Laboratorio N5

Microbiología General - 2011
Facultad de Ciencias Exactas - UNLP
LABORATORIO 5
Caracterización fenotípica de microorganismos: pruebas bioquímicas
Fermentación de los hidratos de carbono
Para estudiar la capacidad de un microorganismo de fermentar una determinada
sustancia se utiliza un medio base al cual se le agrega el sustrato filtrado. La concentración
final del sustrato es de 0,5- 1%.
El medio posee además un indicador de pH como por ejemplo azul de bromotimol y una
campana de Durham (para detectar producción de gas).
En caso que el microorganismo sea capaz de fermentar el sustrato en estudio se observará
viraje del indicador hacia el color ácido, para el azul de bromotimol será amarillo. La
producción de gas se evidenciará a través de la formación de una burbuja en la
campanita de Durham.
Medio de cultivo
Extracto de carne
Peptona
Sc. Azul de Br Timol (16%)
Hidrato de carbono
pH final: 7
3 g/l
5 g/l
1 ml
5 g/l
Lecitinasa
En esta prueba se investiga la presencia de lecitinasa (un factor de virulencia) que actúa
sobre la lecitina (fosfatidil colina) de la membrana citoplasmática. Para la prueba se utilizan
medios sólidos a los cuales se les agrega yema de huevo (que contiene lecitina). Las
colonias con actividad lecitinásica formarán un halo opaco a su alrededor.
Para el caso de Bacillus cereus, se utilizará el medio de Mossel al cual se le habrá agregado
una suspensión de yema de huevo al 50% en NaCl 0,85%, a razón de 1ml de suspensión por
cada 9 ml de medio.
Hemólisis
Esta prueba está relacionada con la presencia de factores de virulencia llamados citolisinas
que son capaces de formar poros en la membrana citoplasmática de diferentes células
eucarióticas. Un sistema indicador adecuado lo constituyen los glóbulos rojos ya que la lisis
de éstos (hemólisis) es fácilmente demostrable. Para la realización de la prueba, se
incorpora sangre de oveja o carnero al 5% en un medio nutritivo sólido estéril, fundido y
templado (55º C aproximadamente). Las placas se secan a 37ºC y se siembra el
microorganismo en estudio.
Interpretación:
a)
 hemólisis: destrucción parcial de los glóbulos rojos acompañada por una coloración
verdosa o parduzca.
b)
 hemólisis: destrucción total de los glóbulos rojos que se observa como una zona
transparente alrededor de la colonia.
c)
 ausencia de hemólisis: no hay cambios visibles.
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Triple azúcar hierro- Agar TSI
Este medio permite determinar la capacidad de un microorganismo de degradar un
hidrato de carbono específico incorporado a un medio básico con o sin producción de gas
y de ácido sulfhídrico (SH2). El medio contiene tres azúcares: lactosa (1%), sacarosa (1%) y
glucosa (0.1%) en una relación de 10:10:1 g/ litro, respectivamente.
La degradación del azúcar con formación de productos ácidos se manifiesta por un
cambio de color del indicador (rojo de fenol) que vira del naranja al amarillo o al rojo en
caso de alcalinización. El tiosulfato es reducido a SH2 que reacciona con la sal férrica
produciendo S3Fe2 color negro.
Medio de cultivo
(Composición g/l)
Peptona de caseína
Peptona de carne
Extracto de levadura
NaCl
Lactosa
Sacarosa
Glucosa
Citrato férrico y amonio
Tiosulfato de sodio
Rojo fenol
Agar
15
5
3
5
10
10
1
0,3
0,3
0,024
12
pH final 7,4
El medio se envasa de forma tal que la zona inferior sea recta y la superior en pico de
flauta.
Los monosacáridos en el pico de flauta son catabolizados por la vía de la glicólisis hasta
ácido pirúvico y posteriormente es degradado por medio del ciclo de Krebs para dar CO 2,
H2O y energía. La regeneración del NAD+ se realiza mediante la cadena respiratoria con O2
como último aceptor de electrones.
En la zona recta del medio de cultivo, que posee baja concentración de O2, los
monosacáridos también son metabolizados por la vía de la glicólisis hasta ácido pirúvico
pero luego son convertidos en diversos productos finales estables como ácido láctico y/u
otros ácidos orgánicos, aldehídos, alcoholes, CO2, H2 y energía.
