos casos, se han realizado determinaciones periódicas de TBT en
aquellos sitios donde se determinó mayor contaminación. No existe una clara dependencia
entre la [TBT] y la estación climática, y probablemente el vector más importante sea la afluencia
de grandes barcos en los sitios portuarios. Simultáneamente se determinaron algunos % de
imposex en organismos marinos de la zona y se detectaron TBT daños endocrinos (sin
observación clara de imposex), en algunas especies de Río Negro. Se realizaron mapeos de los
contenidos de TBT en aguas y sedimentos y de los daños causados en especies marinas
autóctonas de sitios a lo largo de la costa atlántica.
También se realizaron nuevas determinaciones de TBT en el área marplatense a fin de
comparar con nuestros datos previos de los años 2002 y 2003, no se observó un aumento de
su concentración en el tiempo por la falta de reglamentación, sino más bien una disminución.
Por consultas realizadas, en los años mencionados se habían efectuado remociones
importantes de tierra en la costa, lo que probablemente provocó esos % tan altos de TBT
determinados. Monitoreos periódicos similares se efectúan en diversos sitios del Hemisferio
Norte, siendo el de la bahía de Tokio el más antiguo y completo. El Director de este proyecto
fue invitado a visitar el Tokyo Metropolitan Research Lab. of Public Health en set. 2003, y pudo
interiorizarse de la magnitud y frecuencia de las determinaciones que se llevan a cabo desde el
año 1991. Japón es el único país que ha prohibido la fabricación de pinturas con TBTs y es
también el único país que ha reportado una declinación del contenido de TBT a partir del año
2000.
Todas las determinaciones efectuadas evidencian claramente la inter-dependencia entre
la [TBT] y los daños endocrinos observados en especies autóctonas; también demuestran la
existencia de TBT en espejos de agua dulce. Estos hallazgos son un serio alerta para
concientizar a diversos organismos de control y ONGs sobre la necesidad de reglamentar el uso
de aditivos para pinturas basados en TBT. Para ello, ya hemos contactado algunos organismos
gubernamentales a quienes se ha involucrado en el sub-proyecto, seguiremos contactando
otros, también a representantes de la industria pesquera y de las empresas de
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comercialización de dichas pinturas. Simultáneamente se está realizando desde hace unos
cinco años la difusión del tema en diversas conferencias referidas al desarrollo sustentable, en
publicaciones y presentaciones a congresos, en cursos de “Nuevas Tecnologías para un
desarrollo sustentable” y en la edición del libro titulado “Química Sustentable”.
No podemos soslayar el tema económico. Antes de la introducción de TBTs, los barcos
debían pintarse cada año, (pues ya a los 6 meses gastaban un 40% más de combustibles), con
pinturas con TBT se pintan cada 8-10 años. El ahorro financiero debido a la mayor eficiencia
del combustible; reducción en los costos de mantenimiento; períodos mucho más prolongados
de tiempos hábiles; etc. supera los 3 billones de u$/año para la flota mercante marina.77 No
obstante, ya se ha demostrado que su uso como agentes anti-incrustantes (“anti-fouling”) en
pinturas de grandes barcos, yates, marinas, embarcaciones pesqueras, etc. y en la industria de
plásticos derivados ha provocado una marcada contaminación en aguas y su ecosistema. Por
esa razón, a nivel mundial se están proponiendo diversas alternativas: se ha publicado
recientemente que el empleo de otros biocidas ha provocado daños en diversas especies y no
se conocen todavía datos sobre el uso prolongado de dichos biocidas en el ambiente. No
obstante, el director de este proyecto, fue informado en un Congreso reciente, de una nueva
molécula derivada de las pirazolonas que tendría similar poder “anti-fouling” pero se degrada
más rápidamente en agua de mar. Por esta razón, para el último año de este sub-proyecto se
había propuesto la síntesis de algunas moléculas de ese tipo, y la determinación de su
velocidad de hidrólisis en agua de mar y su ensayo como biocida en organismos cultivados, a
nivel de laboratorio. A esos efectos, se desarrollaron técnicas de cultivo de organismos de agua
dulce, se determinaron las [TBT] para CL50, LOEC y NOELC. Se estudió también la cinéica de
degradación/bioacumulación de TBT en estas especies y los resultados obtenidos indican su
posible utilidad en técnicas de remediación. Todos los estudios con especies de cultivo en
laboratorio se realizaron, pero no pudo completarse la síntesis propuesta para el 3er. Año.
Por otro lado, se ha publicado la detección de TBT en músculo de salmón, atún y
también en ballenas de Canadá, los daños que pueda causar al ser humano su ingesta
prolongada son aún desconocidos Pensamos que el hallazgo de TBT, en peces cercanos a la
costa patagónica que se comercializan para el consumo humano, podría también sensibilizar a
representantes de la industria pesquera de la zona a favor de un paulatino reemplazo de dichas
pinturas. Con todas estas herramientas, consideramos que habiendo ejecutado la mayor parte
del proyecto, se podrá sensibilizar al sector gubernamental, industrial, académico y de la
sociedad en general para que, con datos tan abundantes y elocuentes, se pueda lograr la
recomendación de reglamentar el uso de estos aditivos y la implementación paralela y
paulatina de una estrategia de reemplazo por alternativas más sustentables, lo que redundará
en una mayor conservación de los organismos marinos de la costa patagónica y recuperación
de aquellas especies cuya población está declinando por efecto de TBT. Por último, en su
carácter de Titular Member del Comité for the Revision of Chemicals (CRC) de la Convención
de Rótterdam, el Director de este sub-proyecto fue invitado a participar del grupo de tareas que
estudió las notificaciones sobre TBT de varios países y, en la última reuniòn realizada en Roma
en marzo 2007, redactó la “Draft Decisión Guide” para que la Conferencia de las Partes pueda
incluir el TBT en el Listado de Productos PIC (Prior Informed Consent) a fin de que se reduzca
su uso a nivel mundial.
8
PROYECTO PNUD ARG/02/018 SUBPROYECTO
V.
B-C-53
Enero de 2008
Objetivos:
Se enumeran a continuación todos los objetivos planteados en la presentación del subproyecto
y descriptos en la Carta Acuerdo, a saber:
Determinar el contenido de TBTs en muestras de agua y sedimentos a lo largo de la costa
atlántica patagónica, con especial énfasis en sitios de mayor tráfico de grandes barcos, intensa
actividad pesquera, concentración de embarcaciones deportivas, etc.
Determinar el grado de “imposex” y otros daños en especies marinas de la zona, especialmente
en aquéllas que evidencian declinación de la población y determinar TBT en muestras
biológicas de dichas especies
Realizar mapeos de sitios contaminados y de especies dañadas a lo largo de la costa
patagónica a fin de mostrar la clara dependencia; mantener un monitoreo periódico de la
concentración de TBT en los sitios más contaminados para controlar su aumento.
Realizar ensayos de sensibilidad al TBT en especies en cultivos: estudios histológicos
determinación de CL50; toxicidad aguda y sub-crónica; observación de daños por SEM, etc.
Determinar indicadores de cambios en la composición de residuos de petróleo en la costa
patagónica basados en RMN y demostrar su validez como herramienta más adecuada para el
seguimiento de la estabilización ambiental de contaminantes orgánicos hidrofóbicos.
Determinar los parámetros de toxicidad de los distintos componentes y sus efectos sobre
organismos marinos autóctonos. Correlacionar los indicadores y parámetros de toxicidad, para
evaluar el riesgo residual en función de la exposición en el ambiente de la Patagonia.
Examinar la aplicación de nuevos compuestos “antifouling” y la aplicación de procesos
oxidativos avanzados para la remediación de la contaminación con petróleo.
Evaluar los aspectos económicos, ambientales, gubernamentales, etc. de estas alternativas
para proteger la biodiversidad y contribuir al desarrollo sustentable de la región patagónica.
Como se desprende de la lectura de las Metodologías empleadas y de los Resultados
obtenidos todos estos objetivos han sido desarrollados a lo largo del sub-proyecto, a los que
debe agregarse el ejercicio de intercalibración siguiente.
Participación en Ejercicio de intercalibración internacional de TBT, organizado por el Dr. J.
Sericano de la Universidad de Texas (USA). No se había planteado como objetivo en la
presentación del sub-proyecto, porque fue una propuesta que apareció después de haberse
comenzado su ejecución. No obstante se decidió participar, dado que respondía perfectamente
a los objetivos generales del sub-proyecto y constituiría una evidencia objetiva y externa del
grado de se decidió participar confiabilidad de los métodos desarrollados en nuestro
laboratorio,. Los resultados obtenidos de los análisis efectuados en nuestro grupo, arrojaron un
100% de confianza en los datos informados, con respecto al contenido real de TBT en las
muestras incógnitas de sedimento que nos fueran entregadas.
VI. Metodología:
Áreas de estudio
Se diseñó un plan de recolección de muestras, seleccionando las zonas y sitios de
muestreo para agua y sedimento marinos, en la recolección de muestras colaboraron personas
de las zonas seleccionadas para la recolección según los criterios establecidos. Se hizo un
planeamiento de primer muestreo preliminar en sitios de Mar del Plata, y luego en zonas de San
Antonio Oeste (Pcia. de Río Negro), Comodoro Rivadavia y Puerto Madryn (Pcia. de Chubut).
Para la toma de muestras ha colaborado personal de las distintas instituciones a quienes se les
9
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abonan los gastos de materiales y vehículo, envío de muestras, etc. En la toma de muestras de
profundidad colaboró personal de Prefectura y/o buzos particulares cuyo servicio se abonó por
trabajo realizado. Se muestran abajo algunos sitios de muestreo
Las zonas sombreadas indican lugares de recolección y toma de muestras
Para las determinaciones de TBT se recogieron muestras de agua y sedimentos en diversos
sitios de la costa atlántica: la más al norte corresponde a zonas de Mar del Plata y la más al sur
de Trelew; zonas intermedias fueron: Bahía Blanca, Punta Alta, las zonas aledañas a San
Antonio Oeste (Río Negro), Puerto Madryn y Comodoro Rivadavia (Chubut), Camarones y
Puerto Deseado. Además de la actividad petrolera, la principal actividad en Puerto Madryn,
Camarones, Caleta Córdova y Puerto Deseado es la pesca, y esta actividad se complementa
Área de muestreo en la zona de P. Madryn, delimitada por el muelle Storni y el muelle Piedrabuena
10
PROYECTO PNUD ARG/02/018 SUBPROYECTO
B-C-53
Enero de 2008
:
con el uso de dichos lugares para recreación. Rada Tilly es una ciudad con una extensa playa
que se utiliza habitualmente para realizar actividad al aire libre y no posee puerto propio, siendo
el más cercano el de Comodoro Rivadavia.
Zona de muestreo San Antonio Oeste (Rio Negro)
Personal de nuestro laboratorio pasa a recepcionar las muestras por aeroparque y/o terminal de
ómnibus según corresponda. Las muestras se mantuvieron refrigeradas hasta su tratamiento y
análisis. En particular, las muestras de sedimento colocadas en freezer, son luego liofilizadas
hasta sequedad total, en cuyo estado ya no requieren refrigeración. Se desarrollaron técnicas
de distintos tratamientos previos de las muestras, de su derivatización y posterior análisis
cuantitativo por cromatografía gaseosa con muestras realizadas con compouestos standard de
referencia, se optimizaron las mismas y se realizaron con las muestras reales colectadas en los
sitios mencionados.
Las muestras obtenidas para los estudios de residuos de petróleo corresponden a las
zonas de Puerto Madryn, el Golfo San Jorge, Camarones y Puerto Deseado (Fig. 1). La carga y
descarga de buques se produce habitualmente en los puertos de Madryn, Caleta Córdova, KM3
(localidad entre Caleta Córdova y Comodoro Rivadavia donde se cargan buques petroleros) y
Caleta Olivia
Camarones
• Rada Tilly
Figura 1. Lugares de muestreo en el Golfo San Jorge y zonas límites
11
Puerto Deseado
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Enero de 2008
Toma de muestras
Para las determinaciones de TBT la recolección de muestras de las zonas de Mar del
Plata se realizó a comienzos del 2006, en Río Negro entre los meses de agosto-noviembre del
2006, y las restantes durante el 2007, correspondiendo al último período nuevas muestras de
MdP y las de sitios de agua dulce.
La recolección de muestras de residuos de petróleo en suelo se realizó entre los meses
de Febrero a Junio del año 2006, y los residuos en sitios costeros en la misma época del 2007.
En algunos lugares se tomaron muestras con visible contaminación y otras que a, simple vista,
parecieron no contaminadas o limpias (blancos). Los protocolos de selección, obtención y
preservación de las muestras fueron los utilizados en trabajos previos.78,79 Las muestras
recolectadas corresponden, en todos los casos, a sedimentos intermarea superficiales y fueron
obtenidas a una profundidad de 0-3 cm, utilizando un tubo de plexiglass para el caso de
muestras de arena y una espátula en el caso de muestras de grava. No se tomaron muestras a
mayor profundidad porque no se observaron zonas estratigráficas diferenciadas. Los
sedimentos, luego, se transfirieron a recipientes de vidrio y se mantuvieron a -20°C hasta su
posterior análisis.
Técnicas empleadas y Secuencias de análisis
Técnicas y materiales empleados para la preparación y el tratamiento de las muestras.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
*Separación del sedimento de la fase acuosa por decantación.
*Colocar el sedimento en recipientes adecuados para su liofoilización (balones de 100 mL con
esmeril TS 19/19, balones de 250 mL con esmeril TS 24/40, o frascos de liofilización por 150
mL). Congelar la muestra y liofilizar.
Preparación del extracto
*Pesar 2 porciones de muestra de sedimento liofilizado, de 5 gr. c/una y colocarlas en frascos
de centrífuga de aproximadamente 250 mL. Agregar 30 mL de hexano HPLC, y agitar durante
5-10 minutos. Centrifugar la muestra durante 5 o 10 minutos según las características de la
misma. Trasvasar el extracto orgánico a un balón x 100 mL con esmeril TS 19/19. Repetir el
proceso con dos porciones sucesivas de 30 y 15 mL.
*Concentrar la fase orgánica en el evaporador rotatorio, a 30 °C, hasta un volumen de
aproximadamente 5 mL de hexano.
Derivatización:.
Pesar 4 porciones de aproximadamente 85 mg de NaBH4 cada una, en viales con tapa. En el
momento de agregar el borohidruro a la solución de hexano correspondiente, dispersarlo por
agitación en etanol bidestilado, de manera tal que el volumen total de la solución etanólica
agregada sea de 5 mL. Dejar reaccionar cada solución durante 1 hora, agitando la misma
periodicamente.
Pasar luego el contenido de cada balón a la ampolla de decantación de 50 mL conteniendo 10
mL de solución de cloruro de sodio 10 %. Enjuagar el balón con 1 o 2 mL de hexano, agitar, y
decantar la fase acuosa. Pasar la fase orgánica a un balón de 25 mL, enjuagando la ampolla
con 1 o 2 mL de hexano. Secar con sulfato de sodio anhidro, y pasar la solución a un balón de
10 mL con esmeril TS 14/20.
12
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En el Diagrama 1 se presenta la secuencia de determinaciones realizadas. Las
muestras se secaron a temperatura ambiente, hasta peso constante. El contenido de materia
orgánica total (MO) se obtuvo por calcinación a 450 ºC durante 5 hs.
