Fernando Poester 2

Inmunología Veterinaria Aplicada a Salud Animal
Facultad de Veterinaria-UdelaR
20 a 31 de julio 2015
ESTRATÉGIAS ACTUALES
EN EL DIAGNÓSTICO DE LA
BRUCELOSIS BOVINA
Fernando Padilla Poester
Med. Vet.
CONCEPTOS
El diagnóstico es un proceso imperfecto,
resultando en probabilidad y no certeza de
identificar correctamente el estado de salud de
un animal.
Quando el diagnóstico es medido en escala
contínua, existe siempre sobreposición de
resultados entre la población de animales
infectados y no infectados.
Resultados de Teste Diagnóstico en animales con y sin Infección
(Situación ideal)
600
Nº de animais
500
Com infeção
Sem infeção
400
300
200
100
0
0 - 1 1,1 - 2,1 - 3,1 - 4,1- 5 5,1 - 6,1- 7 7,1- 8 8,1- 9 9,1, 10,1 - 11,1 - >
2
3
4
6
10 11,0 12,0 12,0
Reação em mm
Resultados de Teste Diagnóstico en animales con y sin Infección
(Situación real)
600
Nº de animais
500
Com infeção
Sem infeção
400
300
200
100
0
0-1
1,1 - 2 2,1 - 3 3,1 - 4
4,1- 5
Reação em mm
5,1 - 6
6,1- 7
7,1- 8
8,1- 9
>9
CONCEPTOS
Sensibilidad - probabilidad que tiene un test de identificar todos los
animales infectados en una población.
Especificidad - probabilidad que tiene un test de identificar todos los
animales no infectados en una población.
Valores predictivos positivos y negativos - probabilidad de que
los resultados positivos o negativos correspondan a los verdaderos
infectados o no infectados respectivamente.
Prevalencia – tiene influencia sobre los valores predictivos positivos
y negativos.
CONCEPTOS
Prueba “screening” (tamiz) – bajo costo, rápida, alta sensibilidad
Prueba confirmatória – alta especificidad
Pruebas sequenciales – tamiz + confirmatória
especificidad aumentada
Consecuencia = menos falsos-positivos
Diagnóstico
Directo: presencia del organismo o su DNA
Aislamiento bacteriano (tejidos, semen, leche)
PCR – Reacción de la Polimerasa en cadena
Imunohistoquímica
Indirecto: anticuerpos
Sangre
Leche
Necropsia
s
Diagnóstico bacteriológico
Bioseguridad nivel 3
Diagnóstico Bacteriológico
Medio de Farrell: agar triptosa + suero (5%) + antibióticos
(Polimixina B, Bacitracina, Cicloheximide, Acido Nalidíxico, Nistatina, Vancomicina)
Vaca: linfonodos parotídeo, pré-escapular, bronquial, iliaco interno,
supra-mamário, isopo vaginal, bazo, leche. Feto: linfonodo bronquial,
contenido estomacal, bazo , hígado, pulmon, isopo rectal.
Diagnóstico Bacteriológico
Aislamiento
Necessidad CO2
Desvantajas
tiempo
riezgo de infección
Diagnóstico Bacteriológico
Caracterización bioquímica
fucsina
Fagotipificación
tionina
Inmunohistoquímica
Metabolismo oxidativo
ureasa
PCR – Reacción de Polimerase en cadena
Fekete et al (1990) – basado en la amplificación de 635 bp del gene
que codifica para 43KDa omp de B.abortus S19
1- Caracterización de Género – single pairs of primers - dirigido a los genes que
codifican para:
43 KDa omp, 16SrRna, BCSP 31, perosamina sinthetase, 16s23S, per, omp 2,
omp2a, omp 31, ery (S19), WboA (RB51)
2- Multiplex PCR – species –specific (algunos biovares). Reconoce varios patogenos
AMOS-PCR – Abortus 1,2,4 Melitensis Ovis Suis 1. Basado en la localización de la
secuencia de inserción IS711 (fuente del polimorfismo del DNA).
BaSS-PCR – Brucella abortus Strain Specific – separa abortus bio 1,2,4 y S19
Bruce-Ladder-PCR –separa cepas de campo y las cepas vacunales en un único paso
(confunde B.canis con B.suis y no identifica B.microti)
3 –Investigación epidemiológica (tracing back strains to their origin). Based on
Variable number of Tandem Repeat sequences
microsatellites
minisatellites
Markers (affect protein expression)
MLVA-PCR – Multi-Loccus Variable Number of Tandem Repeats
HOOF-PRINTS-PCR- Hypervariable Octameric Oligonucleotide Fingerprints (8 loci)
(cepas dentro de un foco – no biovars)
MLVA-15 (15 markers) – Two Panels
Panel 1 – 8 minisatellite markers – specific identification
Panel 2 – 7 microsatellite markers – highly discriminatory
4 – REAL-TIME PCR – (Brucella cells, serum, blood, tissues)
Rápido, no análisis electroforética, evita contamimantes
Primers B4 y B5
SYBR Green – Género – TaqMan probe to bcsp31 (human brucellosis)
FRET – Fluorescence Resonance Energy Transfer
5 - NESTED AND SEMI-NESTED PCR
- 2 pares de primers para un único locus
- Más específico que el PCR estandar
- Primers derivados del IS711
- Uso combinado con RT-PCR
6 - PCR PARA ESPÉCIES MARINAS
- IRS PCR - Infrequent Restriction Site PCR
- RFLP – Restriction Enzyme Digestion
- IS 711 – fingerprints profiles
PCR – Reacción de Polimerase en cadena

La PCR es muy util con bactérias muertas o en muestras muy
contaminadas.