Para una correcta interpretación de esta prueba es muy importante realizar la lectura luego
de 18 a 24 hs. Lecturas prematuras o demoradas podrán conducir a interpretaciones
erróneas.
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Interpretación:
Luego de la incubación pueden observarse:
Lectura (pico de flauta/profundidad)
Alcalino/Acido,
rojo/amarillo
con
Acido/Acido,
con
amarillo/amarillo
o
o
Interpretación
sin
gas1
ó Fermenta la glucosa
sin
gas
o Fermenta
(sacarosa2)
Alcalino/Alcalino o sin cambio o rojo/rojo
glucosa
No fermentan
(sacarosa)
glucosa
y
lactosa
ni
lactosa
1La
producción de gas provoca un desplazamiento del medio del fondo del tubo o
agrietamiento del medio.
2La incorporación de sacarosa permite el reconocimiento del género Proteus. Estos
microorganismos no utilizan lactosa o lo hacen lentamente pero si pueden fermentar la
sacarosa.
La producción de SH2 se evidencia por un ennegrecimiento del medio.
Prueba del Rojo de metilo
Esta prueba permite comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y
mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa y
vencer la capacidad amortiguadora del sistema.
Se cultiva el microorganismo en estudio en el medio de Clark y Lubs, y se incuba a 37ºC
durante 24 hs.
Medio de Clark y Lubs
(Composición en g/l)
Polipeptona
Glucosa
Fosfato dipotásico
A.D. c.s.p.
7
5
5
1000ml
pH final 6,9
Para obtener un resultado válido deberá realizarse una primera lectura a las 24 hs y una
segunda luego de 2 a 5 días de incubación a 37ºC.
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Revelado:
Sobre una alícuota del medio desarrollado agregar unas gotas de indicador Rojo de Metilo.
Interpretación:
El rojo de metilo conserva su color rojo a valores bajos de pH ( 4,2) indicando que se han
producido ácidos estables capaces de vencer la capacidad buffer del medio. Si el
indicador vira al amarillo la prueba de RM es negativa (pH 6).
Prueba de Voges-Proskauer
Esta prueba permite determinar la capacidad de algunos microorganismos de producir un
compuesto neutro, el acetilmetilcarbinol, a partir de la fermentación de la glucosa.
La reacción de VP se basa en la detección del acetilmetilcarbinol (acetoína). En presencia
de O2 (atm) y álcali los productos finales neutros acetoína y 2,3-butanodiol son oxidados a
diacetilo, que es el reactante para el color producido en la reacción. El diacetilo reacciona
con el núcleo guanidinio de la arginina presente en la peptona, en medio alcalino, dando
un color rojizo en la superficie del medio.
La velocidad de desarrollo de color depende de la concentración de acetoína, por lo
general el color se produce de los 2 a 5 minutos, obteniéndose la máxima intensidad de
color luego de una hora.
El medio de cultivo utilizado es el de Clark y Lubs, el cual se siembra y se incuba a 37ºC
durante 24 hs.
Revelado:
Primero: Sobre una alícuota del medio desarrollado agregar 6gotas de una solución
alcohólica de -naftol al 5% (actúa como catalizador en la oxidación de la acetoína a
diacetilo). Debe adicionarse antes del álcali.
Segundo: Luego se agregan 2 gotas de una solución de KOH o NaOH al 40%. Se agita el
tubo suavemente favoreciendo la oxidación de la acetoína por el O2 atmosférico.
Interpretación:
Reacción positiva: la aparición de color rojo-rubí en la superficie del medio indica la
presencia de acetoína.
Reacción negativa: color amarillo o cobrizo, corresponde al color de los reactivos.
Prueba del Indol
Permite determinar la capacidad de un microorganismo de degradar el aminoácido
triptofano dando indol.
En el proceso de degradación del aminoácido triptofano intervienen diversas enzimas que
reciben el nombre de triptofanasas. Estas enzimas catalizan la reacción de desaminación,
atacando la molécula de Trp en su cadena lateral y dejando intacto el anillo aromático en
la forma de indol.
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Triptofanasa
+ NH3 + CH3−CO−COOH
Indol
L-Trp
Medio de cultivo: caldo triptona.
(Composición g/l)
Ac. pirúvico
Extracto de carne
Peptona
Triptona
A.D. c.s.p.
