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LABORATORIO Nº7
METABOLISMO GLUCOSÍDICO: GLICOGENÓLISIS EN CORTES DE HÍGADO.
1. Aspectos Teóricos.
Una de las funciones importantes del hígado es la mantención de niveles
apropiados de nutrientes, como la glucosa, en la sangre para su uso por el
cerebro, los músculos y otros tejidos. Esta función la realiza ya sea captando o
liberando glucosa en respuesta a los niveles de glucagón, epinefrina e insulina,
como también según la concentración de la glucosa en la sangre.
Con posterioridad a una comida con carbohidratos, la concentración de la glucosa
sanguínea alcanza  6 mM, el hígado la capta y la transforma en glucosa-6fosfato. La G6P en el hígado puede ser convertida a glicógeno cuando la demanda
por glucosa es baja. La síntesis de glicógeno a expensas de glucosa y otros
monosacáridos se conoce como glicogénesis; a partir de residuos provenientes
del metabolismo intermediario de carbohidratos, polipéptidos y lípidos se llama
gluconeogénesis. Un aumento de la demanda, señalado por aumento de los
niveles de glucagón y/o epinefrina en la sangre, reversa el proceso. La
degradación del glucógeno hasta convertirse en glucosa o un derivado de glucosa,
recibe el nombre de glicogenólisis. El glicógeno almacenado en el hígado es
suficiente para suplir con las demandas de glucosa del organismo por más de
 6 horas después de las comidas. Posteriormente la glucosa es proporcionada
mediante la gluconeogénesis a partir de aminoácidos provenientes principalmente
de la degradación de proteínas musculares a alanina y glutamina (forma de
transporte del NH4+).
La formación y destrucción de glucógeno ocurre simultáneamente en células
hepáticas, de modo que su concentración real en un momento dado depende de la
velocidad relativa de las reacciones en una y otra dirección. Diversas
circunstancias modifican estas velocidades, siendo la actividad de diversas
glándulas endocrinas (páncreas, suprarrenales e hipófisis) las más importantes.
Si se extrae el hígado de un animal bien alimentado, no sometido a ayuno previo,
y se pone a incubar, ya sea en forma de papillas o de cortes en un medio salino
apropiado, desprovisto de sustratos, predomina francamente el fenómeno de la
glicogenólisis.
Este proceso puede estudiarse sobre la base de la disminución del contenido de
glicógeno del tejido y el aumento de la concentración de glucosa en el medio de
incubación.
Para conocer el contenido de glicógeno, se aprovecha la propiedad de este
polisacárido de ser extraído fácilmente con ácido tricloroacético y de dar una
coloración característica con el yodo. La intensidad del color es aproximadamente
proporcional a la concentración de glicógeno, cuando las otras condiciones
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experimentales son constantes. La reacción se efectúa en un medio que contiene
una concentración elevada de una sal neutra (NaCl) porque en esta forma se
intensifica el color. La medida cuantitativa de la glucosa se efectúa mediante el
método de la o- toluidina.
2. Objetivos.
Estudiar el fenómeno de la glicogenólisis en el hígado de un animal sin ayuno,
midiendo la disminución del glicógeno del tejido y la formación de glucosa en el
medio de incubación.
3. Parte experimental.
3.1 Equipos y materiales

Mechero / trípode / rejilla

centrífuga / tubos centrífuga

gradillas

vidrio reloj
 20 tubos de ensayo
 1 pipeta graduada de 1 ml
 1 pipeta graduada de 5 ml
 1 pipeta graduada de 10 ml
 1 pizeta
 1 espátula
 1 mortero
 1 vaso precipitado de 500 ml
 1 vaso precipitado de 250 ml

plato poroso.
3.2 Reactivos







NaCl 0,9 % (Solución de Krebs)
Ácido tricloroacético (TCA) 5 %
Glicógeno 1%
Reactivo de Yodo (2,5 mM)
H2SO4 2/3 N
Tungstato de Na 10%
o-toluidina
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4. Procedimiento.
4.1
Preparación de cortes de hígado.
 Mate una rata bien alimentada (sin ayuno).
 Extraiga el hígado y recíbalo en un vaso precipitado que contiene suero
fisiológico. Realice cortes delgados sobre una madera adecuada y déjelos en
una placa sobre hielo.
 Pese tres porciones de cortes de aproximadamente 150 mg cada una y
colóquelas separadamente en un vidrio reloj sobre hielo. Es conveniente que
las diversas porciones no difieran en más de 10 mg entre la más pesada y la
más liviana.
4.2
Incubación de los cortes de hígado en suero fisiológico.
De acuerdo a la tabla 7.1:
 Rotule tres tubos de ensayo (1H  3H).
 Coloque en cada uno de estos tubos las porciones de hígado previamente
pesadas. Indique el peso del corte en la tabla.
 Agregue 2,0 ml de solución de Krebs.
 Inmediatamente incube los tubos por el tiempo indicado a temperatura
constante (25ºC).
 Retire los cortes una vez finalizada la incubación, déjelos en un tubo de ensayo
rotulado (1  3) en un baño de agua / hielo. Mida el glicógeno
inmediatamente.
 Guarde a baja temperatura el líquido de incubación para la cuantificación de
glucosa.
Tabla 7.1
TUBO
Peso cortes hígado (mg)
Solución de Krebs (ml)
Tiempo (min)
1H
2H
3H
2
0
2
20
2
40
4.3
Determinación semicuantitativa del glicógeno hepático:
De acuerdo a la tabla 7.2:
 Agregue 5,0 ml de ácido tricloroacético al 5% a los tres tubos con los cortes de
hígado anteriormente incubados (1  3),
 Vacíe bruscamente todo el contenido al mortero y triture bien durante
5 minutos los cortes.
 Centrifugue durante 5 minutos y recoja el sobrenadante transparente
(1S  3S). Si se observa opalescencia en el tubo hay que volver a centrifugar.
 Obtenga 2 ml de cada sobrenadante y déjelo en un tubo rotulado según su
tiempo de incubación (2I2  4I2).
 Prepare un patrón con 1,0 ml de glicógeno al 1% y 1,0 ml de TCA (5P).
 Prepare un blanco con 2 ml de TCA (1B).
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 Agregue a todos los tubos 3,0 ml de la solución de yodo, agite cuidadosamente
y espere por 5 minutos.
 Lea la absorbancia a 540 nm en el espectrofotómetro usando el blanco para
calibrar el equipo. Si los colores resultan muy intensos, diluya en la misma
proporción el blanco, el patrón y las muestras con agua destilada. Anote la
dilución. Anote la absorbancia en la tabla.
Tabla 7.2
TUBO
1B
2I2
3I2
4I2
5P
Tiempo incubación (min)
TCA 5% (ml)
Triture
Centrifugue
---------
0
5,0