Extracción de compuestos orgánicos
La determinación de compuestos orgánicos se realizó, sobre las muestras secadas. La
cantidad utilizada fue de aproximadamente 100g, y el total de compuestos orgánicos
extractables (COET) se determinó por análisis gravimétrico.
Muestras
calcinado
Secado
Materia orgánica (MO)
Extracción con cloruro de metileno
Extracció alcalina y
Extracción
separación con pentano
Componentes
Orgánicos
Extractables Totales
(COET)
Componentes
minerales
Conductividad
eléctrica
Componentes orgánicos no
saponificables (CONS)
Contenido iónico total
Espectros RMN
NMR
pH
Tamización
Cromatografía
en Columna
Acidez
Acid
Contenido de materiales finos
Difracción por Rx
% de alifáticos (F1)
% de aromáticos (F2)
% de polares (F3)
Caracterización
de los materiales finos
Espectros RMN
NMR
Diagrama 1. Secuencia de análisis
Caracterización de los geosorbentes
Luego de la extracción de los compuestos orgánicos, la fracción mineral de los
sedimentos (geosorbentes) se caracterizaron siguiendo las técnicas analíticas convencionales
para las mediciones de pH (potenciométrico a 25 ºC, extracto 1:5 p/p), contenido iónico total
(conductividad eléctrica a 25 ºC, extracto 1:5 p/p) y granulometría (tamizado de las muestras
secas con tamices de 2 mm y 63 μm).
Extracción y fraccionamiento de compuestos orgánicos no saponificables (CONS)
Aproximadamente 100 g de cada sedimento, previamente secado a temperatura
ambiente hasta peso constante, fue digerido con metanol/ KOH durante 2 h, con calentamiento
a reflujo.80 Posteriormente se realizaron dos extracciones con 50 mL de pentano cada una,
luego los extractos se combinaron. A continuación se realizó una cromatografía en columna,
con el objeto de aislar de los CONS la fracción alifática (F1), aromática (F2) y polar (F3),
respectivamente. Se utilizó como adsorbente silica gel activada. La selección de la metodología
que permite obtener la mejor separación en fracciones, ya fue realizada por nuestro grupo y
algunas de las especificaciones adoptadas fueron: dimensiones de la columna: largo 22 cm y
diámetro 1 cm; activación del adsorbente por secado a 120°C, tamaño de partícula 70 a 230
mesh ASTM; agregado de Cu activado y NaSO4 anhídro; solventes: hexano para la fracción
alifática, benceno para la aromática y una mezcla de metanol:cloroformo (1:1 V/V) para la
fracción polar.78
Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (1H RMN)
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Las mediciones de 1H RMN se realizaron en un equipo Bruker 500 MHz. Cada
corrimiento químico se determinó respecto al tetrametilsilano (TMS) en CDCl3 (Aldrich, 99,8%).
Cuando las señales de la muestra se superponían con las del CHCl3 presentes en el solvente
se corrigió el área del mismo, considerando la proporcionalidad entre el área y el alto de la
señal para el patrón interno.Error! Bookmark not defined. En las mediciones se utilizaron de 10 a 30 mg
de muestra y aproximadamente 2 mL de CDCl3. Las muestras analizadas corresponden a los
COET y las fracciones (F1, F2 y F3) de los CONS.
Fotodegradación de residuos de petróleo en sedimentos con AOPs
Las muestras se expusieron a la luz (L) con (CL) y sin (SL) catalizador. Los catalizadores
utilizados fueron: TiO2 y Reactivo de Fenton (H2O2/Fe+2) agregados conjuntamente. Cada
ensayo se llevó a cabo con 500 g de la muestra, con una humedad inicial del 10%, mediante el
agregado de agua destilada. Los respectivos controles se mantuvieron en la oscuridad (CO y
SO). Evaluaciones preliminares con concentraciones de catalizadores en el rango 0, 1 a 2 %
demostraron que la concentración óptima para el agregado era 1%, coincidentes con estudios
previos.81 Las muestras así preparadas se cubrieron con un film plástico debido a que se
descartó la utilización de cubiertas de vidrio o cuarzo por la imposibilidad de su aplicación en
estudios en campo. Se tomaron muestras al comienzo del ensayo y luego de transcurridos 46
días en el caso de muestras no contaminadas y a los 15, 30, 170, 213 y 259 días en el caso de
las contaminadas. La determinación de hidrocarburos totales en los sedimentos se realizó por
extracción soxhlet, con cloruro de metileno. Las mediciones de 1H y 13C RMN se realizaron en
un equipo Bruker 500 MHz, según la metodología anteriormente mencionada. El corrimiento
químico para los espectros de 13C se determinó utilizando como referencia la señal del CDCl3 a
77 ppm.
Fitotoxicidad de los residuos de petróleo en sedimentos
En los ensayos se utilizó una especie autóctona, Atriplex lampa. Los ensayos de toxicidad
aguda se llevaron a cabo utilizando los Compuestos Orgánicos Extractables Totales (COET).
Además de la especie autóctona, Atriplex lampa, se utilizaron semillas de Lactuca sativa L.
(nombre vulgar: lechuga), a modo de comparación, para ello se siguió la metodología propuesta
por OECD, 74 EPA75 y Torres, 82 que consiste básicamente, en colocar 20 semillas de cada una
de las especies en placas de petri (por triplicado), conteniendo arena, a la cual se contaminó
con 20, 10, 5, 2,5 y 1,25 % p/p de COET. Se determino la inhibición en la germinación y la
elongación de la raíz, como así también el índice de germinación (IG). Para dar cuenta de la
inhibición de la germinación en semillas, se establece la concentración efectiva 50 (CE 50), que
es la concentración que causa efecto sobre el 50 % de las semillas expuestas. Para la
estimación de CE50 en la inhibición de la germinación se utilizó el método del probit,75 el cual se
utiliza cuando se desea establecer la relación concentración-efecto en un ensayo de mortalidad,
donde la variable utilizada es cuantitativa discreta. Este método es paramétrico, y utiliza una
tabla de conversión de unidades, o también se puede utilizar un software suministrado por la
US Environmental Protection Agency (US EPA), el cual se llama Probit Analysis Program, la
versión disponible es la 1.5. Básicamente consiste en transformar el efecto observado, en
nuestro caso inhibición en la germinación, en unidades paramétricas llamadas probit. Esta
conversión se realiza a los fines de que, una vez transformando el efecto en unidades probit y la
concentración ensayada en el logaritmo de la misma, se obtiene una distribución de puntos en
un sistema bivariado de tipo lineal, los cuales pueden procesarse, a continuación, según un
análisis de regresión típico. Además, en el ensayo de inhibición en la elongación de la raíz, se
determina la concentración inhibitoria 50 (CI 50), que es la concentración que causa un 50 % de
inhibición en la elongación de la raíz con respecto al control. En cuanto a otros índices
utilizados como el índice de germinación (IG) y la elongación promedio de la raíz (ER), su
expresión e interpretación se dará más adelante en este mismo informe.
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Ejercicio de intercalibración de TBTs
Además de los estudios propuestos en la Carta Acuerdo, y dentro de los objetivos de este
trabajo, se participó de un ejercicio de intercalibración dirigido por el Dr. José Luis Sericano
(Geochemical and Environmental Research Group, Texas A&M University) de compuestos
butilados de estaño. Se describe brevemente la metodología empleada y los resultados
obtenidos.
Métodos: Se usaron alícuotas de aprox. 1 g de muestra. Se trató el sólido sucesivamente con
30, 30 y 10 mL de hexano. La fase orgánica se concentra a un volumen de 5 mL, bajo vacío a
t. a. Se realiza la reacción con NaBH4 (rango 85-210 mg disueltos en 5 ml de etanol
bidestilado); se trata con 10 ml de solución de cloruro de sodio 10% y se seca con sulfato de
sodio anhidro. Se agrega Dureno como standard interno, se concentra a aprox. 0.1 ml bajo
vacío a t.a. y se somete a análisis por GC.
Condiciones analíticas: Sistema cromatográfico: Cromatografía Gas Líquido
Inyector: Tipo de inyección: Splitless . Temperatura: 200°C. Volumen inyectado: 2 μL
Cerrado del splitter: 1.5 min.. Gas de transporte: Nitrógeno Flujo: 24 cm3 /min. Presión de
cabeza de columna: 50 Kp.
Columna: Tipo de columna y fase estacionaria: HP5 (crosslinked 5 % PH methylsiloxane
Long.: 30 m.; Diámetro interno: 0.32 mm, Espesor del film: 0.25 m.
Detector: FID
Temperatura: 280°C
Programa de temperatura:
hasta
tiempo (minutos)
Temp. inicial
60 °C
2
1ra rampa
10 ° C/min
280 °C
durante
22
2a rampa
0 ° C/min
280 °C
durante
5
3ra rampa
20 ° C/min
290 °C
durante
5
Tabla 3. Concentración de TBT expresada en ng de Sn/g)
Compuesto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Promedio
Tributil estaño
851
879
1084
1250
1220
828
774
517
856
900
833
Método utilizado para confirmar la identidad de los compuestos reportados:
La cantidad de sedimento disponible no permitió realizar una posterior determinación por GCMS, dada la imposibilidad de trabajar en sistema splitless en ese equipo. Se realizó el GC-MS a
una muestra de standards para identificar los compuestos por su MS y tiempos de retención. No
fue posible encontrar ninguna señal en los GC-MS de la muestra de standards que
correspondiera a la estructura de MBT. Los picos correspondientes a DBT y TBT fueron
claramente identificados por sus tiempos de retención en la muestra de standards e
identificados por GC-MS.
Breve comentario de los procedimientos de control de calidad utilizados:
Se usó Hexano HPLC- JTBaker como solvente de extracción y se comprobó su calidad
sometiéndolo a los mismos procedimientos que la muestra incógnita. Procedimiento semejante
se siguió con todos los reactivos utilizados en la derivatización de los OTs.
A una muestra de arena limpia se le agregó una cantidad medida de TBT, se sometió a los
mismos procedimientos que la muestra incógnita, y determinó su concentración: por triplicado.
En todos los casos, se realizó una muestra de “blanco” simultáneamente a las determinaciones.
Breve comentario sobre el Método de Análisis. No se disponía de los reactivos para realizar las
determinaciones con el método de Grignard sugerido, se utilizó la derivatización en hidruros. No
15
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B-C-53
Enero de 2008
se disponía de tropolona (por su excesivo costo), por lo que las extracciones debieron hacerse
solamente con hexano. A fin de verificar la confiabilidad de los métodos alternativos empleados,
se comprobó el % de extracción y de determinación, por triplicado con muestras de arena
conteniendo TBT en concentración conocida.
Resultados: Las concentraciones de TBTs determinadas por nuestro grupo sobre las muestras
enviadas por el Dr. Sericano (Tabla 3) coincidieron un 100% con los datos reales depositados
en el Geochemical and Environmental Research Group, de la Texas A&M University. Si bien la
participación en este ejercicio, demoró el avance en algunos otros estudios relacionados con el
TBT, los excelentes resultados obtenidos, fueron muy satisfactorios para todos los profesionales
de nuestro grupo involucrados en este ejercicio de calibración, e incrementó la confiabilidad en
las metodologías utilizadas en todos los estudios.
VI.
Resultados y Discusión:
Este capítulo está subdividido en 2 grandes partes, a saber:
Sección A Estudios de contaminación con TBT y
Sección B Estudios de contaminación con residuos de petróleo
Las tablas, gráficos, diagramas y figuras se numeran en forma independiente.
A su vez la Sección A está subdividida en:
Parte 1 :ensayos “in vitro” y muestras colectadas en distintos sitios de la costa atlántica y
Parte 2: estudios de efectos de TBT en especies de agua dulce.
SECCION A ESTUDIOS DE CONTAMINACION POR TBT
PARTE 1:
Ensayos de TBT “in vitro” y en muestras colectadas en distintos sitios de la costa
atlántica
Curva de calibración de TBTCl en agua:
Para determinar la reproduciblidad y el rango de linealidad del método se realizó una curva de
calibración para la determinación de TBTCl en soluciones acuosas con concentraciones en un rango
entre 0 y 15 g L-1 (correspondiente a un rango entre 0 y 4.134 g L-1de TBTCL, expresadas como Sn.
La figura 1 muestra la curva de calibración obtenida utilizando el programa Origin version 7.5, que
representa la relación de áreas entre la correspondiente al TBTCl y el área correspondiente al
standard interno (dureno), en función de la concentración del TBTCl agregado.
Para determinar los puntos de la curva de calibración y el límite de detección del procedimiento, se
prepararon soluciones conteniendo cantidades conocidas de TBTCl en metanol en un rango entre 0 y
4134 ng L-1 (expresadas como estaño) por dilución de una solución stock en metanol. Siempre se
analizaron soluciones blanco recién preparadas con agua destilada, para el control de las
determinaciones. En base a los datos de la curva de calibración se calculó el límite de detección: 156
ng Sn L-1 (equivalente a 420 ng TBT L-1), utilizando la siguiente fórmula: LD = (3 x SD
blanco)/pendiente de la recta.
La figura 1 muestra la curva de calibración.
16
PROYECTO PNUD ARG/02/018 SUBPROYECTO
2.0
Enero de 2008
ATBTAD
Linear Fit of Data1_ATBTAD
Upper 95% Confidence Limit
Lower 95% Confidence Limit
1.5
ATBT/AD
B-C-53
1.0
0.5
0.0
0
1000
2000
3000
4000
[Sn] ng L-1
Fig. 1. Curva de calibración de TBTCl en agua.
Rango de concentraciones 0-4.134 g Sn L-1
Para soluciones más concentradas, en el rango 3 a 30 g L-1 de TBTCl (correspondientes a
1.1-11 g a L-1 se obtuvieron similarmente otras curvas de calibración (Fig. 2 no se muestra) Los
parámetros obtenidos con distintos rangos de concentración figuran en la tabla 1a.
Tabla 1a. Parámetros correspondientes a las curvas de calibración en agua.
Rango de concentraciónes
Parámetro
(g)
0-4.134
Aa
Bb
R
Nc
LDd
SDblanco
1100-11000
A
B
R
N
LD
SDblanco
a
Ordenada al origen. bPendiente = sensibilidad.
detección expresado en Sn (ng L-1) .
c
Valor
0.092
4.0 E-4
0.976
32
156
0.021
Error
0.032
1.63 E-5
0.119
0.19
9.6E-2
0.993
14
177
0.016
0.04
3E-3
0.096
Número de determinaciones. dLímite
de
Para calcular la desviación standard del blanco, se realizaron 6 blancos de reactivos, para los cuales
no se observaron señales importantes en el tiempo de retención correspondiente al tiempo de
retención del hidruro del TBTCl (13.8 minutos en las condiciones utilizadas). De modo que se tomó
como ruido del instrumento la señal onbservada en el tiempo de retención considerado.
Procedimiento:
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Preparación de las soluciones: Se colocaron 250 mL de agua destilada en un frasco Erlenmeyer y
se agregaron 2 mL de HCl 1 M. Se agregaron cantidades apropiadas de solución standard de TBTCl
en metanol, de modo de obtener una rango de concentraciones entre entre 0 y 15 g L-1 de TBT. Se
agregaron a cada frasco erlenmeyer 75 mL de solución de hexano : acetato de etilo 70:30, el
recipiente se sometió a agitación magnética durante 20 minutos y se procedió como se describió
anteriormente.
