expoasa

UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFIA
Monografía:
Adaptive inhibitors of the HIV-1 protease
Hiroyasu Ohtaka, Ernesto Freire
Curso:
BIOQUIMICA
Alumnos:
Carlos Balmaceda
Javier Cornejo
Sebastián Gonzáles
Javier Ramírez
Kenyi Saito
Introducción
El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es un conjunto de manifestaciones
clínicas que aparecen como consecuencia de la depresión del sistema inmunológico
debido a la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
Actualmente se conocen 2 tipos de VIH:
 VIH-1
 VIH-2
La diferencia radica en la distribución, ya que el tipo 1 es predominante y se halla
distribuido globalmente, mientras que el tipo 2 se encuentra solamente en el oeste de
África.
El ciclo de vida del virus dentro del huésped se inicia cuando el primero se une
fuertemente a los receptores de membrana de los linfocitos T, fusionándose ambas
membranas (del retrovirus y del linfocito). Una vez sucedido esto, el ARN del virus
entra a la célula y gracias a la transcriptasa reversa se genera una copia del ADN a partir
de dicho ARN.
Dicha copia, se une al ADN de la célula, de modo que al momento de producir ARNm,
estas moléculas también codifiquen para las proteínas que permitan desarrollar nuevos
virus.
Una vez que se da la traducción, las proteínas formadas son cortadas por la enzima
proteasa para genrar fragmentos restantes formen ya sea partes estructurales o enzimas
que permitan la formación de nuevos patógenos para luego salir e infectar nuevos
linfocitos (Fig.1).
Figura 1.- Ciclo del virus VIH-1, incluyendo los puntos en que diversos inhibidores
pueden actuar.
Los inhibidores de proteasas son inhibidores competitivos fundamentales en el
tratamiento contra el VIH-1, los cuales actúan a nivel de dicha enzima.
Existen actualmente 7 inhibidores de uso clínico:
 Indinavir
 Saquinavir
 Nelfinavir
 Ritonavir
 Amprenavir
 Lopinavir
 Atazinavir
Los cuales presentan una considerable disminución en su sensibilidad ante la presencia
de mutaciones en el sitio activo de la enzima.
Estas mutaciones pueden dividirse en 4 grupos:
 Mayores:
Se dan cambio importantes en la resistencia fenotípica y clínica de la enzima.
 Menores:
Ocurren cambios accesorios.
 De sitio activo
 De no sitio activo
Es importante reasaltar que los cambio que afectan el sitio activo de la enzima no
producen una alteración de la polaridad o carga, sino simplemente de su geometría.
Las mutaciones también han generado una gran variedad de subtipos de virus VIH-1,
nombrados con las distintas letras del abecedario. Entre ellas se destacan en este
informe los subtipos A, C, G (hallados principalmente en África) y B (América y
Europa), los cuales presentan un polimorfismo en 10 aminoácidos y una diferencia
genómica de aproximadamente 30%.
Estas mutaciones juegan un rol fundamental, como veremos más adelante, a la hora de
diseñar nuevas drogas contra la enzima proteasa; además de brindar los parámetros
necesarios para el desarrollo de las mismas.
Respuesta del inhibidor a las mutaciones:
De los diferentes inhibidores que se usan en la actualidad, vemos que dependiendo de su
estructura y propiedades químicas, estos pueden presentar una buena o mala respuesta
frente a mutaciones de las proteasas (cambios conformacionales, geometría diferente,
reemplazo, aparición o desaparición de aminoácidos, etc).
Hasta la fecha se han desarrollado principalmente 2 tipos de inhibidores: los inhibidores
de estructura rígida y los de estructura flexible.
Los inhibidores de estructura rígida son altamente específicos y se unen muy fuerte a la
proteasa para la que fueron diseñados, pero tienen una capacidad de adaptación muy
pobre, lo cual limita en gran medida su eficacia.
En cambio los inhibidores de estructura flexible no presentan una especificidad tan alta
con la proteasa, pero si tienen una capacidad de adaptación mucho más alta que la de los
inhibidores rígidos, lo cual es muy ventajoso ya que como sabemos el HIV o VIH es un
virus que muta muy fácilmente.
Termodinámica de enlaces de inhibidores de 1ra y 2da generación:
Como ya sabemos, los inhibidores de proteasas desarrollados hasta el momento son
inhibidores competitivos y su efectividad depende de que sea más afín a la enzima que
el sustrato original.
La afinidad de unión esta determinada por la constante de afinidad (Ka), la cual a su vez
depende de la energía libre de Gibbs de la relación: Ka=exp (-D G/RT), y
DG = DH - TDS. Entonces con esta relación vemos que distintas combinaciones de
entropía y entalpía nos dan un mismo valor de energía libre de Gibbs, por ende un
mismo valor de Ka. Por esto en un principio se comenzó a diseñar inhibidores muy
rígidos, es decir inhibidores altamente específicos y que eran principalmente entrópicos.