3
5
20
1000ml
pH final 7
Se siembra un tubo de caldo e incuba a 37ºC durante 24hs.
Revelado:
Se utiliza el reactivo de Kovacs: p-dimetilaminobenzaldehído en alcohol amílico y HCl.
Agregar al tubo desarrollado 5 gotas y agitar.
Interpretación:
La aparición de color rojo en la capa alcohólica se debe a la formación de un compuesto
de condensación entre el p-dimetilaminobenzaldehído y el indol.
Prueba de oxidación-fermentación
Permite determinar el metabolismo oxidativo o fermentativo de un microorganismo sobre un
determinado hidrato de carbono
La fermentación es un proceso metabólico que no requiere O2. Se caracteriza por la
fosforilación inicial del hidrato de carbono (glucosa-6-fosfato) y requiere de un compuesto
orgánico como aceptor final de electrones.
Los procesos oxidativos son estrictamente aeróbicos. El proceso de oxidación directa del
hidrato de carbono, que se da en el grupo fluorescente del género Pseudomonas, no
requiere de la fosforilación inicial del azúcar. La glucosa se oxida a ácido glucónico o 2cetoglucónico y posteriormente se fosforila y degrada a ácido pirúvico.
Medio de cultivo
(Composición en g/l)
OF
Peptona
2
NaCl
5
K2HPO4
0,3
Azul de bromotimol 0,03
Agar
3
A. D. c.s.p.
1000 ml
(base)
pH final 7,1
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Luego de esterilizar y enfriar a temperatura ambiente el media base, se le añade solución
del azúcar en agua destilada estéril para obtener una concentración final de 1%.
El medio utilizado es un agar semi-blando, que permite evidenciar movilidad y reducir la
difusión y dilución de los ácidos permitiendo su detección aun en pequeñas cantidades ya
que posee una muy limitada capacidad buffer.
A partir del cultivo puro de 24 hs se inoculan con ansa recta dos tubos del medio OF.
Un tubo se inocula directamente ("Tubo con O2"). El segundo tubo es purgado previamente
para eliminar el O2 mediante el calentamiento a Baño de María durante 15 minutos. Luego
se enfría bajo canilla sin agitar y se siembra por punción. Inmediatamente se cubre con 1
cm de parafina o vaselina líquida estéril ("Tubo sin O2").
Ambos tubos se incuban a 35ºC durante 48 hs. Algunos microorganismos requieren hasta 2
semanas de incubación.
Interpretación:
Tipo de metabolismo
"Tubo abierto"
"Tubo cerrado"
Oxidativo
Acidez (amarillo)*
Neutro (verde)
Fermentativo
Acidez (amarillo)
Acidez (amarillo)
Fermentativo
Neutro (verde)
Acidez (amarillo)
Inerte**
Neutro (verde)
Neutro (verde)
* Como se produce una pequeña cantidad de ácido, suele aparecer amarillo solo la
superficie del agar
** El microorganismo no metaboliza el carbohidrato o no es capaz de crecer en este
medio
Prueba de la enzima citocromo oxidasa.
Esta prueba permite determinar la presencia de la enzima citocromo c oxidasa presente,
entre otras, en los géneros Pseudomonas y Aeromonas, y nos permite diferenciarlas del
grupo oxidasa negativa de la familia Enterobacteriaceae.
Esta enzima actúa, en presencia de oxígeno, activando la oxidación del citocromo
"reducido" de la cadena transportadora de electrones.
Citocromo reducido.
O2
oxidasa
Citocromo oxidado
H2O
Un sustrato artificial (reactivo) puede sustituir al dador natural (citocromo reducido) dentro
de la cadena transportadora.
Existen varios reactivos que pueden actuar como dadores artificiales de electrones:
indofenol, p-fenilendiamina, como ejemplo. Estos reactivos al ser oxidados dan un producto
coloreado en forma inmediata, indicando la presencia de la enzima.
Reactivo reducido
O2
oxidasa
Reactivo oxidado
H2O
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Para la realización de la prueba se utilizan discos de papel que contienen el reactivo (la
naturaleza del reactivo varía con los distintos sistemas comerciales pero se trata de
derivados de la p-fenilendiamina).
Se prepara una suspensión densa del microorganismo en 0,2 ml de agua (destilada o
corriente).