Curva de calibración de TBT en sedimentos.
De la misma manera, se realizaron curvas para sedimentos. Se trabajó con solución Standard
de TBT en hexano, de concentración 2.24 mg/ml, y se prepararon diluciones en el rango en el
rango comprendido entre 85 y 1280 ng de TBT. Se muestran en la Figura 3, con los límites de
confianza superior e inferior.
1.2
AsAis
Linear Fit of Data1_AsAis
Upper 95% Confidence Limit
Lower 95% Confidence Limit
1.0
Area ratio
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
TBT ng
Figura 3: Curva de calibración de TBTCl en hexano.
Rango de concentración: 85-1280 ng (TBTCl)
En la tabla 1b se muestran los parámetros obtenidos de la regresión lineal, ya detallados
anteriormente para las curvas de calibración en agua.
Tabla 1b. Parámetros correspondiente a la curva de calibración en hexano
Rango de
concentraciones
ng TBT
85-1278
Parámetro
Valor
Error
Aa
0.155
0.051
6.9 E-4
0.9325
17
197
0.124
7 E-5
0.106
Bb
R
Nc
LDd
SDblanco
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PROYECTO PNUD ARG/02/018 SUBPROYECTO
a
Ordenada al origen. bPendiente = sensibilidad.
Límite de detección expresado en Sn (ng L-1) .
B-C-53
c
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Número de determinaciones.
d
El límite de detección de la técnica definido como 3 veces la desviación estándar del blanco dividido la
sensibilidad, fue de 540 ng g-1 de TBT (tabla 1b), equivalente a 197 ng g-1 de TBT, expresados como
Sn. Para calcular la desviación estándar del blanco, como en el caso anterior, se realizaron 6 blancos
de reactivos para los cuales, en el análisis por cgl no se observó señal en el tiempo correspondiente al
tiempo de retención del hidruro de TBT (13,8 minutos en las condiciones de corrida dichas
anteriormente). Por lo tanto se tomó como señal el ruido instrumental en ese tiempo de retención.
Determinaciones de TBT en muestras de la costa atlántica.
a) en sitios de la provincia de Buenos Aires
Tabla 2. Concentraciones de TBT determinadas en muestras de agua y sedimento
Concentración de TBTa
Muestra
Agua
Sedimentos
ng L-1
Playa de Mar del Plata
ng g-1
180
160
190
240
200
no determin.
4
400
no determ.
5
300
no determ.
4800d
4300
7
8000d
6500
8
7500d
5000
4800
1300
10
4000
1100
11
4500
1400
0
0
0
0
0
2.5
0
0
1
2
Costa de Mar del Plata
3
6
Puerto de Mar de Platac
9
12
Escollera Norte
Mar Chiquita
13
14
15
Valeria del Mare
Sn totalb
Agua Sedimentos
ng L-1
195
405
ng g-1
no determ.
no determ.
7900
6400
4780
1280
a Concentración
expresada como ng Sn según ref. 5b. Limite de detección para cuantificación: 80 ng/L. b Sn total
determinado por H G A A S. Error  5%. c Zona de gran actividad naviera del puerto de Mar del Plata d Liquido
sobrenadante de sedimento profundo. e Las muestras fueron recolectadas luego de una sudestada (tormenta común
en la zona con fuertes vientos del sur).
Se puede apreciar en la tabla 2, que las muestras provenientes de Mar del Plata muestran altas
concentraciones de TBT, por encima de las informadas por otros autores en otras partes del
mundo83 lo que refleja los altos niveles de contaminación y la falta de un adecuado control,
19
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B-C-53
Enero de 2008
existentes en dicho puerto. Por otro lado, no se detectó TBT en muestras de agua provenientes
de la zona de Mar Chiquita, y escasa contaminación en la zona de playa de la vecina Valeria de
Mar.
b) Análisis de muestras de San Antonio Oeste
Iniciamos los estudios de sedimentos con muestras de mayo de 2006, utilizando cantidades de
muestra de entre 25 y 30 gramos, y se obtuvieron valores muy bajos de contenido de TBT, aún en
zonas con alto índice de imposex, como el Muelle pesquero de San Antonio Oeste. En este caso se
analizaron dos muestras cuyos resultados fueron de 73.9 y 82.5 ng g-1. En base a dichos resultados,
se realizaron ensayos de validación del método, que se describen a continuación:
Se tomaron muestras de arena a las que se agregaron cantidades variables de solución de
TBTCl de concentración conocida. las muestras se homogeneizaron y se secaron por
evaporación a presión reducida. De dichas muestras se tomaron fracciones
de
aproximadamente 10 gr y se determinó el contenido de TBT en las mismas. Los resultados
obtenido figuran en la Tabla 3. En base a los mismos, decidimos reducir la masa de sedimento
a analizar en cada caso, e intentamos modificar el solvente de extracción. El solvente elegido
finalmente fue hexano:acetato de etilo 70:30.
Tabla 3 : Resultados de Pruebas de eficiencia en la determinación de TBTCl
masa de
Concentración Concentración
arena
TBTCl real
TBTCl
% de
Muestra
calculada
recuperación.
1
2
3
4
5
6
7
g
[Sn] ng g-1
[Sn] ng g-1
10.7
11.1
11.0
11.1
11.0
11.1
11.0
6.36
12.77
12.77
127.4
127.4
253.3
510
5.48
8.64
8.24
17.7
5.43
22.8
15
86
71
68
13.3
4.2
9
3.0
Se analizaron muestras de agua de la misma zona, y los datos obtenidos figuran en la Tabla 3. Las
zonas con menor contenido de TBT en agua son Playas Doradas, Balneario de Sierra Grande,
([TBT]= 650 ng L-1) y Villarino ([TBT]= 1930 ng L-1). Este último, está ubicado en zona de mar abierto,
y no se obsserva imposex. El puerto de San Antonio Este, de aguas profundas, ubicado en un lugar
más abierto que el de San Antonio Oeste mostró una concentración de TBT de 2620 ng L-1. Mientras
que en muestras del Puerto de San Antonio Oeste el valor promedio obtenido fue de 3180 ng L -1. Las
zonas de agua más contaminadas corresponden a Punta Colorada, ([TBT]= 6300 ng L-1) muelle de la
Mina de Sierra Grande, y a la zona frente a Alpat, (Compañía Álcalis de la Patagonia. Productora de
Soda Solvay), ([TBT]= 5500 ng L-1). Con respecto al Balneario las Grutas, cercano a San Antonio
Oeste, pero en zona de mar abierto, se obtuvieron valores de 2450 ng L-1 para la Bajada 1 y de 2300
ng L-1 para la bajada 3. (Tabla 4)
Tabla 4: Muestras de agua de San Antonio Oeste
Muestra
Concentración de TBT
ng L-1
Valor medio
20
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1
2
3
4
5
6
7
8
B-C-53
Enero de 2008
2450
3180
5500
1930
650
2310
2620
6300
C) Muestras de la zona de Comodoro Rivadavia
Las primeras muestras analizadas de Comodoro Rivadavia, en las que se trabajó con arena,
utilizando entre 12 y 14 g de muestra, dieron valores de concentración de TBT menores al límite
de detección, si bien las más contaminadas, corresponden a la zona cercana al Puerto. En base
a ensayos de validación del método, utilizando arena limpia, se determinó que el porcentaje de
recuperación de TBT era de un 50%. En muestras de septiembre de 2006, extrayendo con
hexano, y trabajando con cantidades de muestra que variaban entre 2.5 y 5 gramos, en el caso
de los sedimentos, se encontraron cantidades considerables de TBT, salvo en el Puerto de
Camarones, en Caleta Olivia y en el cargadero de combustible de Comodoro Rivadavia. En los
3 casos el material estaba compuesto por piedras. Por un lado estas piedras contienene restos
de hidrocarburos que interfieren en la determinación por cromatografía gaseosa, y por otro lado
probablemente el TBT se adsorbe sólo en la superficie. El material es difícil de extraer. En estos
casos, hemos trabajado con casi 100 g de muestra que dejamos en contacto con las piedras
por varios días o sometimos a agitación incluso en un baño ultrasónico.1
En la Tabla 5 se muestra el análisis realizado sobre muestras de Comodoro Rivadavia,
trabajando con 2.5 a 5 gramos de muestra. Se informan los valores promedio de, al menos, 3
determinaciones. En varios casos, se tamizó la muestra, para trabajar sólo con la parte fina.
Tabla 5 : Análisis de Sedimentos de Comodoro Rivadaviaa
Concentración de TBT
Muestra
[Sn] ng g-1
Valor medio
1
295
2
3
908
4
48
5
6
240
7
257
8
673
9
194
10
11
335
a
Muestras de septiembre de 2006.
En septiembre de 2007, se colectaron otras muestras de la Zona de Comodoro Rivadavia, a
saber, Puerto de Comodoro Rivadavia, Bahía Camarones, (arena gruesa), Caleta Córdova,
1
M. Fernandez, A. de Luca Rebello Wagener, A. M. Limaverde, A. L. Scofield, F. M. Pinheiro, E. Rodrigues.
Marine Environ. Researc 59 (2005) 435-452.
21
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Enero de 2008
cargadero, parte fina y parte gruesa, y en ninguno de estos lugares se detectaron cantidades de
TBT que superaran el límite de deetección del compuesto.
d) Análisis de muestras de Puerto Madryn
En las muestras de Puerto Madryn, se realizaron extracciones con hexano, tanto en muestras
de agua como de sedimentos. La muestra de agua más contaminada, de junio de 2006,
corresponde a la zona de mayor tránsito ([TBT] = 1510 ng L -1. Las menos contaminadas
corresponden a la costanera, con un valor medio de [TBT]= 232 ng L-1 Con respecto al valor
obtenido para la muestra de agua del sobrenadante de sedimento del Muelle Luis Piedrabuena,
(718 ng L-1) hay que tener en cuenta que, si bien es una zona de poco tránsito, en este muelle
anclan cruceros de turismo y naves de la Armada Argentina, y en enero de 2007 se detectó una
mancha de petróleo de casi 200 m, proveniente de un barco de la Armada Argentina. (Tabla 6)
Tabla 6 : Análisis de agua de Puerto Madryn.
Concentración de TBT
Muestra
[Sn] ng L-1
Valor medio
1
232
2
397
3
320
4
514
5
1510
6
574
7
718
En muestras de sedimentos de la zona de Puerto Madryn , entre ellos el puerto, no se
detectaron cantidades apreciables de TBT, trabajando con 12 a 15 g de muestra.
Posteriormente, analizando muestras de septiembre de 2006, se hallaron cantidades
apreciables de TBT en sedimentos de distintos lugares de la zona de Puerto Madryn, que
figuran en la Tabla 7
Tabla 7 :
Análisis de sedimentos de Puerto Madryn.
Concentración de TBT
[Sn] ng g-1
Muestra
Valor medio
1
1782*
2
560
3
232
* Zona de intenso tráfico marítimo. En esta muestra se detectó también DBT (787 ng g-1). Se
trabajó con 2.5 g de muestra liofilizada.
e) Análisis de muestras más recientes de Mar del Plata.
Con estas muestras se utilizaron extracciones con acetato de etilo 70:30, acidificando las
muestras de agua con 2 mL de HCl 1 M. En las determinaciones realizadas con dicha mezcla de
solventes, en el caso de los sedimentos, es notorio el aumento de la eficiencia de la extracción: por
ejemplo, en el caso de los sedimentos de Playa Grande, la diferencia en la concentración de TBT es
de 120 ng g-1 (expresada como Sn), considerando valores de 228 ng g-1 extrayendo con hexano sólo, y
348 ng g-1 extrayendo con la mezcla mencionada anteriormente.
22
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Enero de 2008
Se analizaron muestras de agua de Playa Grande, Escollera Norte y de la Base Naval, que resultó ser
la zona más contaminada, con una concentración de TBT, expresada como Sn de 770 ng g-1. Playa
Grande y Escollera Norte tienen valores muy cercanos entre sí de contenido de TBT, lo cual no es de
extrañar ya que son zonas muy cercanas.
Tabla 9 : Determinación de TBT en agua de la costa de Mar del Plata
Concentración de TBT
[Sn] ng L-1
Muestra
Valor medio
1
532
2
569
3
770
Con respecto al análisis de sedimentos de Playa Grande y Base Naval, a simple vista se notó que el
sedimento de la base Naval era muy impuro.
Se realizó el estudio comparativo entre la extracción con hexano (muestras 1 y 3) y hexano: acetato
de etilo 70:30 (muestras 2 y 4). Se observa en la Tabla 10 que, para este tipo de matriz, la extracción
con hexano: acetato de etilo 70:30 es más eficiente.
Tabla 10. Determinación de TBT en muestras de Mar del Plata.
Muestra
Concentración de TBT
[Sn] ng g-1
Valor promedio
1
2
3
4
228
348
630
700
El sedimento de la Base Naval es un sedimento oscuro e impuro. No se pudieron tomar muestras de
la banquina del Puerto de pescadores, que era la zona más contaminada que encontramos en
estudios anteriores.
f) Análisis de muestras del puerto de Buenos Aires.
Se analizaron muestras recolectadas en agosto 2007. Las muestras de agua son turbias, se dejaron
decantar y se filtraron antes de procesar. Por otro lado, en el análisis por cromatogrfía gaseosa, la
zona en que aparece el hidruro de TBT no es limpia y se integró más de un pico. En estas muestras
se trabajó realizando las extracciones con acetato de etilo 70:30. y las dificultades más importantes se
encontraron al trabajar con muestras de agua, ya que la zona del cromatograma correspondiente al
hidruro de TBT era muy compleja, Los extractos correspondiente a la arenera de Puerto Nuevo, tenían
un color amarillo antes de derivatizar y se necesitó diluir la muestra antes de inyectar en el
cromatógrafo gaseoso. La muestra más contaminada corresponde al agua de la arenera del Puerto
Nuevo ([TBT] = 745 ng L-1), expresada como Sn. (Tabla 11).
Tabla 11. Muestras de agua del Puerto de Buenos Aires a
Muestra
1
2
concentración TBT
[Sn] ng L-1
639
517
23
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Enero de 2008
3
427
4
745
a
Promedio de al menos dos determinaciones
Con respecto a las muestras de arena del puerto de Buenos Aires, se analizaron muestras de arena
de costanera, con un valor medio de 200 ng g-1 y la zona más contaminada resultó ser la zona del
puerto con un valor medio de 252 ng g-1. (Tabla 12).
Tabla 12. Muestras de sedimentos del Puerto de Buenos Aires a
Muestra
concentración TBT
[Sn] ng g-1
1
190
2
253
3
a
Promedio de al menos dos determinaciones
g) Determinación de TBT en la laguna de Chascomús
Hasta el momento las consecuencias del TBT en espejos de agua dulce no son muy conocidas.