Esto quiere decir que los inhibidores conseguían su fuerza de unión de la entropía que
gana el solvente (agua) al unirse a la proteasa, como se puede observar en la figura. 2.
Vemos que el Indinavir, Nelfinavir y el Saquinavir (los 3 de primera generación)
presentan una entalpía positiva, pero que es remediada con la gran entropía que generan
en el medio al unirse a la proteasa. Si bien el Ritonavir presenta una entalpía negativa,
esta también es de primera generación.
Figura 2. Valores termodinámicos de los inhibidores de proteasas de HIV-1 a 25ºC
Este tipo de inhibidores funcionaron muy bien hasta que comenzaron a darse cuenta que
frente a las mutaciones de la proteasa, ya sean debido a polimorfismos naturales o por
resistencia a drogas, eran poco o nada efectivos, por lo cual comenzaron a diseñar
inhibidores bajo un enfoque distinto. Comenzaron a darle prioridad a la entalpía, que en
este caso denota la calidad y cantidad de los enlaces que forma el inhibidor con la
proteasa. Esto les permitió diseñar inhibidores más flexibles (inhibidores de segunda
generación), ya que ahora la perdida entrópica era compensada por la entalpía y al ser
mas flexibles ganaban adaptabilidad frente a los distintos cambios de las proteasas,
producto de las mutaciones. Como podemos observar en la figura 2, los inhibidores de
segunda generación (del Amprenavir en adelante) presentan un valor de DH mucho mas
negativo al de los inhibidores de primera generación, en cambio su entropía no es tan
grande, debido principalmente a su flexibilidad.
Afinidad termodinámica de los nuevos inhibidores de proteasa para VIH-1:
G=H-T.S
“Una gran afinidad requiere de un cambio entalpico muy favorable” (Fig.3). Un menor
valor de la constante de disociación (Kd) nos indica que hay una mayor afinidad del
la
reacción (mientras mas negativo mas favorable es la reacción).
-1 subtipo B).
Hay dos puntos importantes (por lo menos para el caso del VIH) que se deben tomar en
cuenta al diseñar una nueva droga, y son:
La optimización entrópica, un cambio de entropía implica una variación en la
hidrofobicidad de la molécula, y aunque en teoría en cambio entrópico puede tomar
cualquier valor, la molécula no puede ser totalmente hidrofóbica pues el medio en el
que actúa es un medio acuoso (Fig. 4).
1, es la entropía cuando el inhibidor esta libre.
2, es la entropía del sistema cuando el inhibidor se une a la proteasa. En la Figura 4
2
1 pues se reduce la flexibilidad del inhibidor al entrar en el sitio
activo de la proteasa, mie
2
pues
se
reduce
la
superficie
de
contacto
y
por
lo
tanto
aumenta
la
1
entropía.
La optimización
para que los grupos polares de la droga puedan unirse al sitio activo de la proteasa
(interacciones débiles). La cantidad de puentes de hidrogeno que se formen entre el
inhibidor y la proteasa no es tan importante, lo importante es la “calidad” de estos, en
otras palabras si estas interacciones son formadas con puntos claves dentro del sitio
activo que estén relacionados al funcionamiento de la proteasa para este caso.
Fig. 4: La proteasa (P) y el inhibidor (I).
1
entropía del sistema cuando el inhibidor se une a la proteasa.
2,
es la
entalpía de unión del i
inhibidor deje de interactuar con el medio y pueda unirse a la proteasa (que la unión sea una
reacción mas favorable que la solvatación).
Susceptibilidad a las mutaciones y su relación con la resistencia:
Una alta afinidad por parte del inhibidor no garantiza una buena respuesta ante
mutaciones (Fig. 6), es por esto que la entropía (flexibilidad) toma tanta importancia
para el desarrollo de medicamentos actualmente.
La figura 6 muestra la comparación entre los resultados de afinidad con una especie
silvestre (KdWT) y con una especie mutante resistente a múltiples drogas (KdMDR),
este mutante tiene 6 mutaciones diferentes que se encuentran repartidas a nivel de sitio
activo, en la región flap (extensiones flexible que permiten la entrada y salida del
sustrato) y en la región de dimerización (leucine zipper domain). Habíamos mencionado
antes que un valor menor de Kd significaba que había una mayor afinidad, aplicando
esto a la figura 4 podemos apreciar que todos los inhibidores que formaron parte de
estas mediciones tienen una gran afinidad por la especie silvestre (WT) mas no así por
el mutante resistente a múltiples drogas (MDR). Esta perdida de afinidad también esta
representada como perdida de potencia (los números que se encuentran sobre cada
barra), esta perdida de potencia no es otra cosa mas que la perdida de su efectividad (la
efectividad del inhibidor). En el recuadro rojo se encuentran las 3 drogas (KNI-764,
TMC-126 y TMC-114) que perdieron menos potencia y por tanto trataron de mantener
su afinidad (flexibilidad), mientras que en el recuadro azul tenemos a una de las drogas
que perdió mas potencia y afinidad y por tanto se volvió inefectiva frente al MDR (la
KNI-272). Hay otro detalle que debe tomarse en cuenta La drogas que obtuvieron
valores de Kd iguales a 1 tienen una afinidad igual tanto para la WT como para el MDR.