20
5,0


40
5,0


---------
Sobrenadante (ml)
TCA 5% (ml)
Glicógeno 1% (ml)
Reactivo de yodo (ml)
Absorbancia 540 nm
--2,0
--3,0
2,0
------3,0
2,0
------3,0
2,0
------3,0
---1,0
1,0
3,0
De acuerdo a los datos obtenidos:
 Calcule la concentración del glicógeno en cada tubo (2I2  4I2).
 Calcule la concentración del glicógeno en el sobrenadante (1S  3S). Este
cálculo puede hacerlo directamente mediante la ecuación 1.7.
 Calcule la cantidad de glicógeno extraído de cada corte de hígado.
 Calcule la cantidad de glicógeno extraído por 100 mg de cada corte de hígado.
 Haga un gráfico cuya abscisa represente el tiempo de incubación (0, 20 y
40 minutos) y cuya ordenada represente los mg de glicógeno referidos a 100
mg de tejido.
4.4
Determinación cuantitativa de la glucosa entregada al medio por los
cortes de hígado.
4.4.1 Eliminación de proteínas de la solución.
De acuerdo a la tabla 7.3:
 Tome 1,0 ml del liquido de incubación de los cortes de hígado, llévelo a un tubo
de ensayo rotulado (1  3).
 Agregue 1,0 ml de H2SO4 2/3 N y 1,0 ml de tungstato de sodio y espere
5 minutos.
 Prepare el blanco.
 Centrifugue los tubos por 5 minutos y retire el sobrenadante, aunque no tenga
precipitado.
 Una vez obtenido el sobrenadante, proceda a determinar la concentración de
glucosa por el método de la o-toluidina.
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Tabla 7.3
TUBO
Tiempo incubación (min)
Agua destilada (ml)
Líquido de incubación (ml)
H2SO4 2/3 N (ml)
Tungstato de Na 10% (ml)
1B
--2,0
---1,0
1,0
2Sn
0
1,0
1,0
1,0
1,0
3Sn
20
1,0
1,0
1,0
1,0
4Sn
40
1,0
1,0
1,0
1,0
4.4.2 Cuantificación de la glucosa en el medio de incubación
desproteinizado.
De acuerdo a la tabla 7.4:
 Rotule 4 tubos (1B, 2o-tol  4o-tol).
 Agregue 0,5 ml del sobrenadante desproteinizado correspondiente.
 Agregue 3,0 ml de o-toluidina. Homogenice.
 Lleve a un baño de agua en ebullición durante 10 minutos.
 Enfríe y lea la absorbancia a 630 nm utilizando el blanco para calibrar el
equipo.
Tabla 4
TUBO
Tiempo incubación (min)
Volumen de sobrenadante (ml)
o-toluidina (ml)
Volumen total (ml)
1B
--0,5
3,0
3,5
2o-tol
0
0,5
3,0
3,5
3o-tol
20
0,5
3,0
3,5
4o-tol
40
0,5
3,0
3,5
De acuerdo a los datos obtenidos:
 Calcule la concentración de la glucosa en el filtrado desproteinizado utilizando
el coeficiente de extinción obtenido en el laboratorio Nº3.
 Calcule la concentración de glucosa en el medio de incubación sin
desproteinizar.
 Calcule la cantidad de glucosa (mg) entregada por los cortes de hígado.
 Calcule la cantidad de glucosa entregada por los cortes expresándola en mg
de glucosa por 100 mg de tejido.
 Haga una gráfica cuya abscisa represente el tiempo de incubación (0, 20 y
40 minutos) y cuya ordenada represente los miligramos de glucosa referidas a
100 mg de tejido.
5. Bibliografía
 Robert Bohinski, 1991. Bioquímica, 5ª Edición, Addison-Wesley,
Iberoamericana.
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