Germinación in vitro de Rodophiala bífida

Germinación in vitro de Rodophiala bífida
Rodrigo J. M, Rosselló F. J., Marinangeli P. A. y Curvetto N. R.
Departamento de Agronomía-Universidad Nacional de Sur. CERZOS (CONICET-UNSur).
(8000) Bahía Blanca.Financiación: PGI Nº 24/A096, SGCyT-UNSur.
E-mail: [email protected]
Introducción
En la familia Amaryllidaceae, que incluye especies geófitas de alto y reconocido valor para la
industria florícola como Hippeastrum spp. y Narcissus spp., se destaca el género
Rhodophiala Presl. Este taxón agrupa especies nativas que poseen un gran potencial
ornamental, atribuido a sus vistosas flores de colores rojos, rosado, naranja o amarillo. Son
similares en apariencia a Hippeastrum s.f. y, como estas, es posible cultivarlas para flor de
corte o flor de maceta, con la ventaja que Rhodophiala sp. poseen flores de colores amarillo
o naranja que las especies de Hippeastrum no poseen, lo cual abre nuevas posibilidades
para la floricultura de este grupo (Bridgen et al., 2002).
El genero Rodophiala es actualmente comercializado y mejorado en países sudamericanos
como Chile, donde se desarrolla un amplio trabajo en especies nativas como Rodophiala
phycelloides. Esto no ocurre en nuestro país, donde se cuenta con especies nativas de la
misma familia y género, y donde aún no se han realizado programas de mejoramiento,
disponiéndose sólo de estudios genéticos preliminares sobre algunas especies (Cáceres et
al., 2001; Frayssinet y Cáceres, 2002; Sills et al., 2002).
La generación de protocolos de cultivo in vitro de especies nativas del género Rodophiala,
para micropropagación o como un pre-requisito para otras aplicaciones biotecnológicas es
de gran utilidad científica, tecnológica y comercial. La germinación de semillas en medio
estéril es una de las posibles vías para la obtención de plántulas in vitro que servirían como
punto de partida (fase de establecimiento) para protocolos de micropropagación, inducción
de callos y cultivo de suspensiones celulares. En el presente trabajo se informa la
adaptación de técnicas de desinfección para el establecimiento in vitro de plántulas de
Rodophiala bifida en forma axénica a partir de semillas.
Materiales y métodos.
Se utilizaron semillas de la especie Rodophiala bifida con 92% de poder germinativo,
recolectadas de una población del partido de General Pueyrredón, provincia de Buenos
Aires. Para el establecimiento in vitro de plántulas de Rodophiala bífida, se ensayaron las
siguientes técnicas:
 Doble desinfección (Rossello et al, 2004).
 Desinfección simple.
 Desinfección utilizando Plant Preservative Mixture (PPM™).
En la doble desinfección (DD), el total de las semillas se sumergieron durante 1 minuto
en etanol 70 % y luego se probaron 2 concentraciones de NaClO (1.2% y 0.8% de cloro
activo) con 2 tiempos de exposición de las semillas (30 y 15 minutos, respectivamente). A la
combinación de mayor concentración de NaClO y tiempo se la denominó “desinfección
fuerte” (DDF), a la otra se la llamó “desinfección suave” (DDS). Luego, en ambos casos, las
semillas se enjuagaron tres veces con agua estéril y se dejaron en el agua del último
enjuague durante toda la noche para su imbibición. Al día siguiente se realizó la segunda
desinfección con NaClO (0.8% de cloro activo) durante 20 minutos para la desinfección
fuerte y 15 minutos para la desinfección suave, seguido por tres enjuagues con agua
destilada estéril.
En la técnica de desinfección simple (DS) las semillas se sumergieron durante 1 minuto
en etanol 70 % y luego en una solución de NaClO (0.8% de cloro activo por 15 minutos
seguido por tres enjuagues con agua destilada estéril.
Para la desinfección con PPM las semillas se sumergieron y agitaron durante 12 horas en
una solución al 2 %.
Las semillas resultantes de cada tratamiento se sembraron in vitro para el establecimiento
de plántulas en forma axénica.
Para todos los tratamientos se utilizó medio MS sin agregado de sacarosa. Además, para
los tratamientos DS y PPM se ensayó medio MS con el agregado de PPM al 0.1 %. Los
medios fueron ajustados a pH 5,8, se hicieron 8 g L-1 en agar y posteriormente se los
esterilizó en autoclave en frascos de 250 ml a 1 atmósfera durante 17 minutos. Luego se
dispensaron alícuotas de 25 ml del medio correspondiente en placas de Petri de
policarbonato estériles
Se realizaron 6 controles sembrando las semillas sobre papel de filtro húmedo en placas de
Petri. Se sembraron semillas sin desinfectar (SD), embebidas en agua destilada durante 24
horas (EMB) y un control para cada tratamiento mencionado anteriormente.
Se sembraron 4 placas por tratamiento con 20 semillas cada una. Las placas se
distribuyeron al azar en la cámara de cultivo a 25±3ºC con fotoperíodo de 16 horas (48 mol
s-1 m-2) durante 30 días.
