Bioluminiscencia DH

Bioluminicencia
Facultad de veterinaria
Departamento de Ciencia y Tecnología de la Leche
Montevideo-Uruguay
abril 2015
Dr. MSc. Darío J. Hirigoyen
Temas a desarrollar
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Introducción
HACCP
ATP Bioluminiscencia
Principio de funcionamiento
Tecnología por ATP vs análisis microbiológico tradicional.
Identificación de sitios de muestreo adecuados /Puntos Críticos de
Control (CCP)
7. Validación y monitoreo de un programa de limpieza.
8. Conclusiones.
9. Bibliografía
Introducción
• La mayoría de las grandes empresas elaboradoras de
alimentos, mantienen un sistema de aseguramiento e
inocuidad de los productos que producen y comercializan.
(Felman et al, 2001).
• Los sistemas para la detección de microorganismos son
esenciales para los programas de HACCP (Trudil et al,
2000). Además de mantener el aseguramiento e
inocuidad es muy importante la higienización y
sanitizaciónon de las superficies en contacto con el
alimento, para lo cual se han establecido procedimientos
operativos estandarizados de saneamientos (POES), que
son protocolos que deben ser cumplidos en su totalidad
(Felman et al, 2001).
¿En que principios se basa el sistema HACCP?
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Principio 1: Realizar un análisis de peligros.
Principio 2: Determinar los puntos de control críticos (PCC).
Principio 3: Establecer un límite o límites críticos.
Principio 4: Establecer un sistema de vigilancia o monitoreo de los PCC.
Principio 5: Establecer las medidas correctivas que se adoptaran cuando la
vigilancia indica que un determinado PCC no está controlado.
Principio 6: Establecer procedimientos de verificación o comprobación para
confirmar que el Sistema HACCP funciona eficazmente.
Principio 7: Establecer un sistema de documentación sobre todos los
procedimientos y los registros apropiados para estos principios y su aplicación.
Es el método mas eficaz para maximizar la seguridad de los alimentos.
Localiza los recursos en las áreas criticas del proceso reduciendo el riesgo de
producir alimentos peligrosos.
Brinda una respuesta inmediata ante una situación de peligro.
Doce reflexiones sobre el HACCP
• 1. El HACCP no es mágico.
• 2. El HACCP debe ser amigable.
• 3. El mejor HACCP siempre es original, nunca es copia.
• 4. En el HACCP el asesor externo puede ser vigía del faro, pero no
capitán del barco.
• 5. El HACCP es como el futbol, se practica en equipo.
• 6. Si el HACCP fuera un edificio, las BPM son sus cimientos.
• 7. Si el HACCP no se documentó, nunca existió.
• 8. En el HACCP no basta con involucrarse hay que comprometerse.
• 9. El HACCP no es un plazo fijo.
• 10. En el HACCP hay que hacer como Sherlock Holmes : preguntar
mucho y sospechar de todo.
• 11. En el HACCP lo que abunda, puede dañar.
•12. El HACCP no está esculpido en mármol .
Bioluminiscencia
La bioluminiscencia es una forma de medición cuantitativa
rápida de los residuos orgánicos sobre una superficie,
mediante la cuantificación de cantidad de ATP (adenosin trifosfato) expresada en URL (unidades relativas de luz)
correspondiente a una emisión luminosa directamente
proporcional a la cantidad de ATP presente en la superficie.
• La ATP Bioluminiscencia es un método basado en
una reacción natural del complejo enzimático liciferinluciferasa que usa la energía del ATP, tranformando la
luciferina en oxiluciferina, resultando de esto la
producción de luz (URL) o unidades relativas de luz
(Felman et al, 2001).
Bioluminiscencia
El ATP esta presente en todos los organismos vivos, material
orgánico/alimentos, libre en el ambiente, etc, por lo que puede haber
circunstancias en las que la prueba de ATP, genera un resultado en URL y
la prueba microbiológica no genera ningún crecimiento. Esto indica la
presencia de ATP que es de origen no microbiano o que puede ser de un
organismo no viable o vivo, pero que todavía es una fuente potencial de
contaminación y debe ser removido. (Davenport et al, Felman et al, 2001,
Griffiths, 1993, Ramsay, 2002).