Sin embargo el TBT puede causar daños insospechados en estos ecosistemas. A través del
análisis de sedimentos de un sistema de lagos poco profundos utilizados con fines recreativos
en Inglaterra, se ha demostrado que el TBT está asociado a una intensa dramática pérdida de
vegetación sumergida, asociadas a diversas comunidades de fauna.84Se supone el TBT afecta
el ecosistema a través de la reducción de la población de organismos en los lagos2,
promoviendo el reemplazo de macrofitos por fitoplancton. Estos autores, tratan los sedimentos
con hidróxido de sodio y metanol, los transforman en hidruros y los particionan con hexano.
Utilizan cromatografía gaseosa con detección fotométrica de llama (GC-FPD).
Se analizaron muestras de agua de la Laguna de Chascomús, ubicada en la Provincia de
Buenos Aires. Se tomaron dos muestras de agua, una cerca de las escalinatas del Balneario,
en la zona más poblada de la laguna, y otra en una zona limnosa, sin balneario. Se obtuvieron
los valores que figuran en la Tabla 13, que muestran la existencia de TBT aún en espejos de
agua dulce.
Tabla 13. Muestras de agua de la Laguna de Chascomúsa, b
Muestra
1
2
a
concentración TBT
[Sn] ng L-1
1140
840
Promedio de al menos dos determinaciones. b La identidad de los picos
correspondientes al TBT fue confirmada mediante CG-MS.
24
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Enero de 2008
Sección 2: Estudios de efectos de TBT en especies de agua dulce.
Con respecto a los ensayos con muestras biológicas, se comenzó en las técnicas de cultivo de
ampularias y de fisas. Con estas últimas se realizaron estudios de los efectos de TBT en
huevos y se determinó su ciclo de vida de aproximadamente 30 días. Se decidió continuar con
las ampularias por tener mayor ciclo de vida y resultar los tiempos más prolongados. Se escogió
la especie Pomacea canaliculata (conocida vulgarmente como Ampularia). A tales efectos, se
recolectaron individuos de tamaños diversos de la zona de Palermo y se establecieron peceras
para su cultivo en el laboratorio. Se colocaron en agua declorada, alimentaron “ad limitum” con
lechuga, en ambiente con fósiles para la provisión de calcio y se organizó un sistema de luzoscuridad de 18-6 h para acelerar su crecimiento y fertilidad. A fin de obtener resultados
confiables, todos los ensayos se hicieron con individuos nacidos en este ambiente de cultivo en
laboratorio.
Ensayos agudos: Determinación del parámetro CL 50
Por determinación de la concentración a la que muere el 50 % de los organismos expuestos,
determinándose a partir de la curva dosis respuesta mediante el programa de computación
Probit, para organismos de 1 y 5 semanas de edad.
Procedimiento: Se utilizaron 168 organismos de 1 semana de edad, y 105 organismos de 5
semanas de edad, en peceras con aireación permanente, alimentación ad libitum y recambio de
agua semanal (estas condiciones valen para todos los ensayos realizados). Se colocaron 8
organismos por concentración ensayada, en recipientes de 360cm3 con un volumen de 250cm3
de solución. Se ensayaron 7 concentraciones de TBT(5; 7.5; 10; 12,5; 15; 20 y 40 μg TBT/l ) y
un control de solvente (agua-metanol). Las soluciones se renovaron cada 24 horas y se registró
el número de individuos muertos en el momento de la renovación, durante 96 h. Resultados: El
CL 50 arrojado por el programa Probit fue de 9.4 μg TBT/l, (Intervalo de confianza de 8.6-10.2
μg TBT/l ); y de 29.32 μg TBT/l, (Intervalo de confianza de 24.31-35.32 μg TBT/l) para
organismos de 1 y 5 semanas de edad, respectivamente. Se comprueba que a menor grado de
desarrollo de los organismos es más toxico el TBT.
Ensayos crónicos: Determinación de parámetros LOEC y NOEC
Con el fin de estimar por parámetros observacionales y cuantificables, los valores LOEC y
NOEC, se expusieron los organismos a un ensayo crónico de 35 días de duración total, con
renovación de las soluciones 2 veces por semana. Se utilizaron 120 organismos de 1 semana
de edad de una misma camada. 10 recipientes de 360 cm3 con un volumen de 250 cm3 de
solución. Para todas las concentraciones ensayadas se realizó una réplica. Por cada
tratamiento se utilizaron 24 organismos, 12 en cada réplica. (n: 12, N: 120) Se ensayaron [TBT]:
0.875 μg TBT/l ; 1.75 μg TBT/l ; 3.5 μg TBT/l y 7 μg TBT/l de solución y un control de
solvente (agua-metanol) y se determinó por calibre la tasa de crecimiento.
Preparación de las soluciones utilizadas
Se preparó una solución madre de 11.2 mg TBT/10ml de metanol. De la misma se realizó una
dilución 0.1/10 ml con agua declorada obteniéndose una solución de concentración 11.2 ug
TBT/ml, la cual se utilizó para realizar todas las soluciones de este ensayo. En todas las
concentraciones ensayadas y el control agua-metanol se mantuvo la misma concentración final
de metanol para una correcta estandarización de las condiciones del presente ensayo. La
misma fue de 50 μl MeOH/l.
RESULTADOS:
Control Los organismos mostraron una tasa de crecimiento de semana a semana de un factor
de aproximadamente 2. A partir de la tercer semana la tasa de crecimiento se hace menor con
un factor de, en promedio, 1,5. A medida que los organismos crecen, van ganando más peso en
25
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Enero de 2008
gramos pero la tasa se hace un poco menor que al principio. Llegaron a un peso promedio/
individuo (Pppi) de 0,278 gramos. (Ver Fig. 4)
Crecimiento promedio en función del tiempo.
Control de los ensayos.
0.8
0.7
Peso promedio (gramos)
0.6
Control A
Control B
0.5
Polinómica (Control B)
Polinómica (Control A)
0.4
3
2
y = 0.0005x + 0.0026x + 0.0142x - 0.0011
0.3
2
R = 0.9996
3
2
y = 0.0015x - 0.0093x + 0.0514x - 0.0263
0.2
2
R = 0.9973
0.1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Tiempo (semanas)
Figura 4: Control. Los datos se ajustaron usando una ecuación poli nómica de grado 3
0.875 μg/L :
De una de las réplicas se mueren a los 10 días 2 organismos y luego 7 organismos más a las 2
semanas sobreviviendo 3 de ellos hasta el final del tratamiento. De la otra réplica se muere sólo
1 organismo a los 28 días de tratamiento,
En el recipiente donde se mueren la mayoría de los organismos en 2 semanas, el peso
promedio alcanzado fue de 0.74 gramos (Pppi del control: 0.28 gramos). En cambio, en su
réplica, donde sobrevive la mayoría de los organismos el Pppi es de 0.24 g.
Peso promedio en funcion del tiempo.
Concentración 0.875 ugTBT/l.
0.8
3
2
y = -0.0117x + 0.1436x - 0.3598x + 0.2527
2
R = 0.9951
0.7
Peso promedio (gramos)
0.6
0.5
0,875 UG/L 1
0,875 UG/L 2
0.4
Polinómica (0,875 UG/L 2)
Polinómica (0,875 UG/L 1)
0.3
0.2
3
2
y = -0.002x + 0.0233x - 0.0313x + 0.023
0.1
2
R = 0.9962
0
0
1
2
3
4
5
6
7
-0.1
Tiempo (semanas)
Figura 5 Concentración 0.875 g TBT/l. En la replica 1 se mueren 9 organismos al entrar a la
segunda semana de ensayo. Se observó un crecimiento acelerado de los 3 organismos que
sobreviven. El peso alcanzado por organismo en esta replica fue mucho mayor (0,74g) que en
los individuos control (Peso promedio alcanzado: 0,29g).
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Enero de 2008
Al observar semejante diferencia entre ambas réplicas, (debido al diferente volumen disponible
por individuo), se resolvió realizar un ensayo donde se estudie el efecto del volumen por
individuo en el peso y crecimiento de los individuos. No se tuvo en cuenta al iniciar este ensayo
la posible muerte de los organismos por causas ajenas al tratamiento con el tóxico y su
influencia en el parámetro que se estaba midiendo (peso promedio alcanzado por individuo).
1.75 μg/L :
De una de las réplicas se mueren 6 organismos a la segunda semana de tratamiento. Luego
muere un individuo más a la cuarta semana. En la réplica donde no se muere ningún
organismo, la tasa de ganancia en peso promedio por individuo durante las 2 primeras semanas
fue mayor que luego en las siguientes semanas. Sin embargo, en la réplica donde se mueren 6
organismos la tasa de ganancia en peso promedio no se ve disminuida durante las siguientes
semanas (Ver Figura 6).
Peso promedio en función del tiempo.
Concentración: 1.75 g TBT/l
0.8
1,75 UG/L 1
1,75 UG/L 2
0.7
Polinómica (1,75 UG/L 1)
0.6
Peso promedio (gramos)
Polinómica (1,75 UG/L 2)
0.5
3
2
y = -0.004x + 0.0539x - 0.1356x + 0.1068
2
R = 0.993
0.4
0.3
0.2
3
2
y = -5E-05x + 0.0095x - 0.0114x + 0.0173
2
R = 0.9995
0.1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Tiempo (semanas)
Figura 6: Comparando con la concentración 3,5 μgTBT/l 2 en la que quedaron sólo 2
organismos y el peso fue de 0,67g, en este ensayo se mueren sólo 6 organismos en una de las
réplicas y el peso es 0,37g.
3.5 μg/L :
De una de las réplicas se mueren 10 organismos y sobreviven 2 hasta el final del
tratamiento. De la otra réplica mueren los 12 organismos a la segunda semana de tratamiento.
En la réplica donde sobrevivieron 2 organismos se observó una tasa de crecimiento de
aproximadamente 2.44 durante las 2 primeras semanas de tratamiento y luego la tasa
disminuyó. Sin embargo, al quedar sólo 2 individuos la ganancia de peso promedio por ndividuo
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al final del tratamiento fue mucho más alta que en los organismos control (0.67gramos).
Crecimiento promedio en función del tiempo.
Concentración 3.5 ugTBT/l.
0.8
0.7
y = 0.0048x3 - 0.0175x2 + 0.0475x - 0.0187
R2 = 0.9996
Peso promedio (gramos)
0.6
3,5 UG/L 1
3,5 UG/L 2
0.5
Poly. (3,5 UG/L 2)
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Tiempo (semanas)
Figura 7: El crecimiento ó la tasa promedio de ganancia de peso por semana y por organismo
es mucho mayor que en organismos control. (Peso alcanzado promedio: 0,2779g). Cabe
destacar que esto se cumple en la replica en la que quedaron solo 2 organismos vivos. En la
otra replica se mueren todos a la segunda semana.
7 μg/L :
Los organismos de una de las réplicas se mueren a la primera semana de tratamiento.
De la otra réplica se mueren a las 2 semanas. Por lo tanto no se pudo seguir el crecimiento de
los organismos a lo largo del tratamiento.
Conclusiones : Los organismos expuestos a la más alta concentración han muerto entre la
primer y segunda semana de exposición, y los expuestos a la siguiente concentración mas alta
han muerto casi en su totalidad al cabo de 2 semanas.
Los organismos que han quedado de
a dos o de a tres en los recipientes de ensayo han experimentado una tasa de crecimiento
acelerado con respecto a su réplica con los organismos iniciales con los que se inició el ensayo
(0.875 μg TBT/l 1, 1.75 μg TBT/l 2).
Estudio del rol de 3 condiciones de cultivo en el crecimiento (en cm) y en el peso (en
gramos) de organismos de la especie Pomacea canaliculata, Duración total de 20 semanas
(140 días ó 5 meses).
21 caracoles de 2 semanas de edad, se colocaron 7 caracoles en cada recipiente. Desde el
primer día de inicio se midió el tamaño de cada uno de los individuos. Se pesaron todos los
individuos juntos y luego se calculó el peso promedio por individuo. Se los debió pesar a todos
juntos debido al pequeño tamaño de los mismos al comienzo del ensayo (aproximadamente 4
mm). También se evito la muerte accidental de los mismos por el manipuleo. Se utilizaron 3
recipientes de los siguientes volúmenes: 1500 ;750 y 360 ml. Se colocaron 1000 ml, 500 ml
y 250 ml de agua declorada en cada uno de los recipientes y se renovaba 2 veces por semana.
Se midió una vez por semana el peso promedio por individuo y el tamaño de cada uno de ellos.
Resultados: Existió una clara evidencia de la existencia de una correlación entre el volumen de
agua por individuo, a utilizar para crecer, y el peso y tamaño de los mismos alcanzado al final
del ensayo. Todos los individuos utilizados provenían de una misma camada. Eran juveniles de
2 semanas de edad.
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Tabla 14: resultados obtenidos al final del ensayo
Peso promedio por individuo Tamaño
promedio
por
alcanzado al final del ensayo individuo alcanzado al final
(gramos)
del ensayo (cm)
250 ml
1.37
1.65
500 ml
1.95
1.87
1000 ml
2.72
2.08
Tanto el peso como el tamaño de los individuos mostraron un claro incremento a lo largo del
ensayo ajustando con alto grado de precisión a una ecuación polinómica de grado 3. Durante
las primeras semanas el aumento en peso y en tamaño fue muy marcado pero luego los
individuos comenzaron a mostrar un estancamiento llegando a un plateau durante las últimas 5
semanas de ensayo. Esto es causado por el limitado volumen de agua de cultivo que posee
cada individuo para poder crecer y desarrollarse, al ir pasando las semanas.
Dentro de cada
uno de los recipientes, se observó una cierta diferencia entre los individuos, alcanzando
algunos, pesos y tamaño dispares, debido a la varianza intrapoblacional normal.
Sin
embargo, los organismos expuestos a mayor volumen de agua de cultivo, y a pesar del estrés
que significa pesar y medir a los individuos una vez por semana, han empezado a poner huevos
2 semanas antes de concluir el ensayo. Para el momento en que pusieron los huevos los
individuos tenían 20 semanas de edad (5 meses). En total han colocado 6 puestas hasta el
momento.
Se observó claramente que los individuos cultivados en un volumen mayor (1000
ml) alcanzaron al final y durante el ensayo un peso y tamaño muy superiores a los alcanzados
por individuos cultivados en volúmenes menores (500 y 250 ml). Por lo tanto. en ensayos
posteriores en los que se midan tanto peso como tamaño promedio por individuo, se debe tener
en cuenta que la parcial mortalidad de los organismos dentro de las replicas induce a un error
en el parámetro medido, debido a la aceleración en el crecimiento, debida al aumento del
volumen de solución por individuo para crecer y desarrollarse. Se puede concluir también
que a los 5 meses de edad y habiendo nacido los organismos en enero, los mismos se
encontraban ya desarrollados para iniciar su ciclo reproductivo
Tratamiento
Variacion del peso promedio en función del tiempo
3
2
y = -0.0003x + 0.0082x + 0.1102x - 0.1297
2
R = 0.9928
2.50
3
2
y = -0.0003x + 0.0077x + 0.0669x - 0.0787
Peso promedio (gramos)
2.00
2
R = 0.9959
.
1.50
3
2
y = -0.0003x + 0.0067x + 0.0481x - 0.0624
1.00
2
R = 0.9953
250
500 ml
0.50
1000 ml
Polinómica (500 ml)
Polinómica (250)
Polinómica (1000 ml)
0.00
0
5
10
15
20
Tiempo (semanas)
25
30
Figura 8 Se alcanza un plateau a las últimas semanas de ensayo para las 3 condiciones
de cultivo.