Se hicieron dos conteos de germinación, a los 13 días (energía germinativa) y al final (30
días) del período de cultivo (poder germinativo). Para validar los supuestos se utilizó un
diseño completamente aleatorizado. Puesto que los datos no se ajustaban a los supuestos
necesarios para determinar la validez estadística de las diferencias entre medias, se
transformaron con arco seno (Arcsn (Y)) para las variables evaluadas. Una vez
transformadas se realizó análisis de la varianza y test de comparaciones múltiples
(Bonferroni, Dunnet).
Resultados y discusión.
Se cuantificaron la energía germinativa y el poder germinativo con el fin de evaluar el efecto
de distintas técnicas de desinfección sobre la germinación de semillas de R. bífida. in vitro,
en medio nutritivo y sobre papel
Los porcentajes más bajos de energía germinativa y poder germinativo in vitro se
observaron en los tratamientos de DS con y sin PPM en el medio de cultivo, que difirieron
significativamente (p<0,01) del resto de los tratamientos in vitro (Tabla 1). No se observaron
diferencias significativas (p>0,05) entre los porcentajes de germinación in vitro de la DDF y
la DDS, alcanzando porcentajes de 50% y 53% respectivamente. La desinfección con PPM
fue la que produjo los mayores porcentajes de germinación in vitro, llegando al 100%, no
encontrándose diferencias significativas entre los tratamientos con y sin PPM agregado al
medio de cultivo (Tabla 1).
Notablemente, las semillas de los controles sobre papel no germinaron cuando se
utilizaron las técnicas de DDF, DDS, y DS; significativamente distinto (p<0,01) de lo que
ocurrió con las semillas desinfectadas con PPM, SD y EMB y siembra sobre papel, que
alcanzaron altos niveles de energía germinativa y porcentajes de germinación.
En las plántulas obtenidas in vitro en los tratamientos DDF, DDS y DS, se observó un
elevado porcentaje de plántulas vitrificadas, alcanzando 78%, 72% y 68% respectivamente.
Las plántulas obtenidas en los tratamientos in vitro en los que se utilizó PPM como
desinfectante presentaron características morfológicas normales respecto a la especie y no
mostraron síntomas de vitrificación.
No se produjo contaminación en ninguno de los tratamientos in vitro cualquiera sea la
técnica de desinfección utilizada. En los controles sobre papel DDF, DDS y DS, se
observaron marcados signos de contaminación sobre las semillas, lo que posiblemente haya
inhibido la germinación de las mismas.
Conclusión.
A partir de los resultados precedentes, la técnica más apropiada de desinfección
para la obtención in vitro, sin contaminación, de plántulas normales de Rodophiala
bífida a partir de semillas, fue aquella en la cual se empleó PPM y su cultivo in vitro
en presencia o ausencia de PPM en el medio de cultivo.
Tabla 1. Energía y poder germinativos in vitro y sobre papel de semillas de
Rodophiala bífida en respuesta a la técnica de desinfección (media ± desv. est.).
Energía
germinativa
Poder
germinativo
(%)
(%)
In vitro
26 ± 5,3
50 ± 3,1
Sobre papel
0
0
In vitro
34 ± 6,7
53 ± 5,2
Sobre papel
0
3
MS
20 ± 3,7
36 ± 4,3
MS+PPM 0,1%
12 ± 2,1
20 ± 3,9
0
2
MS
96 ± 4,5
100
MS+PPM 0,1%
92 ± 2,6
96 ± 3,5
Sobre papel
85 ± 4,1
91 ± 3,2
SD
Sobre papel
82 ± 4,4
91 ± 2,8
EMB
Sobre papel
86 ± 5,1
96 ± 6,1
Técnica de
desinfección
Soporte
DDF
DDS
In vitro
DS
Sobre papel
In vitro
PPM
Bibliografía.
Bridgen, M., E. Olate and F. Schiappacasse. 2002. Flowering geophytes from Chile. Proc. 8th Intl.
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Cáceres G., Sills C., Basso A., Frayssinet N. Habranthus brachyandrus y H. martinezii: análisis
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2001. Bol. Soc. Arg. Bot (Suplemento): 103.
Frayssinet N y G. Cáceres. Habranthus brachyandrus y H. martinezii: híbridos interespecíficos. 2002.
Libro de Resúmenes 1er Congreso Argentino de Floricultura y Plantas Ornamentales y 4ta
Jornadas Nacionales de Floricultura: 15.
Rosselló, F., Marinangeli P. y Curvetto N. Establecimiento in vitro de plántulas de Habranthus
tubispathus. II Congreso Argentino de Floricultura y Plantas Ornamentales. VI Jornadas Nacionales
de Floricultura. I Encuentro Latinoamericano de Floricultura. 26-29 de octubre 2004, Ciudad
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Sills C., N. Frayssinet y A. Basso. Bandeo C en Habranthus brachyandrus y H martinezii. 2002. Libro
de Resúmenes 1er Congreso Argentino de Floricultura y Plantas Ornamentales y 4ta Jornadas
Nacionales de Floricultura: 51.