La prueba tiene un límite de detección en la cantidad de ATP que puede
detectar.
La capacidad de detección cambia dependiendo de la fuente y de la
concentración de ATP. Diferentes cepas de bacterias contienen diferentes
cantidades de ATP, basado en la fase de crecimiento en que se encuentran,
ciertas esporas pueden no tener ATP detectable, y células muertas (no
viables) pueden contener ATP detectable por un periodo de tiempo antes de
que este ATP se disipe.
• La principal fuente de contaminación bacteriana son las
superficies que están en contacto con la leche, como el
equipo de ordeño, equipo de refrigeración y cisterna de
transporte (Paéz and Taverna, 1999).
• Las plantas lecheras premian el buen manejo de los dos
primeros puntos anteriores, ya que realizan un recuento
bacteriano total en placa (UFC/ml), dos veces al mes y
que son el fiel reflejo de el manejo predial en cuanto
higiene del ordeño, higiene del equipo de ordeño y
tanque de refrigeración).
A pesar de existir una variedad de métodos
utilizados para evaluar la eficacia de la limpieza,
aún no existen estándares ni pautas que
provean una definición de lo que constituye una
superficie ambiental limpia.
Superficies aparentemente limpias a la vista, aún
pueden albergar niveles significativamente altos
de contaminación.
• De las tecnologias emergentes para deteccion
microbiológica rápida la “ATP-Bioluminiscencia” ha sido
una de las técnicas rápidas más eficientes. Se le da
múltiples usos en la industria láctea y sectores
alimenticios en general (Samkutty et al, 2001).
• La técnica de ATP-bioluminiscencia permite evaluar en
forma inmediata la limpieza de las superficies en contacto
con los alimentos. Esta característica justifica su utilidad y
aplicación en programas HACCP (Paéz y Taverna, 1999).
• La Cantidad de URL nos indican los niveles de
microorganismos y/o materia orgánica presente,
expresada como log10 de URL, mediante el uso de un
instrumento llamado luminómetro (Davenport et al,
Felman et al, 2001, Griffiths, 1993, Ramsay, 2002).
• Una superficie en contacto con alimentos no debe
generar reacción de luminiscencia (Murphy et al, 1998).
• Las nuevas técnicas han tenido un gran uso en el
sector lechero. Dos áreas distintas de bioluminiscencia
están en uso en el sector lechero: la ATPBioluminiscencia orgánica y la ATP-Bioluminiscencia
bacteriana. (Griffiths, 1993).
•
En relación con la concentración de células somáticas en la leche,
algunos investigadores sugieren que esta técnica se puede utilizar
como índice de infección de la glándula mamaria (Griffiths, 1993;
Ukuku et al, 2001).
•
La técnica del ATP se realiza para evaluar la higiene mediante
hisopados en las superficies a controlar. La cantidad del ATP
recuperado en el hisopo depende de la contaminación microbiana y
de la presencia de residuos orgánicos. La interpretación de los
resultados se realiza comparando los valores suministrados por el
luminómetro con los niveles umbrales o límites de URL que
diferencian las superficies limpias de sucias. Estos valores límites
varian según el tipo de materia (superficie), el tipo de procesado, el
tipo de células predominantes, el grado de procesamiento de la
materia prima, etc. Por lo tanto, resulta importante establecer los
umbrales de aceptación de acuerdo con cada caso en particular
(Paez y Taverna, 1999).
Identificación de sitios de muestreo
adecuados /Puntos Críticos de Control (CCP)
•
Es difícil recomendar sitios específicos para toma de muestras dentro de
una planta procesadora de alimentos. Cada planta, pieza de equipo, etc.,
es única en el tipo de producto que es procesado, como es operada,
como/cuando es limpiada y el ambiente en el que opera.
•
Un buen lugar para tomar muestras de ATP será similar a los
identificados como Puntos Críticos de Control en el plan de HACCP. Este
lugar de toma de muestras de ATP brindara información valiosa de la
limpieza y desinfección apropiada de esa pieza particular de equipo o
superficie. Tener presente que los sitios de muestreo en equipos que son
limpiados CIP, pueden tener ciertas áreas (patas, válvulas de llenado,
etc) que son difíciles de limpiar por procesos automatizados y que
pueden requerir limpieza mecánica.