29
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B-C-53
Enero de 2008
Variacion del tamaño promedio en función del tiempo
2.40
3
2
y = 0.0004x - 0.0172x + 0.2907x + 0.1906
2
Tamaño promedio por individuo (cm)
R = 0.9916
3
2
y = 0.0003x - 0.0133x + 0.2407x + 0.2213
1.90
2
R = 0.9901
3
2
y = 0.0002x - 0.0103x + 0.2021x + 0.2253
1.40
2
R = 0.9923
250 ml
500 ml
1000 ml
Polinómica (250 ml)
Polinómica (500 ml)
Polinómica (1000 ml)
0.90
0.40
0
5
10
15
20
25
Tiempo (semanas)
Figura 9 El tamaño promedio también alcanza un plateau a las últimas semanas de ensayo
Ensayos con organismos recién nacidos.
100 organismos recién nacidos de una misma camada para ser expuestos al toxico. Se dispuso
de frascos de 360 ml con 250 ml de solución cada uno. [TBT]: 4 µg ;8 µg /l; 12 µg y 16 µg TBT
/l y solución control con agua declorada-metanol.
Resultados: A las 48 h la alimentación de los organismos para todas las concentraciones y sus
réplicas fue normal y todos los organismos se encontraron vivos. Sin embargo ya a las 96 horas
los que fueron expuestos a mayor concentración no comieron casi nada. A la semana de
iniciado, el ensayo se renovaron las soluciones y se encontraban todos los organismos vivos.
Sin embargo los organismos expuestos a las mayores concentraciones, de 8 µg TBT/l en
adelante ya mostraban un tamaño mucho menor y una ausencia casi total de alimentación. A
los 19 días de exposición al tóxico los organismos expuestos a 16µgTBT/l (ambas réplicas) se
encontraban muertos. En general los organismos expuestos a la menor concentración del tóxico
se comportaron igual que el control en cuanto a la alimentación y el grado de aumento de
tamaño (observación cualitativa). Los organismos expuestos a 8 µgTBT/l también mostraron un
patrón casi normal de alimentación.A los 26 días de exposición al tóxico los organismos de 12
µg TBT/l murieron casi todos. De los 10 organismos por réplica que eran, sólo sobreviven 4 de
una de las réplicas (sólo el 20%). A las 7 semanas de tratamiento (49 días) se colocó a todos
los organismos en agua declorada, previa medición de tamaños de cada uno de los
tratamientos para poder comparar los crecimientos de cada uno, lo cual reflejaría de alguna
manera la toxicidad del TBT.Es importante aclarar que no se observaron muertes ni falta de
alimentación en los organismos pertenecientes al ensayo control.
Cinética de degradación-asimilación de TBT en agua en presencia de organismos de la
especie Pomacea canaliculata.
Metodología . 32 organismos de 4 meses; fueron divididos en 5 grupos de acuerdo al peso, de
forma que todos los recipientes tuvieran aproximadamente la misma biomasa de individuos
(10.4 g). Se ensayaron : 18 µg y 9 µg TBT/L con sus respectivas réplicas. Para ello se utilizó
una solución madre de 900µg TBT/ml, y se realizaron las diluciones necesarias para obtener las
30
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B-C-53
Enero de 2008
Concentración de TBT (ug/L)
[TBT] requeridas. Se agrego la cantidad de metanol requerida para nivelar su concentración en
todas las soluciones debido a que la solución madre utilizada contiene dicho solvente. Se
utilizaron recipientes de 1.5 L, con 1 L de la solución correspondiente. Se realizaron dos
controles, uno con agua declorada-metanol (en presencia de organismos) en la misma
concentración que en los ensayos, para verificar que el metanol no afecta al comportamiento de
los organismos y otro con [TBT]=18 µg TBT/L sin organismos para verificar si hay o no una
disminución de la concentración de TBT en ausencia de los mismos.
No se los alimentó durante el ensayo, pues en estudios previos se observó una marcada
disminución en [TBT] en recipientes que sólo contenían alimento y la solución correspondiente,
éstas se renovaron inmediatamente después de la toma de cada muestra. Al finalizar este
periodo de exposición se colocaron los organismos durante cuatro días en agua declorada con
la finalidad de medir liberación de TBT al medio. Por otro lado, se observó el comportamiento de
los organismos en cada recipiente.
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
20
40
60
80
100
120
Horas
9 ug/L iniciales (A)
9 ug/L iniciales (B)
18 ug/L iniciales (B)
18 ug/L iniciales (control)
18 ug/L iniciales (A)
Figura 10: Concentración de TBT en las soluciones en función de las horas de
exposición de los organismos.
Tabla 15: Resultados obtenidos de la valoración de TBT para los distintos tiempos.
Horas
acumuladas 9 g /L (A) 9 g /L (B) 18 g /L (A) 18 g /L (B)
6
4,5 g /L
4,9 g /L
8,7 g /L
8,2 g /L
26
1,5 g /L
3,3 g /L
12,5 g /L
14,6 g /L
54
1,2 g /L
0,9 g /L
10,0 g /L
11,7 g /L
78
2,3 g /L
1,9 g /L
10,6 g /L
12,6 g /L
104
3,3 g /L
3,0 g /L
12,0 g /L
10,4 g /L
Control
(18 g/L)
17,6 g /L
18,7 g /L
18,5 g /L
De la diferencia entre la concentración de TBT inicial y la concentración de TBT en las
soluciones al cabo de las horas de exposición correspondientes se obtiene la concentración de
TBT degradado/absorbido por los organismos (Figura 11).
31
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TBT degradado/absorbido (ug)
Figura 11: Concentración de TBT degradado/absorbido por los organismos al cabo de
las horas de exposición correspondientes. Se observa que a partir de las 54 hs los puntos
comienzan a superponerse. Esto estaría indicando que al cabo de un tiempo la cantidad de
12
10
8
6
4
2
0
0
20
9 ug/L iniciales (A)
40
60
80
Horas acumuladas de exposición
9 ug/L iniciales (B)
18 ug/L iniciales (A)
100
120
18 ug/L iniciales (B)
TBT degradada/incorporada por los organismos es la misma, independientemente de la
concentración ensayada. Luego de las 96 hs de colocados los organismos en agua, se
detectaron las concentraciones de TBT indicadas en la Tabla 16.
Tabla 16: Concentración de TBT detectada en el agua donde se colocaron los
organismos previamente expuestos a 9 y 18 g/L de TBT.
Concentración inicial (g/L)
9 (A)
9 (B)
18 (A)
18 (B)
Concentración final (g/L)
0.11
0.23
0.59
0.34
Al día siguiente de comenzado el ensayo el comportamiento de los organismos
observado en todos los recipientes fue normal. La adherencia al recipiente fue completamente
normal (uno de los efectos primarios detectados en ensayos previos de exposición a TBT fue la
falta de adherencia, dependiendo de la concentración utilizada). A las 54, 78 y 104 horas no se
observan cambios en el comportamiento para ninguna de las concentraciones utilizadas. Se
toma la ultima muestra de los recipientes y se colocan todos los organismos en agua declorada.
En el control, todos los organismos se observan adheridos al borde del recipiente y con buena
movilidad. Tanto los tentáculos como el sifón se encontraban en buenas condiciones. En los
organismos expuestos a TBT el sifón se observa deteriorado y laxo y los tentáculos se curvan,
denotando un cierto efecto debido a la exposición al tóxico. Esto se observó en ambas
concentraciones utilizadas, pero fue más notorio en la concentración mayor. Finalizado el
ensayo, todos los organismos sobrevivieron, tanto los del control como los expuestos a TBT. No
se observó recuperación una vez colocados en agua declorada.
Conclusiones
Se observa que inicialmente hay un descenso considerable en la concentración de TBT
para ambas concentraciones iniciales. Sin embargo, a partir de las 26 hs el descenso ya no es
tan abrupto y las concentraciones comienzan a oscilar alrededor de un valor (distinto para cada
32
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concentración). Pero lo más llamativo se observa en la Figura 2, donde se puede apreciar que,
para ambas concentraciones ensayadas, al cabo de un tiempo la cantidad de TBT
degradada/incorporada por los organismos similar. Se repite este ensayo durante un intervalo
de tiempo mayor para observar si esta tendencia se mantiene. Si esto es así, podría estar
indicando cierta capacidad de bioacumulación de los organismos.
Cinética de degradación de TBT en agua conteniendo organismos de la especie
Pomacea canaliculata durante las primeras 24 hs de exposición
Se midió la concentración de TBT en el agua al cabo de 2, 4, 6, 9, 12, 18 y 24 horas de Se
utilizaron 56 organismos en total, cuyo tamaño promedio era 1.72 cm. Se realizaron
controles con solución de la misma concentración que en todos los recipientes (11.4 g/L) y
los mismos se midieron a las 12 y a las 24 horas.
Figura 12: [TBT] en las soluciones en función del tiempo de exposición
Si bien se observa una disminución considerable a partir de las 2 hs, Se repetirá para
verificar los resultados
Réplica: 43 organismos en total, cuyo tamaño promedio era 1.77 cm distribuidos en 6
recipientes. Los mismos tenían una capacidad de 1.5 L y el volumen de solución para todos los
ensayos fue de 1 L. Se preparó el volumen total de solución empleado en el ensayo con el fin
de evitar una posible fuente de error y asegurar que todos los recipientes en donde los
organismos fueran expuestos al TBT tuvieran la misma concentración inicial. La concentración
de TBT utilizada fue 28.3 g/L
30
TBT (ug/L)
25
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
Horas de exposición
Con caracoles
25
30
35
Control
Figura 12: Concentración de TBT en las soluciones en función del tiempo de
exposición de los organismos
Se observó una caída muy abrupta (aproximadamente a la mitad de la concentración inicial
utilizada) en la concentración de TBT En las horas 12, 24 y 30 la concentración de TBT medida
es casi la misma indicando probablemente una capacidad de degradación/asimilación ya
saturada Estos resultados son coherentes con los obtenidos para el primer ensayo realizado
con dos concentraciones (18 y 9 μgTBT/L) La curva obtenida (Figura 13, no se muestra)
reproduce la figura 12.
Comparar la capacidad de degradación/asimilación de TBT de organismos previamente
expuestos al tóxico de manera crónica con la de aquellos nunca antes expuestos. 20
organismos de 7 meses de edad, los cuales habían sido expuestos a una concentración
constante de TBT de 13 μg/L durante los 2 meses previos al ensayo, con renovación de la
solución cada 48 horas y alimentación ad libitum. El tamaño promedio de los organismos era de
1.92 cm. Durante las 24 horas antes de comenzar el ensayo, los organismos fueron colocados
en agua declorada. [TBT] = 30.2 g/L .Se realizaron 2 controles en ausencia de caracoles con
33
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Enero de 2008
solución de TBT de la misma concentración que en todos los recipientes y se midió la
concentración de TBT a las 12 y 24 h.
35
TBT (ug/L)
30
25
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
Horas de exposición
Con caracoles
25
30
Control
Figura 14: Concentración de TBT en las soluciones en función del tiempo de exposición
Nuevamente se observó una caída abrupta hasta un poco menos de la mitad de la
concentración inicial (C.i) de TBT en las primeras 2h., a las 6 h cayó al 27 % alcanzando un
plateau a las 12 y 24 h.
35
TBT (ug/L)
30
25
20
15
10
5
0
0
5
10
Con caracoles no expuestos
15
20
25
Horas de exposición
30
35
Con caracoles previamente expuestos
Figura 15: Concentración de TBT en las soluciones en función del tiempo de exposición de
los organismos, comparando ambos ensayos.
Analizando los resultados obtenidos para ambos ensayos (Figura 15) se concluye que no hubo
diferencias apreciables en el grado de disminución de la concentración de TBT,. Se puede
concluir que los organismos asimilan o degradan la misma cantidad de TBT en el mismo
tiempo, independientemente de haber sido expuestos o no al TBT con anterioridad.
34
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Enero de 2008
Este resultado es muy importante ya que se esperaba obtener una menor capacidad de
degradación/asimilación de TBT de parte de organismos previamente expuestos al tóxico de
manera crónica, por su diferente grado de sanidad con respecto a aquellos organismos nunca
expuestos al tóxico.
Con nuevos estudios posteriores se podrían obtener resultados más contundentes en cuanto a
la capacidad de los organismos de la especie Pomacea Canaliculata, para disminuir la
concentración de TBT en los cuerpos de agua dulce contaminados (bioremediación).
Tendríamos que verificar su capacidad de posibles bioacumuladores, en distintas condiciones
de pH, salinidad y temperatura entre otros factores.
Ensayos de sensibilidad a TBT en Pomacea canaliculata.
en organismos de Pomacea canaliculata de 3 semanas de edad, determinando la (CL50), a
partir de la curva dosis respuesta mediante el programa de computación Probit. 1 192
organismos, 8 organismos/ [TBT]ensayada, en 12 recipientes de 1500 cm3 con 1000 cm3 en
los que se colocaron 8 organismos por concentración ensayada, realizando una replica por
cada concentración. Se ensayaron 5 concentraciones de soluciones de TBT en agua declorada
y un control de solvente (agua-metanol). Las soluciones se renovaron cada 24 horas CL 50 =
9.89 μg TBT/L, con un intervalo de confianza de (8.210-11.858) g/L. Pendiente: 5.595,
Ordenada al origen: -17.354, Varianza de la pendiente: 0.9467 Coeficiente de correlación:
0.9013;Chi cuadrado total: 36.687;Chi cuadrado de la regresión: 33.068
Evaluar el efecto del TBT en la oviposición de organismos de la especie Pomacea
canaliculata. 18 individuos de 7 meses de edad (de los cuales se había observado
previamente su capacidad de oviposición) en un recipiente de 2 L con 1.5 L de solución de
[TBT] 7.8 g/L (concentración levemente superior a la concentración NOEL determinada en un
ensayo previo). La solución se renovó en promedio cada 6 días y los organismos fueron
alimentados ad libitum. Se llevó a cabo este procedimiento durante 70 días, luego de lo cual los
organismos fueron colocados en agua para evaluar un posible retroceso de los efectos del
tóxico.
Resultados Antes de la exposición a TBT, la frecuencia de oviposición promedio registrada era
de 1 puesta cada 7 días. Luego de colocados en TBT, la frecuencia de oviposición se mantuvo
constante (mientras hubo puestas), pero se registraron cambios en la forma y el tamaño de las
puestas. A partir de las 48 h no hubo nuevas puestas. Durante el transcurso del ensayo
murieron 7 organismos. Luego de colocados en agua fueron observadas parejas en cópula,
pero no se registraron nuevas puestas de huevos hasta los 40 días desde que se los colocó en
agua. Con el paso del tiempo de exposición a TBT, el aspecto y tamaño de las puestas fue
empeorando, volviéndose cada vez más irregulares, deformadas y pequeñas. En el futuro sería
apropiado repetir el ensayo con una concentración menor y retirar los huevos del recipiente
para evaluar su viabilidad. Por otro lado, los dos nacimientos registrados fueron a solo 4 días de
la oviposición. Este tiempo está muy por debajo del tiempo medio entre oviposición y
nacimientos (que es de aproximadamente 10 días, dependiendo de la estación del año), y
podría estar indicando una aceleración en los procesos vitales de los organismos por acción del
TBT. Sin embargo para sacar conclusiones al respecto hay que hacer nuevos ensayos.