Sensibilidad y especificidad de la mayoria de los métodos no está
completamente establecida.

El uso con muestras clínicas y como diagnóstico definitivo no há sido
suficientemente evaluado.

Necesita validación, patronización de controles +vos y –vos, reactivos,
garantia de calidad (quality assurance).

La PCR no há reemplazado los métodos directos para todos los tipos de
muestras biológicas.

El gold standard sigue siendo la bacteriologia y biotipificación clásicas.
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization
Time-of-Flight Mass Spectrometry
MALDI-TOF MS
MALDI-TOF MS
Sistemas Comerciales de Identificación
Bioquímica
1) API 20 NE® (bioMérieux, Nürtingen, Germany) – usar con cuidado
Potencial confusión de Brucella spp - Moraxella phenylpyruvica y Ochrobactrum anthropi
(Barham et al, 1993)
2) Micronaut™ (selección de 96 substratos)
(Al Dahouk et al, 2010)
Menor tiempo en los resultados
Menor riezgo de infección en el laboratório
Espécies y biovares – 48 h
Diagnóstico Serológico
Reacción antígeno-anticuerpo en respuesta à Brucella
Brucelas lisas poducem anticuerpos contra brucelas lisas
Reactividad cruzada: B.abortus, B.melitensis, B.suis, S19
Brucelas rugosas producem anticuerpos contra brucelas rugosas
Reactividad cruzada: B.canis, B.ovis, RB51
Principal antígeno involucrado: LPS (liso, rugoso)
Diagnóstico Serológico
Fácil ejecución e interpretación
Rapidez en la obtención de los resultados
Bajo costo (tamiz y algunas confirmatórias)
Mayoria patronizadas internacionalmente
Diagnóstico Serológico
Ni todo animal +vo está infectado
- vacunados, otros agentes
Ni todo animal -vo está libre de infección
- periodo de incubación, anticuerpos incompletos
Especificidad y sensibilidad variable según la prueba
Características
IgM
• Pentamero
• PM: 900.000
• Termo lábil
• pH ácido lábil
• Radicales tiol lábil
Macroglobulina
Características
IgG1
• Monomero
• PM: 180.000
• Termo resistente
• pH ácido resistente
• Radicales tiol resistente
Microglobulina
Respuesta Humoral
Respuesta de los principales isotipos de anticuerpos en bovinos
infectados/no vacunados y vacunados (C19) - período prolongado
Vacunados entre 3-8 meses
200
200
IgG1
IgM
IgA
IgG2
100
0
Título de Anticorpos em UI
Título de Anticorpos em UI
Infectados o vacunados >8 meses
IgG1
IgM
100
IgA
IgG2
0
0
5
Tempo em meses
12
0
5
12
Tempo em meses
Nielsen et al 1996
EVOLUCIÓN DEL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO
1898 - suero-aglutinação lenta (Wright e Smith)
1909 – fijación del complemento (McFadyen e Stockmann)
1963 – fijación del complemento patronizada (Hill)
1967 – card test (Nicoletti) e RBT (Morgan)
1969 – vacunados x infectados –IDR (Diaz et al.)
1970 – ELISA indirecta (Carlsomm et al.)
1984 – BPAT (Angus e Barton)
1985 – PCFIA (Jolley)
1989 – ELISA competitiva. Vac x infect. (Nielsen et al.)
1990 – PCR (Fekete et al.)
1996 – FPA (Nielsen et al.)
Pruebas de aglutinación
Pruebas lentas (incubación hasta 48h)
- SAL (suero-aglutinación lenta en tubos)
- SAL c/ 2ME (IgM)
- SAL c/ dithiothreitol (IgM)
- SAL c/ rivanol (glicoproteinas)
- SAL c/ EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid)
- SAL c/ antiglobulina (Coombs)
- PAL (anillo en leche)
Pruebas rápidas (realizadas en minutos)
- RB (rosa bengala)
- AAT (rosa de bengala modificada)
- BPAT (antígeno acidificado buferado en placa)
- Card Test
- Rivanol
- Inativación del soro por calor (56°C e 65°C)
- Adición de 10% de NaCl
Pruebas de fijación del complemento
- Caliente (37°C)
- Frio (4°C)
- Hemólisis en gel
- Hemólisis indirecta
Pruebas de precipitación
- IDG (Imunodifusión doble en gel)
- IDR (Imunodifusión radial)
Ensayos de Unión Primária (Primary Binding)
- Radioinmuno ensayo
- Imunoensayo fluorescente
- Imunoensayo de recuento de partículas
- Elisa indirecto (Elisa-I)
- Elisa competitivo (Elisa-C)
- Ensayo de polarización fluorescente (FPA)
Respuesta Serológica Pós-infección
21d
30d
6-7m
>12m
Godfroid et al 2010
-
+
AAT
+
2ME
-
Anillo en leche
+
FC
-
Ensayo
Imunoenzimático
(Elisa)
Prueba de Polarización
Fluorescente (FPA)
Ensayos Inmunoenzimáticos
Vantajas:
• Reactivos purificados (mayor acurácia)
• Automación/semi-automación (grande no muestras)
• Interpretación no subjetiva (equipamientos)
• Uso de Anticuerpos monoclonales como sistema de detección
Desvantajas:
• Costo (inicial alto)
• Sujeto a errores por alta diluición de los reactivos
• Muchos pasos involucrados
• Patronización compleja
Ensayos Inmunoenzimáticos
Elisa Indirecto
Elisa de competición
ELISA INDIRECTO
Ag – SLPS
Ag + suero teste
Ag + suero teste +
Ac monoclonal
M23 (anti-IgG1- HRPO)
Color
H2O2/ABTS
Soro Positivo
ELISA COMPETITIVA
Ag-SLPS
Ag + suero teste +
Ac monoclonal
G anti M IgG-HRPO
M84 (anti-cadena O)
Color = Soro negativo
H2O2/ABTS
Ensayos Inmunoenzimáticos
 El I-elisa tiene alta sensibilidad. No hace diferenciación entre Ac vacunales
(C19) y Ac de reacción cruzada y por eso la especificidad es más baja.
 El I-elisa es excelente como prueba tamiz por su alta sensibilidad.
 El C-elisa presenta mejor desempeño que el I-elisa con sueros de animales
vacunados (C19) ó en casos de reacción cruzada.
 El monoclonal del C-elisa fué seleccionado para tener más afinidad para el
antígeno que los Ac vacunales ó de reacción cruzada, y con menos afinidad
para los Ac de infección (menos falsos positivos).
 El C-elisa tiene más especificidad que el I-elisa y por eso es tiene su uso
recomendado como prueba confirmatória.
Polarización Fluorescente
Perrin (1926) – desarrolló la teoria
Jolley (1981) – describió la técnica
Pesce et al. (1990); Clark et al (1992) – detección de drogas
Urios &Cittanova (1990); Tsuruoka et al (1991) – detección de macromoléculas
Nielsen et al (1996) – adaptaron para detección de anticuerpos contra Brucella spp
Polarización Fluorescente
Las moléculas en solución giran, al azar, a uma tasa inversamente
proporcional a su tamaño.
La tasa de rotación se puede medir el los planes horizontal y vertical
usando una marcación fluorescente y luz polarizada.
Polarización Fluorescente
La tasa de rotación de la molécula de antígeno marcado con la sustância
fluorescente se alterará con la unión al anticuerpo y ese cambio de tamaño
puede ser medido
Polarización Fluorescente
http://ellielab.com/products/#BFPA
Polarização Fluorescente
Polarización Fluorescente
Polarización Fluorescente
El FPA es una prueba muy precisa y la sensibilidad/especificidad pueden
ser manejadas alterandose los valores del cutoff entre el positivo y el
negativo y con eso volviendo el test más sensible (tamiz) o más especifico
(confirmatório).
El FPA tiene capacidad de discernir entre Ac vacunales y los de infección y
puede eliminar algunas reacciónes cruzadas.
Imunodifusión en gel de agar (IDGA)
para brucelas rugosas
Radial
Doble
Nielsen 2002
OTRAS PRUEBAS
Inmuno ensayo fluorescente (capture and elution technique)
 Usa la fluorescencia del Cyanine-5 conjugado con el anticuerpo
 Buena sensibilidad y especificidad
 Bajo costo
Ensayos de Chemiluminescencia
 Homogéneo
 Wash format
 Chemiluminescent multiplex iELISA
A captured image from a iElisa array for the
simultaneous detection of anti-Brucella Abs
against several antigens
Lateral Flow Assay
(Immunochromatographic assays)
A lateral flow test typically incorporates a sample pad that is intimately associated
with a conjugate pad. This in turn touches a membrane onto which test and
control reagents have been immobilized. An absorbent pad wicks fluid away from
the membrane.
BioDot Quanti 2000 machine
CONCLUSIONES FINALES
 El objetivo de la erradicación no tiene que ser “zero seropositividad” sino
ausencia de infección. Ninguna técnica detecta a todos los infectados.
 La biologia molecular avanza cada dia más y luego irá reemplazar las
técnicas bacteriológicas convencionales.
 La serologia también há avanzado mucho mejorando la acurácia del
diagnóstico.
 El uso de vacunas que no interfieren con la serologia y los ensayos de
unión primária harán el diagnóstico más manejable.
 Cada país debe adecuar la metodologia diagnóstica acorde a sus
posibilidades y necesidades.
 La elección de la metodologia deberá basarse en los objetivos que se fijen
a cada país.
MUCHAS GRACIAS POR
SU ATENCIÓN