Introducción
Clasificación de inhibidores
Importancia en la salud pública
Método de detección de inhibidores
Descripción de los métodos microbiológicos (Galesloot y
Delvotest P y P-multi)
¿Qué son?
Son moléculas que bloquean o producen un enlentecimiento en el
crecimiento bacteriano. Sustancias que en la leche tienen efecto
bacteriostático o bactericida.
Reglamento Bromatólogico Nacional (Dec. 315/994)
Deseables o no?
Genera problemas a diferentes sectores de la sociedad:
PRODUCTOR: Pago por calidad
INDUSTRIA: Calidad de la materia prima y efectos en los
productos a elaborar (productos fermentados)
CONSUMIDOR: Salud pública
TIPOS DE INHIBIDORES:
1. Naturales
2. Químicos
3. Bacteriófagos
4. Antibióticos
Artificiales: sustancias bacteriostáticas o
bactericidas (inhibidoras del crecimiento
bacteriano), cuya presencia en leche no es
ni natural ni deseada
INHBIDORES NATURALES
Sustancias antibacterianas presentes en leche cruda
Clasificación:
• Inhibición específica:
• Inmunoglobulinas
• Aglutininas
• Inhibición inespecífica:
• Lactoperoxidasa
• Lizozima
• Lactoferrina
INHIBIDORES QUÍMICOS
Presentes en leche debido a prácticas defectuosas (lavado
maquina de ordeñe, concentraciones no adecuadas, etc)
Detergentes e Higienizantes
Desinfectantes (clorados, yodados)
BACTERIÓFAGOS
Son virus de las bacterias
Provocan lisis bacteriana
Están ligados a la falta de higiene y mal manejo de las
tecnologías
ANTIBIÓTICOS
Se utilizan para combatir enfermedades causadas por
microorganismos, por ej: mastitis
Clasificación:
• Familia Química (ß-lactámicos,
Tetracilcinas, Aminoglucósidos)
• Efecto- bacteriostático y bactericida
• Espectro de actividad
Macrólidos,
Problemas que plantean los residuos de antibióticos en leche
Importancia desde el punto de vista tecnológico:
La penicilina pierde solamente un 8% de su actividad luego de
la pasteurización. Un tratamiento térmico más exigente (90°C
por 30 minutos), destruye el 20% de la actividad de la
penicilina y la esterilización un 50%.
ANTIBIÓTICOS
La cantidad de antibiótico que llega a la glándula mamaria
depende de:
• Principio activo y vehículo (oleosos o acuoso)
• Dosis y vía de administración (determina el % de
antibiótico que se elimina por leche)
• Tiempo transcurrido entre el fin del tratamiento y
el ordeño (tiempo de espera)
1962, Food and Drug Administration (FDA) de EEUU
Fines de la década del 60, la Organización Mundial de la
Salud (OMS) y otros organismos internacionales (FAO)
establecen normas
Antibacterianos “residuos”, “concentraciones residuales” o
“inhibidores”
Para cada sustancia se fija un límite máximo de residuo (LMR) o
“niveles de seguridad” o “tolerancia” para la protección hacia el
consumidor.
Salud pública
• Alergias
• Resistencia
Industria láctea: • Interferencia con los cultivos iniciadores en la
elaboración de queso y yogur
Ganadero (sanciones)
Salud pública
• Alergias
• Resistencia
Industria láctea: • Interferencia con los cultivos iniciadores en la
elaboración de queso y yogur
Ganadero (sanciones)
Efectos en procesos industriales (queso y productos fermentados):
Demora en la acidificación
Demora en la coagulación
Coagulación deficiente
Disminución en la retención de agua
Efectos en procesos industriales (queso y productos fermentados):
Desarrollo de microorganismos indeseables
Alteración de las características normales del producto
Interferencia en la formación de aroma en manteca
fermentada
Microbiológicos
• Prueba de fermentación (coagulación)
• GALESLOOT (Disco de filtro)
• DELVOTEST (P y P multi)
Enzimáticos
• Penzime III
• SNAP
Ensayos de sustitución y competencia
(receptores)
• CHARM I y II (14C y tritio, H3)
• Parallux (sust. fluorescentes)
Métodos
microbiológicos
• Prueba de la coagulación
• GALESLOOT (Disco de filtro)
• DELVOTEST (P y P multi)
Principio
Verificar la capacidad de fermentación de un cultivo de
Streptococcus termophilus (yogur) en la leche a controlar.
Si un inóculo del cultivo falla en producir la acidificación y
coagulación, la prueba se considera positiva.
• Prueba sencilla
• Dificultades para su estandarización
• No está considerada en las ordenanzas internacionales
Principio:
Sustancias inhibidoras (leche) difunden por el medio impidiendo
el desarrollo de una cepa bacteriana, verificándose una zona clara
alrededor del disco (halo) (Federación Internacional de lechería, FIL, 1991)
Metodología:
Sembrar 1ml de un cultivo del m.o Bacillus stearotermophilus
var. calidolactis
Agregar el medio de cultivo TSA, (previamente fundido y
enfriado)
Identificar
Tomar los discos con pinza estéril (discos y pinza),
impregnarlos con la leche problema homogeneizada
Depositarlos sobre el medio (solidificado), leve presión
Invertir la caja e incubar a 55º durante 2 ½hs.