35
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SECCION B:
ESTUDIOS DE CONTAMINACION POR RESIDUOS DE PETROLEO
En la Tabla 1 se presentan los resultados obtenidos en cuanto a la caracterización de
los sedimentos. La descripción que corresponde a cada locación da una idea de su ubicación
geográfica. En la Tabla 1 se muestran algunas características de la fracción mineral de los
sedimentos (pH y conductividad eléctrica).
Tabla 1. Características de las muestras
Muestras de sedimentos costeros
Locación
CAM1
Descripción
Camarones - Caleta Sara
Camarones –
Puerto
Puerto Deseado - Puerto - 1
Puerto Deseado - Puerto - 2
Puerto Madryn – Puerto
Puerto Madryn - Costanera
Rada Tilly – Playa
Comodoro Rivadavia
Caleta Olivia - Muelle
Caleta Olivia - Balneario
Caleta Cordova - Cargadero
Calata Córdova - Costanera
fracción mineral
Conductividad
pH
(dS)
8,4
1722
MOa
g/100 g
sedimento
2,4
CAM2
6,9
322
0,4
PD1
8,2
1380
1,3
PD2
6,8
1438
0,3
PM1
7,8
2110
0,4
PM2
7,6
2020
0,3
RT
8,4
1785
0,6
CR
8,2
1577
0,5
CO1
7,6
2740
0,3
CO2
7,7
1136
0,8
CC1
8,0
1917
6,9
CC2
8,0
550
1,5
CR2
KM3 – Playa
7,7
316
0,5
Materia orgánica (MO) a Compuestos Orgánicos Extractables Totales (COET)
Saponificables (CONS)
a
COETb
mg/g
MO
12,7
CONSc
mg/g
MO
1,9
17,2
9,3
98,2
14,6
113,0
34,2
92,7
21,6
175,3
18,5
12,5
6,2
15,7
9,1
25,1
1,2
8,6
0,9
786,7
632,9
81,6
28,3
33,4
7,4
Compuestos Orgánicos No
El pH está comprendido entre 6,9 y 8,4, mientras que la conductividad eléctrica está
comprendida entre 316 y 2700 dS. Los valores bajos de conductividad eléctrica de las muestras
de CAM2, CC2 y CR2, podrían deberse a la presencia de desagües de aguas domiciliarias que
en forma simultánea afectarían la zona. Esta presunción es verificable en el caso de CR2.
En la Figura 1 se muestra la composición granulométrica de los sedimentos. Puede
observarse que mayoritariamente corresponden a gravas y solo en el caso de Caleta Córdova,
Comodoro Rivadavia, Rada Tilly y una de las muestras de Puerto Madryn, el sedimento es de
arena, siendo los materiales finos escasos o inexistentes en todas las muestras. Para poder
comparar diferentes muestras los resultados se normalizaron con respecto al contenido de MO.
Los CONS son, en todos los casos inferiores a los COET, lo cual indica que son un subgrupo
de estos últimos y estaría formado principalmente por hidrocarburos. En el caso de la muestra
rotulada CC1 (Caleta Córdova – Cargadero) los CONS representan el 80% de los COET,
seguido por CR1 (Comodoro Rivadavia) que representa el 58%, respectivamente. De esta
forma, la relación entre ambos podría, en principio, ser indicativa de contaminación proveniente
de la actividad petrolera, siempre y cuando se asuma que esta actividad es la que
principalmente hace el aporte de hidrocarburos a los sedimentos.
CR2
CC2
CC1
CO2
locación
CO1
CR1
RT
PM2
PM1
gravas
PD1
arena
finos
PD2
36
CAM1
CAM2
0%
50%
% p/p de sedimento
100%
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Figura 1. Granulometría de los sedimentos costeros
Índices basados en el fraccionamiento por Cromatografía en Columna
Se fundamentan en la separación de los compuestos orgánicos no saponificables en
grupos de características similares.85, 86 Por ejemplo: F1, F2 y F3 representan el porcentaje de
componentes de características globales alifáticas, aromáticas y polares, respectivamente. Se
dice “globales” para tener presente que un componente que pertenezca, por ejemplo a la
fracción alifática porque fue eluído con hexano (cromatografía en columna), puede poseer
grupos aromáticos unidos a cadenas de hidrocarburos lineales o ramificadas extensas que le
dan características generales de alifáticos en vez de aromáticos. Esto se ha verificado por
espectroscopia UV-visible, para el caso de residuos de petróleo en suelos. Los grupos así
determinados presentan características particulares y probablemente pueda inferirse que las
fracciones F1 y F2 tengan un origen fundamentalmente antrópico. Respecto a la fracción F3
podría en principio atribuirse su composición a parte de la materia orgánica no saponificable y a
componentes de la contaminación antrópica degradados. En la Figura 2 (a) se muestran las
fracciones aisladas para cada muestra. Puede observarse que, en general, las muestras
presumiblemente limpias contienen mayor porcentaje de componentes polares que las
contaminadas más cercanas geográficamente. La única muestra que presenta mayor
proporción de componentes aromáticos que de las otras fracciones es la PM1, lo cual podría
tener que ver con que en este lugar la contaminación antrópica se debería principalmente al
volcado de las aguas de lavado de las sentinas de los buques, mientras que en los otros casos
a pérdidas debido al transporte y almacenamiento de petróleo crudo. Si mayoritariamente se
atribuye la F3 a fuentes naturales, entonces la relación entre la suma de F1 y F2 dividida por F3
daría idea del grado de contaminación antrópica. En la Figura 2 (b) se muestra dicho índice.
Puede observarse que los mayores índices corresponden a lugares previamente indicados
como contaminados como CO1, PM1, PD2 y CC1. El único caso de muestra previamente
catalogada como limpia es el CO2 pero simultáneamente en el mismo lugar, Caleta Olivia, se
presenta el mayor valor del índice para la muestra CO1, lo cual podría indicar contaminación de
este segundo sitio.
(a)
100
%
p/p
F1
F2
F3
50
0
KM3C
CAM1
CAML
CAM2PDC
PD1 PDR
PD2 PMC
PM1 PMLPM2
LRTL
RT CRC
CR1COC
CO1 COL
CO2CCC
CC1 CCL
CC2
CR2
CAMC
7
(b)
(F1+F2)/F3
(F1+F2)/F3
0
CAM1 CAML
CAM2 PDC
PD1 PDR
PD2 PMC
PM2 RTLRT CRC
CR1 COC
CO2 CCC
CC1 CCL
CR2
PM1 PML
CO1 COL
CC2
KM3C
CAMC
Figura 2. (a) F1 es la fracción de componentes alifáticos, F2 es la fracción de componentes aromáticos, y F3 es la
fracción de componentes polares, de los CONS, respectivamente. (b) Relación (F1 + F2)/ F3.
37
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Enero de 2008
En general, los petróleos crudos contienen componentes en estados de oxidación
reducidos, que durante el tiempo de exposición ambiental se modifican debido a procesos
bióticos (biodegradación) y/o abióticos (hidrólisis, fotodegradación, etc.). En la Figura 3 se
comparan las fracciones promedio F1, F2 y F3 para petróleos crudos de la Cuenca del Golfo
San Jorge (cinco crudos distintos), y los sedimentos marinos limpios y contaminados. Puede
observarse que es marcada la diferencia sobre todo en relación a la fracción polar y la
aromática. La fracción aromática disminuye a la vez que aumenta la polar. Es importante
destacar, además, que la fracción alifática y aromática no es nula en las muestras
presumiblemente limpias lo cual no necesariamente estaría indicando un origen antrópico de
contaminación y, consecuentemente, problemas de toxicidad. Sobre este tema se trabajará
durante los próximos años.
80
% p/p
sedimentos limpios
sedimentos contaminados
petróleos crudos
40
0
F1
F2
F3
Figura 3. Distribución de componentes promedio alifáticos (F1), aromáticos (F2) y polares (F3) en petróleos crudos
(gris), sedimentos limpios (blanco) y sedimentos contaminados (azul), de los CONS.
La disminución de los componentes aromáticos respecto al crudo y el aumento de los
polares en los sedimentos, evidencia la adaptación de estas mezclas complejas a las nuevas
condiciones ambientales o sea el pasaje de ambientes reductores y de presiones y
temperaturas altas en el subsuelo, a los ambientes oxidativos y presiones y temperaturas bajas,
en la superficie.
Índices basados en información de Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear
Uno de los métodos espectroscópicos más importantes para la caracterización de
mezclas complejas de hidrocarburos es NMR, ya que es una técnica que se puede aplicar a
fracciones de alto peso molecular y/o muestras de hidrocarburos no fraccionados.Error! Bookmark not
defined., Error! Bookmark not defined.
A fin de brindar una imagen ponderada de los recientes avances en esta metodología, se ha
tratado de volcar en un esquema los análisis previos a este trabajo. El Esquema 1 muestra los
corrimientos químicos en ppm con respecto al TMS,asignados a uno o más grupos estructurales
para petróleos crudos y fracciones de petróleos crudos, desde 1991 hasta la fecha.
Esquema 1. Asignación de grupos estructurales por NMR
Speight J. G., 1991a
KapurG. S., 2000 b
Dutta T. K., 2001 c
SugiuraK., 1997 d
Yang Y., 2003 e
En residuos
f
38
En sedimentos g
H 2A H 1A H6
H5
H4 H3 H2 H1
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a
Fracción de petróleo 87. b Corte de petróleo. 88 c Fracción soluble de petróleo en n-hexano. Error! Bookmark not defined. d
Fracción aromática de un petróleo liviano.e Petróleos pesados. Error! Bookmark not defined. f Nuestro trabajo en residuos de
petróleo en suelos de la Patagonia Central.Error! Bookmark not defined. g Ver la Tabla 2 para la asignación correspondiente
a los sedimentos marinos (presente informe)
Speight J. G. 87 dividió el espectro de 1H NMR de una fracción de petróleo en cinco
regiones, cada una identificable para un tipo de átomo de hidrógeno: aromático (6,3-8,5 ppm),
bencílico (3,4-1,7 ppm), nafténico(2,2-1,4 ppm), metileno parafínico (1,8-0,9 ppm) y metilo
parafínico (1,4-0,5 ppm). Kapur G. S.88 mostró que el espectro de 1H NMR de un corte de
petróleo podría dividirse en regiones, cuya asignación correspondería a uno o más grupos
estructurales: aromática (6,5-8,0 ppm), CH/CH2 en grupos sustituyentes en posición alfa
respecto a un núcleo aromático (2,5-2,8 ppm), CH3 en grupos sustituyentes en posición alfa
respecto a un núcleo aromático (2,05-2,5 ppm), la región entre 0,5 y 2,05 contendría señales
principalmente debidas a cicloalcanos (naftenos), y alcanos de cadena lineal y ramificadas
(parafinas normales e isoparafinas). La región de 0,5-1,0 ppm se debería a CH3, la de 1,0-1,4
ppm a CH2 y la de 1,4-2,05 correspondería a grupos CH2 y CH en compuestos nafténicos e
isoparafinas. Por otro lado, el espectro de 1H NMR de la fracción aromática de un petróleo
crudo (Arabian crude oil) se dividió en cinco regiones: hidrógenos aromáticos (6,2-9,6 ppm), alfa
alquílicos (2,0-4,2 ppm), alquílicos excepto alfa alquílicos y metilos terminales (1,0-2,0 ppm) y
metilos terminales (0,4-1,0 ppm). Esta misma asignación fue utilizada por Dutta y Harayama,
Error! Bookmark not defined. en el análisis de compuestos aromáticos con sustituyentes
alquílicos de cadenas largas, presentes en la fracción alifática de petróleos crudos.
Yan y col., subdividen a la distribución de hidrógenos en petróleos pesados, de la
siguiente forma: aromáticos (6,0-9,0 ppm), alifáticos en C respecto a un anillo aromático (2,04,0 ppm), alifáticos en C, CH2 y CH más allá de C respecto a un anillo aromático (1,0-2,0
ppm), y alifáticos en C y CH3 más allá de C respecto a un anillo aromático (0,5-1,0 ppm). Esta
asignación ha sido aplicada en el estudio de la relación entre las concentraciones de grupos de
hidrocarburos, en petróleos pesados, y parámetros estructurales obtenidos sobre la base de 1H
NMR. En el Esquema 1 se muestra, también una asignación, mas completa, de hidrógenos
realizada, en nuestro grupo, sobre los espectros correspondientes a muestras de residuos de
petróleo en suelos.Error! Bookmark not defined. Además se muestra la asignación propuesta para los
sedimentos marinos que se estudian ahora, más adelante se explica la misma con mayor
detalle.
La Figura 4 muestra el espectro de RMN de los COET, correspondiente a la muestra
CO1, cuyas características generales se detallan en la Tabla 1.
39
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Figura 4. Espectro de 1H NMR correspondiente a un sedimento marino (muestra CO1)
El espectro puede dividirse en regiones, cada una de las cuales identifican a algún tipo
de hidrógeno. La asignación se basó, en principio, en estudios previos (Esquema 1), y luego
se hizo un análisis más detallado de las características de los espectros estudiados, la que se
muestra en la Tabla 2. Esta asignación se realizó de acuerdo a los grupos mayoritarios; si bien
se reconoce que algunas regiones no son estructuralmente puras (superposición de señales);
las demarcaciones no son exactas y ellas dependen de la naturaleza de las muestras. Puede
observarse, que en la Tabla 2 se muestran cuatro parámetros correspondientes a hidrógenos
alifáticos (H1 a H4), tres a hidrógenos en entornos polares (H5, H6, HCOOH) y dos a hidrógenos
aromáticos (H1A, H2A).
Del análisis de los espectros y su comparación con los obtenidos en trabajos previos
realizados sobre suelos contaminados con petróleo,89 surge que las diferencias observables a
simple vista se encuentran en el rango comprendido entre 3 y 6 ppm de corrimiento químico, y
representan un porcentaje del área total que varía entre 1,9 y 8,3 %. Este intervalo, en el caso
de sedimentos marinos presenta señales, mientras que en el caso de residuos de petróleo en
suelos solo las muestras con pocos años de exposición ambiental (2 o 3 años) las presentan.
Tabla 2. 1H RMN, asignación de hidrógenos en sedimentos
Parámetro
δ (ppm)
Tipo de protón
H1
H2
0,5-1,0
1,0-1,5
H3
1,5-1,8
H4
H5
H6
H1A
H2A
HCOOH
1,8-3,0
3,0-5,0
5,0-6,2
6,2-7,5
7,5-8,5
10,0-11,0
CH3 unido a un C en posición  o  respecto a un grupo alquílico.
CH2 unido a un C en posición  o  respecto a un grupo alquílico y CH3 unido a un
átomo de C en posición  respecto a otros grupos funcionales e.j. anillo aromático.
CH unido a un C en posición  o  respecto a un grupo alquílico y CH2 unido a un
átomo de C en posición  respecto a otros grupos funcionales.
CH3 y CH2 unido a un C en posición  respecto a otros grupos funcionales.
