6. Consideraciones en la validación de los métodos analíticos para la determinación de Residuos en matrices biológicas de origen animal. Dr. Gonzalo Suárez.

30-Apr-15
Sistemas de Aseguramiento de
calidad en laboratorios
CONTENIDO
Consideraciones en la validación de los
métodos analíticos para
la determinación de residuos en matrices
biológias de origen animal
¿Que es un residuo de medicamento veterinario?
Requisitos en validación en métodos analíticos para determinación
residuos
Caracteristicas paticulares de cada parámetro evaluado
Consideraciones particulares para la evaluación de residuos
Gonzalo Suárez, DMTV, PhD
ÁREA FARMACOLOGIA, FACULTAD DE VETERINARIA
Montevideo, 30 de abril de 2015
[email protected]
Que entendemos por un residuos de
medicamentos veterinario?
ETIQUETA
(MATRIZ BIOLÓGICA)
▪ “Toda sustancia farmacológicamente activa, ya sean
ingredientes, excipientes o productos de degradación y sus
metabolitos que permanecen en los productos alimenticios
obtenidos de animales a los que se administró el medicamento
veterinario en cuestión” Camevet 2013
Amplia relación con la TOXICIDAD POTENCIAL
(ADI = NOEL / SF)
Tiempo
de espera
Intervalo de tiempo desde la ultima
administración del medicamento a la
especie destino, en condiciones normales
de uso, hasta que los tejidos destinados al
consumo humano alcanzan niveles iguales
o inferiores al LMR fijado.
Validación de métodos
Farmacocinética del
medicamento
MEDICAMENTO
VETERINARIO
Sustancia
activa
RESIDUO
Límites máximos de
residuo - LMR
(gestión riesgo)
Especie /
Posología
Criterios de validación
“Demostrar que un método analítico cumple con lo requerimientos
para un determinado propósito”
Abril 2011
Revisión: Mayo 2013
GUÍA PARA LA VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS
ANALÍTICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE
RESIDUOS EN MATRICES BIOLÓGICAS DE ORIGEN
ANIMAL
Habilidad para detectar, identificar y cuantificar un
analito en una matriz en particular
(inter-laboratorio / intra-laboratorio)
Desarrolla
el método
Valida el
método
Implementa
el método
CAMEVET
(Comité de las Américas de Medicamentos Veterinarios)
REPRESENTACIÓN REGIONAL DE LA OIE PARA LAS AMÉRICAS.
VICH no49; 2015
International Cooperation on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Veterinary Medicinal Products
PROSAIA, 2013
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Rango analítico
Incluir el LMR
Criterios de validación
LINEALIDAD
 Linealidad – rango analítico
 Exactitud
APLICAN
 Precisión
 reproducibilidad
Estudios
Farmacocinéticos, de
eliminación de residuos o
de bioequivalencia
 repetibilidad
 Sensibilidad
 límite de detección
 límite de cuantificación
 Especificidad
Matrices biológicas
 Porcentaje de recuperación
 Estabilidad
VICH no49; 2015
• DEMOSTRAR UNA RELACIÓN LINEAL DENTRO DEL RANGO DE CONCENTRACIONES
ESPERADAS EN LA MATRIZ ESTUDIADA
 Matriz fortificada con el estándar y posteriormente procesada (extracción)
 5 concentraciones diferentes (mínimo) (tres repeticiones)
 Demostrar linealidad LOQ a 120% de la concentración que se pretende analizar
 Evaluar la homocedasticidad (heterocedasticidad= evaluar ponderar)
CRITERIO DE ACEPTACIÓN
 Determinación del coeficiente de correlación (r2).
 Distribución de los residuales
 Ordenada en el origen (Intersección eje Y)
 REPETIBILIDAD desvíos ≤ 15% (LOQ ≤ 20%)
Guía para la validación de los métodos analíticos para la determinación de
residuos en matrices biológicas de origen animal. PROSAIA, 2013
EXACTITUD y PRECISIÓN
CRITERIO DE ACEPTACIÓN
EXACTITUD /
VERACIDAD
Desviaciones aleatorias y sistemáticas
 Exactitud = [ experimental ] – [ teórica ] * 100
[ teórica ]
• EXPRESA COMO % DE RECUPERACIÓN O % DE ERROR.
preciso
y
exacto
preciso
pero
inexacto
o
 Se relaciona con el error sistemático (método analítico) y a recuperación del analítico
(porcentaje de recuperación)
impreciso
pero
exacto
 Requiere un mínimo de 5 reproducciones en tres concentraciones diferentes.
 Muy dependiente de las concentraciones del analito:
impreciso
e
inexacto
Concentración de analito
Rango aceptable
< 1 µg/kg
-50% a +20%
≥ 1 µg/kg < 10 µg/kg
-40% a +20%
≥ 10 µg/kg < 10 µg/kg
-30% a +10%
≥ 100 µg/kg
-20% a +10%
Codex
µg/kg = ng/g = ppb
CRITERIO DE ACEPTACIÓN
PRECISIÓN
 Coeficiente de Variación (CV)
CV= Desvío estándar * 100
media
• EXPRESA EN TÉRMINOS DE REPETIBILIDAD Y PRECISIÓN INTERMEDIA (reproducibilidad interna).
 Reproducibilidad interlaboratorio hace parte del sistema de calidad propio del laboratorio.
 Requiere un mínimo de 5 reproducciones en tres concentraciones diferentes.