Entendiendo el proceso de limpieza
• a) ¿De que tipo de material es el sitio donde se tomaran las
muestras de ATP (acero inoxidable, plástico, caucho, teflón, etc.)?
• b) ¿Qué tan frecuente es limpiado? ¿Cada noche?
¿Semanalmente? ¿Entre turnos? ¿Al cambiar productos?
• c) ¿Cómo es limpiado? ¿CIP? ¿COP? ¿Limpiado manualmente?
• d) ¿Qué químicos son usados en el proceso de limpieza?
¿Limpiadores ácidos? ¿Limpiadores alcalinos? ¿Detergentes?
• e) ¿Es la superficie enjuagada con agua después de limpieza?
• f) ¿Se esta aplicando algún desinfectante al sitio donde se
tomaran las muestras de ATP? De ser así, que tipo? ¿En que
momento?
• g) ¿Es el sitio/equipo donde se están tomando las muestras de
ATP usado para mas de un tipo de producto (leche, jugo, etc)?
• h) Que químicos y em que concentración se utilizan.
Correlacionando con pruebas microbiológicas
•
Correr ambas pruebas PocketSwab Plus y pruebas microbiológicas durante
varios ciclos de limpieza para generar datos y correlacionarlos. Una
recomendación seria correr las pruebas por lo menos por dos semanas o 5
ciclos de limpieza. Debe de generarse por lo menos un mínimo de 6 resultados
(durante diferentes ciclos de limpieza) por sitio de muestreo de ATP, con el
correspondiente resultado microbiológico.
Entendiendo el proceso de limpieza
• La mayor cantidad de pruebas realizadas en los sitios
asignados asegurara que se están obteniendo las mejores
prácticas de limpieza posibles.
• Deben mantenerse archivos que muestren la relación entre
ufc y URL para justificar los límites previamente
determinados de pass/fail.
Niveles de aceptación/rechazo
•“¿Cuál es la definición de limpio?”.
•“¿Cuál es el valor de URL recomendado de aceptacion/rechazo?”
Griffith et ál., propusieron inicialmente 500 URL como el valor de aceptación/
rechazo en un estudio publicado en el Journal of Hospital Infections
que utilizó el Sistema Clean-Trace.
El valor de 500 URL se obtuvo al evaluar las superficies luego de limpiar y
desinfectar siguiendo las mejores prácticas en 29 salas. Observaron un valor
de la media de ATP de 266 URL, con recuentos de bacterias aerobias,
stafilococos y enterobacterias, de menos de 2,5 ufc/cm2 (determinado en
cultivos).
Niveles de aceptacion/rechazo
Un valor de URL adecuado de “aceptación” depende de un número de factores,
tales como:
•El método de limpieza utilizado para limpiar superficies.
•La antigüedad y las condiciones de la superficie que se evalúa. Por ejemplo,
una superficie lisa y nueva dará como resultado un valor de URL más
bajo que una superficie más antigua, rayada y marcada.
•La naturaleza de la superficie que se evalúa. Por ejemplo, superficies de
acero inoxidable son más sencillas de limpiar en comparación con las de
plástico y, por consiguiente, deben dar como resultado valores menores de
URL luego de la limpieza.
Bioluminiscencia
Las mejoras en la eficacia de la limpieza mediante el uso del
Sistema Bioluminiscente son un proceso iterativo, donde los
valores de estudios comparativos de aceptación/rechazo en
URL se reducen a medida que las prácticas de limpieza
mejoran.
Se debe controlar el desempeño diario de la limpieza, evaluar
nuevos protocolos de limpieza, guiar esfuerzos de mejora
continua y también brindar retroalimentación sobre la eficacia
de la capacitación.
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Muestras de superficies: Hisopos
CLEAN-TRACE®
• El hisopo viene previamente humedecido con un
agente catiónico cuya función es liberar el ATP de las
células.
Ventajas de la técnica ATP
Bioluminiscencia
Ventajas:
• Rapidez en la obtención de los resultados: lectura en 11
segundos. (cultivo 72hrs)
• Instrumental de fácil manejo: equipos portátiles.