HO , O-CH3, O-CH2-R
HO, H-C-O-C(O)-C6H5, H-C(O)-O-R, H-C(O)-N-R
Aromáticos
en núcleos aromáticos condensados
R-COOH
Los datos obtenidos en base a la integración de áreas de los espectros (Tabla 3) se
evaluaron utilizando el análisis por componentes principales (PCA), el cual se fundamenta en la
transformación de un conjunto de variables en otro conjunto nuevo de variables no
correlacionadas entre sí. Este nuevo conjunto se llama “componentes principales” (PC).
La primera componente principal (PC1) describe la mejor combinación lineal de
variables originales que es capaz de dar cuenta del mayor grado de la variabilidad total
(varianza) de la matriz de datos, la segunda componente principal (PC2) se orienta también en
la dirección de la máxima dispersión, pero como es ortogonal respecto de la primera, sigue la
dirección de la máxima dispersión residual que no ha explicado el PC1.
Si caracterizamos cada muestra por las coordenadas en PC1 y PC2, su representación
en el plano se asemeja más a la disposición de las muestras en el espacio tridimensional y la
distancia entre puntos representa, en este caso, diferencias en los índices considerados.
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Tabla 3. Porcentajes de cada tipo de hidrógeno
muestra
CAM1
CAM2
PD1
PD2
PM1
PM2
RT
CR1
CO1
CO2
CR2
CC1
CC2
H1
13,70
14,82
22,59
23,83
17,09
16,19
15,73
19,42
21,45
17,55
21,00
22,20
25,57
H2
57,33
60,06
52,64
58,75
59,01
62,04
60,29
59,14
59,26
60,11
55,61
50,14
53,26
H3
8,63
8,19
7,92
7,59
8,21
6,89
5,44
8,03
7,74
4,95
9,34
8,07
7,79
H4
7,07
7,75
9,78
5,91
6,96
6,79
8,40
6,35
7,15
6,83
7,74
7,62
8,14
H5
3,26
5,20
2,04
1,38
4,93
5,16
6,17
2,61
2,02
5,23
3,10
0,93
0,61
H6
7,18
1,62
0,23
0,55
1,33
0,97
2,14
1,24
0,40
2,54
0,95
0,00
0,12
H1A
1,87
1,08
2,13
1,29
1,53
0,82
0,05
1,65
0,93
1,07
1,19
9,78
2,25
H2A
0,70
0,93
2,54
0,58
0,70
0,79
1,12
1,27
0,78
1,38
0,75
1,19
2,22
HCOOH
0,26
0,34
0,12
0,11
0,23
0,35
0,68
0,28
0,27
0,34
0,34
0,06
0,05
Los datos que se utilizaron para realizar el PCA fueron todos los obtenidos en base a 1H
RMN (H1, H2, H3, H4, H5, H6, H1A, H2A, HCOOH) de los COET de cada muestra. Los resultados
obtenidos muestran que las dos componentes principales calculadas dan cuenta del 84,5 % de
variabilidad total. La Figura 5 muestra las dos primeras componentes (1era y 2da PC), las cuales
explican el 66,6 % y el 17,8 %, respectivamente de la variabilidad, siendo la distancia
Euclideana entre los puntos representativa de las diferencias en los índices, como se dijo
anteriormente. A la 1era PC contribuyen principalmente H2 (22,6%), H1 (22,1%), H5 (21,8%) y H1A
(12,8%), respectivamente. Esta componente representa al 66,6% de la variabilidad total por lo
que es la más importante al momento de explicar las diferencias observables. En la Figura
pueden verse dos grupos de muestras, delimitada una de ellas, por las líneas punteadas. El que
está más a la izquierda corresponde al grupo de muestras que presentan menor índice
(F1+F2)/F3, a saber, PM2, CAM1, CAM2, RT y CO2; mientras que el segundo grupo
corresponde a las restantes. Cabe mencionar que los índices mostrados en la Figura 2 (b),
corresponden a los CONS, mientras que la PC1 y PC2 de la Figura 5 corresponde al espectro
de los COET. 90
+1.5
CAM1
2ª Componente Principal
CC1
CAM2
PD1
RT
CR2
PM1
CO2
CC2
CR1
PM2
CO1 PD2
-1.5
-1.5
1ª Componente Principal
+1.5
Figura 5. 1era Componente Principal (PC) versus 2da Componente Principal (PC)
La aparente concordancia entre las observaciones realizadas en base a las fracciones
separadas por cromatografía en columna del extracto no saponificable y las observaciones
realizadas en base al espectro de RMN, podría servir, de verificarse en trabajos posteriores,
como herramienta de diagnóstico para la diferenciación del origen (natural o antrópico) de los
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compuestos orgánicos en los sedimentos. Cabe remarcar, además, que son importantes las
diferencias en cuanto al tiempo que insumen ambas determinaciones y que, si se pudiera tener
acceso a este tipo de espectroscopia, se podrían reducir no solo los tiempos de análisis, sino
también los costos asociados a la utilización de solventes y su disposición final.
Fotodegradación de sedimentos
De acuerdo a los resultados anteriores, se seleccionaron los sedimentos intermareales
superficiales de Camarones (CAM1) y Caleta Córdova (CC1) para realizar los ensayos de
fotodegradación, ya que pertenecen al grupo de muestras no contaminadas y contaminadas,
respectivamente. Por lo tanto la presencia de hidrocarburos tiene origen natural en el primer
caso, mientras que en el segundo el origen es antrópico.
En la Figura 6 (a) se muestra, mediante un gráfico de barras, la variación en porcentaje
de hidrógenos del espectro de RMN para la muestra de Camarones al comienzo del ensayo
(CAM) y a los 46 días (muestra 1-CAM, el 1 corresponde al tiempo) de exposición a la luz solar
(L = luz), con catalizadores AOPs (C = catalizador) y sin catalizadores AOPs (S = sin
catalizador), mientras que en la Figura 6 (b) se muestran los datos correspondientes a la
muestra de Caleta Córdova (CC). Como puede observarse tanto al inicio del ensayo como
después de haber sometido a las muestras al tratamiento correspondiente, el cambio en los
hidrógenos alifáticos (H1, H2, H3 y H4) es mínima, sin embargo, la diferencia radica en el
contenido de hidrógenos H5, H6, H1a, H2a y HCOOH. CAM presenta un mayor contenido en
hidrógenos H5, H6 y HCOOH, mientras que CC posee, comparativamente, mayor porcentaje de
hidrógenos aromáticos (H1a). En cuanto a los hidrógenos del tipo aromáticos en anillos
policondensados (H2a), representan porcentajes similares en ambos casos. En la muestra de
CAM se evidencia un incremento en el contenido de hidrógenos tipo H1a y HCOOH, y una
disminución de H6 cuando la exposición a la luz esta acompañada de la presencia de
catalizador AOPs. Sin embargo, en ausencia de catalizador, el comportamiento es diferente, ya
que existe una disminución en el contenido de hidrógeno H1a y H6, y fundamentalmente una
disminución de HCOOH. Los mecanismos de degradación parecerían ser diferentes y mientras
que en el primer caso la especie oxidativa es la especie HO., en el segundo podría deberse a la
presencia de sustancias sensitizadoras naturales, como los ácidos húmicos y la riboflavina,
entre otros.91
CAM
100.00
1-CAMCL
1-CAMSL
CC
100.00
2-CCCL
2-CCSL
(a)
(b)
10.00
10.00
1.00
1.00
0.10
0.10
0.01
0.01
H1
H2
H3
H4
H5
H6
Ha1
Ha2
COOH
H1
H2
H3
H4
H5
H6
Ha1
Ha2
COOH
Figura 6. (a) Variación en el contenido de hidrógenos para la muestra de Camarones al inicio del ensayo (CAM) y a
los 46 días, con catalizadores AOPs (1-CAMCL) y sin catalizadores AOPs (1-CAMSL). (b) Variación en el contenido
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de hidrógenos muestra de Caleta Córdova al inicio (CC) y a los 30 días, con catalizadores AOPs (2-CCCL) y sin
catalizadores AOPs (2-CCSL).
En la muestra de CC se evidencia una disminución en el contenido de hidrógenos tipo
H1a, HCOOH, y H6 cuando la exposición a la luz esta acompañada de la presencia de catalizador
AOPs, mientras que sin catalizador existe un aumento en el contenido de HCOOH.
Para evaluar en forma simultánea las variaciones observadas, se realizó un nuevo
análisis por Componentes Principales, en donde se incluyen las muestras iniciales y las
expuestas a la luz solar con y sin catalizador en el análisis mostrado en la Figura 5. Los
resultados obtenidos se muestran en la Figura 7, donde puede observarse que la distribución
de las muestras no coincide estrictamente con el presentado en la Figura 5 debido a que, al
ingresar nuevos datos en la matriz original, estos se transforman en un nuevo conjunto de
variables no correlacionadas entre sí, diferentes a los primeros utilizados. Sin embargo, la
distribución de las muestras es similar, ubicándose hacia la derecha las muestras que
contendrían hidrocarburos de origen antrópico y hacia la izquierda las de origen biogénico. Es
así que la muestra de Caleta Córdova expuesta a la luz con AOPs (2-CCCL) y sin catalizador
AOPs (2-CCSL) presentarían características antrópicas, aún después del tratamiento. La
muestra de Camarones, luego de haber sido expuesta a la luz solar en presencia del
catalizador, exhibe un cambio en su composición que la hace mas semejante a las de origen
antrópico. De acuerdo a análisis PCA la diferencia en ambas muestras radica en el contenido
de hidrógenos aromáticos (H1a) y H6, como describimos anteriormente, uno discrimina en el
sentido de los hidrocarburos de origen antrópico y al de origen biogénico. En cambio la muestra
de Camarones, luego de haber sido expuesta a la luz solar en ausencia de catalizador AOPs,
conservaría los rasgos generales de los hidrocarburos de origen biogénico.
+1.0
CAM
1-CAMCL
H6
H1A
CC
H2A
2ª Componente Principal
H5
RT
CAM2
H4
1-
PD1
CAMSL
CO2
PM1
2-CCCL
H3
CR2
2-CCSL
CR1
PM2
CC2
H2
H1
CO1
PD2
- 1.0
- 1.0
1era
1ª Componente Principal
+1.0
2da
Figura 7.
Componente Principal (PC) versus
Componente Principal (PC). En letra grande: nombre de las
muestras de los ensayos de fotodegradación, En letra pequeña: las demás muestras de sedimentos. Las líneas en
azul muestran las direcciones de crecimiento de los distintos tipos de hidrógenos.
Fitotoxicidad de los residuos de petróleo en sedimentos
Los ensayos de toxicidad aguda se llevaron a cabo utilizando los Compuestos Orgánicos
Extractables Totales (COET) de la muestra denominada CC1 (Caleta Córdova Cargadero), la
elección tuvo en consideración la concentración de COET presentes en esta zona contaminada
por la actividad antrópica. Los resultados se muestran en la Figura 8. Puede observarse que la
concentración que inhibe el 50 % de la germinación de las semillas de Atriplex lampa es 9,8 %
p/p, mientras que para Lactuca sativa L. es 1,5 % p/p. Es así que las semillas correspondientes
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a Lactuca sativa L. son más sensibles que las de Atriplex lampa, resultados similares a los
encontrados en un estudio ecotoxicológico de biopilas de residuos de petróleo, cuando se
compara a la primera con otras especies vegetales. Por ejemplo el porcentaje de inhibición de
Lactuca sativa L fue de 76,25 %, mientras que para Lepidium sativum L (berro de agua), Zea
mays L (maíz), Triticum vulgare L (trigo), Secale cereale L (centeno) y Brassica oleracea L (col)
fue de 33,25 %, 53,91 %, 47 %, 61,33% y 13,06 % respectivamente.92
La inhibición en la germinación podría considerarse como un efecto letal, siempre y cuando se
pueda corroborar que finalizada la exposición, las semillas no germinaron por muerte del
embrión, y que no existe simplemente un retraso en el proceso de germinación, manteniéndose
la viabilidad de la misma. No obstante esto, la inhibición en la germinación registrada al finalizar
la prueba, se considera fitotoxicidad, aunque el efecto en la germinación sea reversible, dado
que la sustancia presente en el medio altera alguna función en la semilla, impidiendo su normal
ciclo de vida.64, 82 Por lo expresado anteriormente, no se puede inferir si las semillas que
germinaron tendrán la posibilidad de establecerse en el suelo y si el tóxico afectó otras
funciones como: alteración en el crecimiento, desarrollo anómalo del sistema radicular, o de las
partes aéreas de la planta, entre otras.
9
8
Lactuca sativa
7
y = 3,1226x + 4,4341
R2 = 0,9851
Probit
6
5
4
y = 3,8596x + 1,1784
R2 = 0,9845
3
Atriplex lampa
2
1
0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Logaritmo concentración
Figura 8. Test de toxicidad aguda. Relación Probit-logaritmo concentración para la inhibición en la germinación de
Atriplex lampa y Lactuca sativa L.
El efecto en la elongación de la raíz permite la evaluación de la toxicidad de compuestos
solubles, presentes en concentraciones tan bajas que no son suficientes para inhibir la
germinación, pero que sí pueden retardar o inhibir completamente los procesos de elongación
de la raíz, lo que depende del modo y sitio de acción de los contaminantes. De esta manera, la
inhibición en la elongación de la raíz constituye un indicador subletal muy sensible para la
evaluación de efectos biológicos en plantas, aportando información complementaria a la
proporcionada al estudiar el efecto en la germinación.64, 82
La elongación en la raíz se determino utilizando la siguiente ecuación:
(ER) = (M – C) × 100 / C
donde ER es la elongación en la raíz, M es el promedio de elongación por muestra estudiada y
C es el promedio en el control.
Si ER es igual a cero no hay efecto tóxico, si ER es menor a cero hay efecto tóxico y si
ER es mayor que cero el efecto es estimulador.67 En la Tabla 4 se observa para la especie
Atriplex lampa, en todas las concentraciones ensayadas, un efecto tóxico, cuya concentración
inhibitoria 50 (CI50) resultó ser de 11 % p/p. En el caso de Lactuca sativa L se observó, para las
concentraciones 10, 5 y 2,5 % un efecto inhibitorio, con una CI50 de 6 % p/p. Para la
concentración 1,25 % se detecto una estimulación de la elongación presentando las raíces
escasos a nulos pelos radiculares, lo cual a futuro podría afectar el establecimiento de la planta.
Nuestros resultados muestran valores comparables de ambos ensayos para la especie Atriplex
lampa, mientras que para la especie Lactuca sativa L la inhibición en la germinación fue más
sensible que la inhibición en la elongación.
44
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Tabla 4. Elongación promedio de la raíz (ER) en Atriplex lampa y Lactuca sativa L.