 Dentro del rango de validación (incluyan LOQ) (baja, media y alta)
 Realizarse en tres días de análisis
Concentración de analito
Repetibilidad para cada punto
 ≤ 20% CV
(15%)
35%
≥ 1 µg/kg < 10 µg/kg
30%
≥ 100 µg/kg
 Coeficiente de Variación (CV)
CV= Desvío estándar * 100
media
• EXISTEN VARIAS MANERAS VÁLIDAS DE DETERMINAR EL LOD y LOQ.
IUPAC (International Unien of Pure and Applied Chemistry)
 Criterio utilizando 20 muestras blanco (6 fuentes distintas)
 Calcula la media y desvió estándar
 LOD = 3 veces el desvío estándar / LOQ = 6 veces el desvío estándar
 Aceptación de los criterios de exactitud (80-120%) y precisión (≤20%) en el LOQ (%CV).
Relación Señal / Ruido
Reproducibilidad interna
CV%
< 1 µg/kg
≥ 10 µg/kg < 10 µg/kg
CRITERIO DE ACEPTACIÓN
LÍMITE DE DETECCIÓN Y
CUANTIFICACIÓN
20%
15%
µg/kg = ng/g = ppb
VICH
 Gráfico de concentración esperada vs. agregada (intervalo de confianza)
 Calculamos CCα (menor concentración a la cual un método puede
discriminar, con una certeza estadística de 1-α que el analito esta
presente) (probabilidad 1% - falso positivo)
 Calculamos CC (concentración mínima a la cual el método es capaz
de detectar muestras realmente contaminadas con una certeza
estadística de 1- ) (probabilidad 5%- falso negativo)
No se detecta
LOD
Se detecta
LOQ
Se cuantifica
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SELECTIVIDAD
• SE EXPRESA EN RELACIÓN A LAS SUSTANCIAS ENDÓGENAS PRESENTES EN LA MATRIZ
 Requiere que la respuesta de las muestras control NO superen el 20% LOQ.
 Requiere determinar cuanto tiempo se puede mantener una muestra en condiciones de
almacenamiento sin sufrir degradación excesiva antes del análisis
 Fortifica muestras control (blanco) con concentraciones conocidas
 Dos concentraciones cercanas a los extremos, por triplicado
 Mantiene las muestras en similares condiciones a las experimentales
 Análisis periódico en intervalos específicos
 Inicio
 Intermedio (semanas)
Valido considerar
 Final (meses)
utilizar muestras
reales
 Estudios de congelamiento / descongelamiento
 3 ciclos, considerando un ciclo por día como mínimo
• SE EXPRESA EN RELACIÓN A LA VARIABILIDAD DEL CV% EN TODAS LAS CONCENTRACIONES
(mínimo tres: baja, media y alta), MAS QUE UN MÍNIMO DE RECUPERACIÓN (70% ???)
CRITERIO DE ACEPTACIÓN
 Rango de variación (CV) ≤ 20% en todas las
concentraciones
MUETRA
PROCESADA
 Rango de variación ≤ 15%
• CONSIDERAR QUE LAS MUESTRAS SUFREN PROCESOS DE
CONGELADO, ALMACENAMIENTO Y DESCONGELADO
PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN
ESTABILIDAD
CRITERIO DE ACEPTACIÓN
MATRIZ
ESTABILIDAD
CRITERIO DE ACEPTACIÓN
Protocolo para la Validación I
 Rango de variación ≤ 15%
• CONSIDERAR QUE LAS MUESTRAS PUEDEN PROCESARCE UN DÍA Y ANALIZARCE AL
SEGUNDO DÍA
•
 Requiere determinar cuanto tiempo se puede mantener una muestra procesada sin sufrir
degradación excesiva antes del análisis
 Fortifica muestras control (blanco) con concentraciones conocidas
 Dos concentraciones cercanas a los extremos, por triplicado
 Procesan las muestras en similares condiciones a las experimentales
 Análisis periódico en intervalos específicos
 Horas (4 – 24 horas)
 Temperatura (temperatura ambiente o 4oC)
Valido considerar
utilizar muestras
 Seguir los requisitos del método de trabajo
reales
Primer Día / Segundo Día / Tercer Día (3 días diferentes una jornada analítica)
6 niveles de fortificación / 3 - 6 muestras control (18 – 36 muestras)
Calcula repetibilidad intradía e interdía, LOD y LOQ
Recuperación
porcentual (R%)
(A’ / A*100)
Reproducibilidad
Repetibilidad
CV% para cada nivel CV% para cada nivel
de fortificación y
de fortificación y
global
global
LOD y LOQ
Límites de decisión (IC90%)
Error α (falso positivo)
Error  (falso negativo)
Distintos días
Un mismo día
VICH no49; 2015
Recuperación %
• por nivel / día
• Global
Repetibilidad (R%)
• por nivel / día
Reproducibilidad
• por nivel
• global
α
Concentración
hallada
Límite
de
decisión
LOD y LOQ
Límites de decisión (IC90%)
Error α (falso positivo)
Error  (falso negativo)

LOD
LOQ
Concentración de fortificación
Protocolo para la Validación II
VICH no49; 2015
Protocolo para la Validación III
VICH no49; 2015
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Sistemas de Aseguramiento de
calidad en laboratorios
CONSIDERACIONES FINALES
Distintos ámbitos de aplicación: Registro Medicamentos – Alimentos
Sustancias Prohibidas y Sustancias con MLR
Variabilidad de Matriz de acuerdo a la sustancia en cuestión
ÁREA FARMACOLOGIA, FACULTAD DE VETERINARIA
GRACIAS por su ATENCIÓN
Gonzalo Suárez, DMTV, PhD
Montevideo, 30 de abril de 2015
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