De esta sección se puede concluir que hay inhibidores que se adaptan mejor que otros a
las mutaciones y que por las perdidas de potencia de los inhibidores según la figura 4 se
puede deber a la acumulación de mutaciones (en este caso 6 mutaciones).
Fig. 6: Comparación entre los resultados de afinidad con la especie silvestre (KdWT, color negro) y
con una especie mutante resistente a múltiples drogas (KdMDR, color plomo).
Adaptabilidad y selectividad
Con respecto a la adaptabilidad de los inhibidores surgen dos preguntas importantes. La
primera de ellas es ¿qué características de los inhibidores pueden ayudar a predecir una
buena respuesta a mutaciones? Para responder esta pregunta se realizaron diversas
correlaciones de entre las cuales una en particular resultó interesante. Se utilizó como
parámetro la razón de la afinidad del inhibidor hacia la proteasa mutante con la afinidad
hacia la proteasa silvestre, o la razón Kd (Kd, mutante/ Kd, silvestre). Se correlacionó el
logaritmo de la razón Kd y la proporción con la que la entalpía de unión contribuye a la
afinidad de unión en la proteasa silvestre y en la gráfica log(razón Kd) vs. ∆H/∆G se ve
claramente que las menores susceptibilidades a ciertos mutantes (MDR-HM y MD-QM)
se esperan cuando las contribuciones a la energía de Gibbs sean o predominantemente
entálpicas o predominantemente entrópicas. Si se comprobara que este patrón se da en
la mayoría de los casos se podría predecir la susceptibilidad de un inhibidor hacia
mutaciones con datos obtenidos solamente de la proteasa silvestre.
La segunda pregunta a responder es si los inhibidores que muestran baja susceptibilidad
a mutaciones pierden su selectividad y se unen a objetivos no deseados con relativa alta
afinidad. De ser esto cierto, la consecuencia de una baja susceptibilidad a mutaciones
sería un aumento en la unión no específica y por lo tanto, mayores efectos secundarios.
Los inhibidores se unen a proteínas no relacionadas (como proteínas séricas) con
diferentes afinidades de unión y estequiometrías. El unirse a estas proteínas séricas
disminuye la cantidad disponible de inhibidores y facilita que la proteasa pueda mutar
eficientemente. Idealmente, los inhibidores a proteas deberían poder ser efectivos frente
a distintas variaciones de la proteasa y mantener su selectividad hacia otras proteínas
para evitar efectos secundarios. Luego de realizarse experimentos, se pudo demostrar
que al menos para la proteína homologa Catepsina D, la adaptabilidad no compromete
la selectividad dado que aquellos inhibidores que respondían mejor al mutante resistente
a drogas presentaron mayor selectividad hacia esta proteína homóloga.
Mecanismos de escape de mutaciones e inhibidores adaptativos
Desde un punto de vista termodinámico, habrá una buena respuesta del inhibidor si la
energía de Gibbs no se ve significativamente afectada, la cual depende de los cambios
en entalpía y entropía que se den, de acuerdo a la magnitud de las mutaciones.
La entalpía tiene su fuerte en las interacciones intermoleculares y los enlaces que se
formen entre el sustrato y la enzima. Cuando ocurren mutaciones, la formación de estos
enlaces se ve severamente afectada, ocasionando una disminución en los mismos, un
debilitamiento y por ende, una disminución en la entalpía de unión. Sin embargo, se
analizaron inhibidores que fueron menos susceptibles a estas mutaciones, y se observó
que a pesar de haber una disminución en la entalpía, ésta se compensaba con un
aumento de entropía. Es posible que la ganancia de entropía de unión, pueda darse por
una entropía favorable del solvente, un incremento en grados de libertad o una mezcla
de ambos. La diferencia puede verse en inhibidores que son más rígidos y en aquellos
que son más flexibles, es decir, que pueden tener o no, diferentes alternativas sobre su
conformación para que sea más fácil acomodarse de acuerdo a la distorsión que podría
haber ocurrido en el sitio activo.
Aquellos inhibidores que podrían moldear su estructura de tal manera que, aún puedan
mantener su función frente a mutaciones, hasta cierto punto mejor que otros, son
denominados inhibidores adaptativos. Para que estos inhibidores no pierdan sus
funciones por completo, siempre deben tener una cierta afinidad con el sitio activo de la
enzima. Como el virus del VIH necesita de esta enzima para cumplir sus funciones, no
le conviene que las mutaciones sean en todo el sitio activo, porque podría perder
afinidad con el sustrato blanco. Es por esto que siempre va a poseer regiones
conservadas, y es ahí donde los inhibidores adaptativos deben estar enfocados, para que
así, puedan mantener una afinidad con la enzima y puedan actuar sobre ella.