• Técnica sencilla: hisopado de superficies.
• Resultados estimulantes: la implementación como
monitoreo de las condiciones higiénicas motiva al
personal encargado de las tareas de limpieza.
• Prevención de fallas mayores: permite llevar a cabo
acciones correctivas.
• Elevada sensibilidad: detección de muy bajos niveles de
ATP.
Desventajas de la técnica ATP
Bioluminiscencia
Desventajas:
• Costo elevado de los equipos.
• Resultados se muestran en una escala arbitraria
poco aceptada por microbiólogos.
• No indica presencia de patógenos sólo la presencia
de ATP.
• Los compuestos químicos tales como detergentes y
desinfectantes pueden interferir en la reacción.
(Felman et al, 2001).
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Procedimiento
• La cantidad de contaminación determinada por los
métodos de ATP y recuento de placas es cerca del 80%
de las muestras. Más superficies fueron identificadas
como sucias por la prueba del ATP que por el recuento
de placas (Griffiths, 1993).
• El luminómetro transforma directamente el resultado
de URL en logaritmo decimal, valor que
posteriormente se asocia con una escala, la cual está
dividida en zonas de limpieza correspondiendo los
valores < a 2,5 a limpio, >2,5 y < a 3 a alerta y > a 3
sucio.
• El proceso de Higienización y sanitización de un equipo
de ordeña incluye un enjuague inicial para eliminar los
restos de leche, un lavado con los productos químicos
(alcalinos y ácidos) y un enjuague final para arrastrar los
restos de estos productos (protocolo de higienización,
aseo CIP).
•
Una de las dificultades para mantener un buen nivel de
calidad de leche es la ausencia de una metodología
rápida que permita establecer objetivamente la eficiencia
con la cual el personal está realizando las tareas de
lavado del equipo de ordeño y refrigeración.
Resultados
• En un estudio realizado en 58 lechería se
obtuvieron los siguientes resultados:
MEDIA
Muestreo
Tanque
332.5 URL
Muestreo
Unidad Final
458.6 URL
• Comparando los datos del muestreo con las
medias bacteriológicas de cada ganadero, los
resultados fueron los siguientes.
Bacteriología URL TANQUE URL UNIDAD
x 1000
< 30
153.2
116.2
<50
262.7
160.7
>50
508.2
988.5
• Se considera como limite para rechazo un valor
< 400 URL, resultados entre 200 y 399 URL
indican precaución (aseo deficiente), <200
significa limpio y <100 muy limpio.
Bibliografia
Lewis, T, et ál., 2008. A modified ATP benchmark for evaluation the cleaning of some hospital environmental
surfaces. (Un estudio comparativo de ATP modificado para evaluar la limpieza de algunas superficies
ambientales de hospitales). Journal of Hospital Infection. 69:156–168.
Barrichello, A.; Allil, M.C.A. Bioluminescência: uma nova ferramenta para tornar o controle microbiológico mais
rápido, fácil e preciso. Rev. Inst. Lat. Cândido Tostes, 52, 71-79, 1997.
Biotrace. BIOTRACE Xcel. [S.I]. 2000. (Manual técnico, 140p). 6. Colquhoun, K.O.; Timms, S.; Fricker, C.R. A
simple method for the comparison of commercially available ATP hygiene-monitoring systems. J. Food Protec.,
61, 499-501, 1998.
Green, T.A.; Russel, S.M.; Fletcher, D.L. Effect of chemical cleaning agents and commercial sanitizers on ATP
bioluminescence
measurements. J. Food Protec., 62, 86-90, 1999.
Griffith, C. Improving surface sampling and detection of contamination. In: Lelieveld, H.L.; M. Mosterte, A.;
Holah, J.
Handbook of hygiene control in the food industry. Woodhead Publishing, Cambridge, England, 2005, chapter
36, p.588-618.
Tydrich, L. New applications for ATP bioluminescence methods. Cereal Foods World. 41(6), 463-465, 1996.
Velazquez, M.; Feirtag, J.M. Quenching and enhancement effects of ATP extractants, cleansers, and sanitizers
on the detection of the ATP bioluminescence signal. J. Food Protec., 60, 799-803, 1997.