% p/p
20
10
5
2,5
1,25
Atriplex lampa
- 69,4
-54,7
-12,0
-8,1
-1,5
Lactuca sativa L.
nd
-75,14
-41,94
-0,48
87,84
nd: no determinado, ausencia de germinación a esa concentración
Nuestros resultados muestran valores comparables de ambos ensayos para la especie
Atriplex lampa. En este sentido, otros autores han mostrado en trabajos previos, 92 que la
inhibición en la elongación de la raíz resultó ser un parámetro más sensible que la inhibición en
la germinación. En la Figura 9 puede observarse el índice de germinación (IG), calculado según
la relación:
IG = PGR × CRR /100
donde PGR es porcentaje de germinación relativo y CRR es el crecimiento de raíz relativo. En
la Figura se representa este índice para las concentraciones 20, 10 y 5% p/p. Se trabajo
también con dos concentraciones adicionales 1,25 y 2,5 % p/p, pero en ambos casos no se
encontraron diferencias significativas respecto al control tanto para la inhibición en la
germinación, como en la elongación de la raíz.
100
Atriplex lampa
90
Lactuca sativa
80
70
IG
60
50
40
30
20
10
0
1,25
2,5
5
10
20
Concentración (% p/p)
Figura 9. Índice de germinación para las semillas de Atriplex lampa y Lactuca sativa L., obtenidos con los COET de
la muestra Caleta Córdova 1 (CC1).
El índice de germinación, según indican algunos autores,93,94 es un indicador más
completo para describir el potencial fitotóxico, ya que integra el potencial de germinación
relativo y el crecimiento radicular relativo. Ambos factores tienen en cuenta que, la presencia de
ciertos compuestos fitotoxicos no impedirían la germinación de las semillas empleadas, pero si
limitarían el desarrollo de la radícula. Un índice de germinación superior a 80 indicaría la
ausencia de sustancias fitotóxicas o que las mismas están a muy baja concentración, mientras
que un índice inferior al 50 % indicaría la presencia de sustancias fuertemente fitotóxicas; los
45
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valores comprendidos entre 50 y 80 se podrían interpretar como la presencia moderada de
sustancias tóxicas. Según puede observarse en la Figura 9, el contaminante resulta ser
fitotóxico para Atriplex lampa, a concentraciones iguales o superiores a 5% p/p, ya que a esta
concentración, el IG resultó ser inferior a 80. En cuanto a Lactuca sativa L. el efecto tóxico es
superior o sea es más sensible dado que los IG son muy inferiores a 80 aún para la
concentración mas baja estudiada (1,25% p/p).
Fitotoxicidad de los residuos de petróleo fotodegradados en sedimentos
Como se dijo anteriormente, la concentración que inhibe el 50 % de la germinación de
las semillas de Atriplex lampa para la muestra de Caleta Córdova es 9,8 % p/p, mientras que
para Lactuca sativa L es 1,5 % p/p. Luego de haber sido sometida a los ensayos de
fotodegradación durante 259 días y de realizar los ensayos ecotoxicológicos, no se puede
calcular la concentración inhibitoria 50 para ninguno de los dos parámetros evaluados,
germinación y elongación de la raíz, ya que los valores no están comprendidos dentro del
rango necesario para llevar a cabo dicho análisis, sin embargo, para ambas especies se
observo inhibición en la germinación respecto del control.
Para la especie Atriplex lampa los porcentajes de inhibición en la germinación fueron de:
28 %, 19 %, 11 % y del 0 %, para las muestras 5-CCCO, 5-CCSO, 5-CCSL, 5-CCCL (el 5 indica
el quinto tiempo de exposición, 259 días) respectivamente. En los cuatro casos dichos
porcentajes se encontraron para la concentración del 20 % p/p. A concentraciones inferiores
(10, 5, 2,5 y 1,25 % p/p) no se observó inhibición en la germinación. Para Lactuca sativa L los
porcentajes de inhibición en la germinación para la misma concentración (20 % p/p) fueron, 39
%, 40 %, 35 % y 37 %, para las muestras 5-CCCO, 5CCSO, 5-CCSL y 5-CCCL,
respectivamente. Si bien no se puede calcular la concentración inhibitoria 50, se puede
observar que después de 259 días, los residuos contienen sustancias fitotóxicas que afectan el
proceso de germinación en las especies ensayadas.
El porcentaje de inhibición en la germinación para Atriplex lampa se encuentra entre 030 %, mientras que para Lactuca sativa L está comprendido entre el 35-40 %, nuevamente la
especie Lactuca sativa L resulta ser más sensible que la especie autóctona estudiada. Lactuca
sativa L recién muestra valores de inhibición en la germinación similares a los de Atriplex lampa,
para la concentración del 10 % p/p, en los tratamientos con luz, y del 5 % p/p para las muestras
al abrigo de la luz (oscuridad). En el caso de la muestra, 5-CCCL, no se detecto
experimentalmente que existiera inhibición en la germinación, esto podría deberse a que el
petróleo ejerce un efecto positivo sobre la germinación de la semilla, proceso que parece estar
ligado a un incremento en la entrada de agua al endospermo y a la cubierta seminal, de modo
que ocurren cambios enzimáticos en menor tiempo.95 Una de las explicaciones posibles es
atribuible a que ciertos hidrocarburos del petróleo o de sus metabolitos funcionan como auxinas
naturales promoviendo el proceso de germinación.96
La inhibición en la elongación de la raíz se detectó para la especie Atriplex lampa, para
la concentración del 20 % p/p, resultando, 47, 35, 36, 24 % para 5-CCCO, 5-CCSO, 5-CCCL, 5CCSL, respectivamente. En el caso de Lactuca sativa L solo se observó inhibición en la
elongación de la raíz para 5-CCCO y 5-CCSO, cuyos valores fueron 13 y 10 %
respectivamente, para la concentración del 20 % p/p.
La respuesta de ambas especies al evaluar la elongación de la raíz fue diferente, en el
caso de Atriplex lampa, se observa inhibición en la elongación de la raíz para los ensayos
realizados con y sin AOPs, mientras que para Lactuca sativa L no. Al realizar la observación de
las raíces, presentaron pelos radiculares normales siendo más cortas que el control, en estos
casos el efecto solo fue a nivel de la inhibición en la elongación.
Se observo en Atriplex lampa, un efecto de estimulación sobre el desarrollo radicular, en
las muestras expuestas a la luz con y sin catalizadores AOPs y para las concentraciones
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evaluadas en el rango de 10 a 1.25 % p/p. En la especie Lactuca sativa L, se observó el mismo
efecto para el rango completo de concentraciones ensayadas.
En general el efecto de estimulación del desarrollo radicular estuvo acompañado de
ciertas anormalidades tales como: raíces con crecimiento atrofiado, raíces cortas sin pelos
radiculares, raíces gruesas y con escaso desarrollo de pelos radiculares, raíces finas,
quebradizas y sin desarrollo de pelos radiculares; en algunos casos se observó el desarrollo de
los cotiledones, con ausencia en el desarrollo radicular, crecimiento de dos raíces, desarrollo de
tres cotiledones en lugar de dos, etc. Estos resultados concuerdan con otros trabajos realizados
sobre distintos tipos de semillas, y conducen a la necesidad de evaluar los efectos dañinos que
pueden ocasionarle a la plántula durante todo su ciclo de vida. 95, 97
VII.
Conclusiones:
Como ya se ha expresado en este informe, el uso de TBTs (trialquil-estaños, usados
como aditivos “antifouling” para barcos y otras estructuras sumergidas en el mar) ha provocado
una marcada contaminación en el ecosistema costero, con daños irreversibles en organismos
acuáticos, siendo el compuesto más tóxico arrojado deliberadamente por el hombre en aguas
naturales, por lo que su uso está siendo restringido en varios países desarrollados, pero no en
Argentina ni en ningún otro país de Latinoamérica. Los resultados obtenidos durante el
desarrollo de este sub-proyecto, realizando un mapeo de sitios a lo largo de la costa
patagónica, determinando el contenido de TBT en aguas y sedimentos y evaluando los % de
“imposex” y otros daños en organismos marinos, han demostrado la enorme difusión de este
tóxico.
Los estudios abarcaron desde la zona de Mar del Plata hasta Trelew, en sitios
localizados fundamentalmente en las Pcias. de Río Negro, Chubut y Santa Cruz, y se capacitó
a colaboradores de dichas provincias para realizar muestreos significativos, escogiendo
fundamentalmente zonas de intenso tráfico marítimo. Se desarrollaron métodos cuantitativos
para la determinación de [TBT] en aguas, sedimentos y matrices biológicas, los que fueron
validados por precisas curvas de calibración en distintos niveles de contaminación. Se participó
en un ejercicio de intercalibración de TBT organizado por la Univ. de Texas (USA) y los
resultados obtenidos en nuestro grupo arrojaron un 100% de confianza con los datos de las
muestras incógnitas reales, lo que demuestra la confiabilidad de todos los valores determinados
en este sub-proyecto. Los resultados obtenidos en este subproyecto, han demostrado la
existencia de TBT en cantidades variables, en todos los sitios muestreados, lo que evidencia
claramente la amplia difusión del tóxico y la urgente necesidad de reglamentaciones de control.
En algunos casos, las [TBT] halladas en aguas y sedimentos de sitios portuarios, son las más
altas que registra la literatura internacional actual.
La abundante literatura internacional se refiere en su casi totalidad a los efectos de TBT
en organismos marinos; sin embargo, en nuestro laboratorio realizamos investigación de
efectos en especies de alga dulce, este fue el primer trabajo publicado a nivel internacional.
Durante el desarrollo de este sub-proyecto, se realizaron también determinaciones en espejos
de agua dulce, a saber: laguna de Chascomús y zona portuaria de Buenos Aires, los que
también indicaron la presencia de TBT. Se realizaron estudios de efectos de TBT en
organismos Pomacea caniculata (ampularias) y fisas. A los efectos de obtener resultados
reproducibles y confiables, dichas especies se cultivaron en el laboratorio y todos los estudios
se realizaron con especies de cultivo. Se deteminaron CL50, LOEC y NOEC para organismos
desde 1 semana a 2 meses de edad, y estudios de crecimiento, frecuencia de raduleo, y otras
manifestaciones vitales en presencia de cantidades variables de TBT. También se realizaron
estudios de cinética de degradación/bioacumulación de TBT con Pomacea caniculata y de
efectos sobre la reproducibilidad en individuos en edad fértil a fin de determinar el grado de
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daños endocrinos. Todos estos estudios mostraron la total dependencia entre [TBT] y varios
indicadores biológicos y aportan información a los organismos de control y de empresas
pesqueras sobre la necesidad de legislación al respecto.
Por otro lado, durante el desarrollo de este sub-proyecto también se determinaron
indicadores de la estabilización y de la toxicidad de residuos de petróleo basados en
mediciones de RMN y se compararon con otros parámetros de mediciones más
convencionales. Los datos obtenidos en base a la integración de áreas de los espectros se
evaluaron utilizando el análisis por componentes principales (PCA), el cual se fundamenta en la
transformación de un conjunto de variables en otro conjunto nuevo de variables no
correlacionadas entre sí. Este nuevo conjunto se llama “componentes principales” (PC). Los
resultados indican que las mediciones por RMN son más últiles para una mejor definición del
riesgo ambiental en el ecosistema costero-marino Se encontró una aparente concordancia
entre las observaciones realizadas en base a las fracciones separadas por cromatografía en
columna del extracto no saponificable y las observaciones realizadas en base al espectro de
RMN, la que podría servir, de verificarse en trabajos posteriores, como herramienta de
diagnóstico para la diferenciación del origen (natural o antrópico) de los compuestos orgánicos
en los sedimentos.
Cabe remarcar, además, que son importantes las diferencias en cuanto al tiempo que
insumen ambas determinaciones y que, si se tiene acceso a este tipo de espectroscopia, se
puede reducir no solo los tiempos de análisis, sino también los costos asociados a las
manipulaciones laboriosas, y de la utilización de solventes orgánicos y su disposición final,
asociados a los riesgos ecológicos que ello implica. Se realizaron también estudios de
fotodegradación con compuestos del tipo AOP y de fitotoxidad de los residuos sobre la
germinación de semillas de especies autóctonas. En general el efecto de estimulación del
desarrollo radicular estuvo acompañado de ciertas anormalidades tales como: raíces con
crecimiento atrofiado, raíces cortas sin pelos radiculares, raíces gruesas y con escaso
desarrollo de pelos radiculares, raíces finas, quebradizas y sin desarrollo de pelos radiculares;
en algunos casos se observó el desarrollo de los cotiledones, con ausencia en el desarrollo
radicular, crecimiento de dos raíces, desarrollo de tres cotiledones en lugar de dos, etc Los
efectos encontrados permitirán un mejor diseño de estrategias alternativas de remediación y
sustentabilidad.
IX. Recomendaciones para futuros trabajos:
En primer lugar, cabe destacar la gran cantidad de determinaciones y estudios que
pudieron realizarse dentro del marco de este sub-proyecto en el, relativamente corto, período
desarrollado. Se capacitó a un importante número de recursos humanos en técnicas
innovadoras que no se realizaban en el país, y que han permitido la acumulación de datos muy
significativos y confiables que son de relevancia en aspectos esenciales para la biodiversidad.
Es deseable que dicha capacidad formada pueda seguir brindando sus frutos en los
temas tan importantes desarrollados en este sub-proyecto. Futuros trabajos implican:
determinaciones en otros sitios costeros no abarcados todavía, y en otros espejos de agua
dulce ya que se ha demostrado la existencia de TBT y sus efectos. Dado que este es un
contaminante global, es importante utilizar esta capacidad instalada para establecer contactos
con países del MERCOSUR y otros de Latinoamérica, tales como Chile, Uruguay, Brasil,
Venezuela, Colombia, en los cuales se han detectado casos de declinación de poblaciones,
imposex y otros daños endocrinos, pero que no tienen la capacidad y/o el “know how” para
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realizar las determinaciones cuantitativas en los finos niveles de concentración que el trabajo
exige.
Por otro lado, debido a que había sido previsto para ser desarrollado en 3 años, y
solamente se dispuso de dos, una parte importante relacionada con la síntesis de moléculas
alternativas no ha podido completarse: se capacitó a dos Lic. en Química en técnicas de
síntesis y caracterización de moléculas orgánicas, pero falta aún realizar las síntesis completas
y probar su eficacia, primero con los organismos en cultivo en nuestro laboratorio y luego con
otros organismos, preferiblemente de origen marino.
Los resultados de las cinéticas de degradación y bioacumulación de TBT demostradas
en los estudios realizados, indican una muy probable utilidad en técnicas de bioremediación de
sitios contaminados por TBT, tema en lo cual los países desarrollados están muy interesados,
debido a la alta acumulación en sus costas (especialmente en países asiáticos y en Canadá).
Este trabajo también amerita su prosecución por las razones expuestas, y la capacidad lograda
con los biólogos que fueron afectados al sub-proyecto.
La utilización de técnicas de RMN para estudios de residuos de petróleo es muy reciente
a nivel mundial y los miembros de este sub-proyecto somos los primeros en aplicarla en nuestro
país. Los resultados muestran la notoria ventaja de esta técnica innovadora, frente a las
metodoogías convencionales, la capacidad desarrollada merece aplicarse a la prosecución de
estos estudios y a la extensión a empresas petroleras.
Todos los resultados descritos en el presente informe son de importancia esencial tanto
desde el punto de vista de la biodiversidad y el riesgo ambiental, como de interes industrial.
Entendemos que es esencial para un efectivo servicio a la sociedad de este proyecto de PNUD,
se organicen reuniones multisectoriales (gobierno, ONGs, sector productivo, academia) para la
difusión de los mismos y diseño de acciones conjuntas de tipo diverso.
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