Metodología:
Control negativo:
Colocar disco con leche normal (sin antibiótico)
Control positivo:
Colocar disco leche con antibiótico (penicilina 0.005 UI)
1.
2.
3.
4.
Lectura:
Positivo:
Zona sin crecimiento microbiano alrededor del disco
(verificar con el disco control)
Las muestras que presenten halos de inhibición de igual diámetro
o mayor que el del disco control se consideran positivas
Negativo:
Crecimiento homogéneo alrededor del disco
Principio:
Se agrega la leche (con sust. nutritivas) a un gel de agar que contiene
Bacillus Stearotermophilus var. calidolactis
Incubación
Observa el cambio de coloración del medio
Metodología:
Cortar las ampollas a utilizar
Identificar
Perforar el papel de aluminio con el extremo romo de la jeringa
Agregar 0,1mL de la muestra con la jeringa con puntero estéril
Llevar a baño de agua (64ºC durante 3hs).
Realizar la lectura
Metodología:
Control negativo:
Leche en polvo descremada reconstituida, esterilizada en autoclave
Control positivo:
Preparar un control con penicilina concentración 0.006UI/ml
Lectura:
Negativo:
Amarillo (ausencia de sust inhibidoras), hubo acidificación del
medio por crecimiento microbiano
Positivo:
Púrpura, presencia de sust. inhibidoras (no
hubo crecimiento microbiano)
Dos presentaciones
Ampollas
Placas
ANTIBIÓTICO
Concentración mínima
detectable, (Color púrpura)
Penicilina
0.004 (UI/ml)
Cloxacilina
0.025 (mcg/ml)
Ampicilina
0.003 (mcg/ml)
Tetraciclina
0.20 (mcg/ml)
Oxitetraciclina
0.30 (mcg/ml)
Métodos Enzimáticos
• Penzyme III
• SNAP
Principio
Método enzimático y colorimétrico
Precisa poca infraestructura
Rápido (20 minutos)
Detecta exclusivamente antibióticos del grupo ß-lactámicos
(Penicilina, Ampicilina)
Enzima (DD-carboxipeptidasa), efecto residual será menor
cuanto mayor cantidad de antibiótico tenga la muestra
Principio
Principio
• Inmunoensayo diseñado para detectar la presencia de diferentes
antibióticos
• Si el atb esta presente en la muestra se unirá a los anticuerpos
de la prueba
• Espectro de detección: Betalactamicos
Tetraciclinas
Gentamicinas
Sulfamentazina
Metodología
• Cargar la muestra de leche (450µl ± 50µl)
• Agregue al tubo y mezcle
• Incube el tubo y el SNAP a 45ºC, tiempo según lo que se quiera
detectar.
Betalactamicos (5 min)
Tetraciclinas (5 min)
Gentamicinas (2 min)
Sulfamentazina (2 min)
Metodología
Metodología
• Adicione la muestra en la celda
• Cuando la muestra alcance el círculo de activación y el color
comience a desaparecer presione el activador
• Incube el SNAP para:
Betalactamicos (4 min)
Tetraciclinas (4min)
Gentamicinas (7 min)
Sulfamentazina (7 min)
Resultados
Negativo:
El circulo de la muestra es mas oscuro o igual que el Control
RECEPTOR SE UNE A LA BANDA (porque no hay atb)
Control
Control
-
Resultados
Positivo:
El circulo de la muestra es mas claro que el Control
RECEPTOR (sustrato) SE UNA AL ANTIBIOTICO
Control
+
Resultados
Resultados
Resultados
Sensibilidad
Antibiótico
ppb
Penicilina
Ampicilina
Amoxicilina
Cloxacilina
Ceftiofur
Cephapirina
3
6
6
30
6
2
Ventajas
• Fácil de usar (3 pasos, lectura clara)
• Rápido (resultado en menos de 10 minutos)
• No necesita mezclar reactivos
• Mínima capacitación requerida
• Confiable: sensitivo, no hay riesgo de contaminación
• Control incorporado en cada prueba
Ensayos de
(receptores)
sustitución
y
competencia
• CHARM I y II (14C y tritio, H3)
• Parallux (sust. fluorecentes)
Principio
Utiliza la especificidad de los sitios de fijación de cada
antibiótico (atb) para unirse a ciertas proteínas.
El atb “problema” competirá con un atb “marcado” por el sitio
de fijación
Los marcadores en general son enzimas, que frente al sustrato
adecuado, producen desarrollo de color. (visualmente o con
espectrofotómetro)
CHARM (I y II) los marcadores son Carbono 14 (14C) o Tritio (H3)
Ventaja: Rapidez con que se realiza (10 a 15 minutos)
Desventaja: Espectro reducido de detección. (CHARM I). Solo
grupo de ß-lactamicos (Penicilina, Ceftiofur, Cloxacilina,
Amoxicilina, Ampicilina, Cephapirina)
CHARM II (modificación del CHARM I): Mayor espectro de
acción.
Niveles de detección de antibióticos (ppb) (mg/l)
GRUPO
PEN
AMP
AMX
CLX
CEFT
DHI
OXI
SULFA
CHARM
II
4.8
8
10
40
4.5
50
19
10
Adaptado y modificado de González, O.
(2000)
Niveles de detección de antibióticos (ppb) (mg/l)
0