Colocar el disco en contacto con la suspensión, la aparición de color rosado en menos de 1
minuto indica Oxidasa Positivo.
Prueba de reducción de Nitratos
Las bacterias pueden utilizar nitratos por asimilación (reducción del nitrato a amoníaco que
se utiliza como fuente de nitrógeno), desasimilación (cuando se utiliza como aceptor final
en ausencia de oxígeno, reduciéndose a nitrito) y desnitrificación (cuando se convierte en
productos finales gaseosos, como nitrógeno, óxido nitroso u óxido de nitrógeno).
La reducción de los nitratos ocurre generalmente en condiciones de baja tensión de
oxígeno.
Para poner en evidencia la capacidad de reducir el nitrato se emplea el siguiente medio:
Caldo Nitrato
(Composición (g/l))
Extracto de carne
Peptona
NO3K
3
5
1
Se envasa en tubos y se coloca una campanita de Durham. Se siembra con un inóculo
denso y se incuba 24hs. Luego se determina la presencia de N2 , NH3 y NO2- .
Revelado e interpretación:
Presencia de N2: se verifica la presencia de gas en la campanita.
Presencia de NH3: Agregar a una porción del cultivo unas gotas del reactivo de Nessler
(iodomercuriato de potasio). Este reactivo, en presencia de iones amonio se descompone
con formación de ioduro de dimercuriamonio que permite una determinación colorimétrica
de iones amonio. Si se observa un precipitado color ladrillo rápidamente, indica un
resultado positivo.
Presencia de NO2-: Agregar a una porción del cultivo 2 gotas del reactivo Nit-1 (solución
acética de ácido sulfanílico) y luego 2 gotas del reactivo Nit-2 (solución acética de alfa
dimetilnaftilamina).
NO3-
NO2- + ác. Sulfanílico
Sal de diazonio + α –dimetilnaftilamina
rojo)
Sal de diazonio
p sulfurobenceno azo α –naftilamina (color
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La aparición de un color rojo en la superficie indica reacción positiva.
En caso de que esta reacción sea negativa, se puede verificar la presencia del nitrato
propio del medio agregando una pizca de Zn. Dado que el Zn reduce el nitrato a nitrito, si el
nitrato del medio no fue reducido debería aparecer el color rojo confirmando una reacción
negativa. En el caso de que el medio permanezca incoloro, la reacción es positiva
habiéndose metabolizado el nitrato hacia otros productos no detectados con las
reacciones anteriores.
Prueba de licuefacción de la gelatina
Permite determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas del tipo
proteolítico (gelatinasas).
Para poder ingresar a la célula bacteriana las proteínas deben ser primero catabolizadas a
compuestos más pequeños. Las enzimas exocelulares de tipo proteolítico, gelatinasas, son
secretadas por ciertas bacterias para desdoblar las proteínas. El catabolismo puede ser
considerado en dos etapas:
Proteinasas
Proteína + H2O
polipéptidos
Peptidasas
Polipéptidos + H2O
aminoácidos
Medio de cultivo: Gelatina nutritiva
Composición g/l
Extracto de carne 3
Peptona
5
Gelatina
12
Se envasa y esteriliza por Tyndallización. Se siembra por punción. Luego se incuba a 37ºC
durante 24hs a 48 hs. Antes de la lectura se debe enfriar los tubos. Observar la presencia de
desarrollo y licuefacción comparando con un tubo control.
Prueba de la Coagulasa
La coagulasa es capaz de activar específicamente la cascada de coagulación por
activación conformacional (no proteolítica) de la protrombina. Este proceso desencadena
la conversión de fibrinógeno en fibrina lo cual da lugar a la coagulación aún en presencia
de anticoagulantes como el citrato o el oxalato. El resultado es la formación de coágulos o
grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma. Esta prueba se utiliza
para diferenciar microorganismos del género Staphylococcus:
(+) Staphylococcus aureus
(- ) Staphylococcus epidermis
Procedimiento e interpretación:
-Prueba rápida en portaobjetos: se prepara una suspensión bien homogénea del
microorganismo sobre el portaobjetos y se agrega una gota de plasma de conejo. Se
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mezclar suavemente con el ansa y después por rotación. La prueba se considera positiva si
hay aglutinación microscópica.
-Prueba en tubo: en un tubo mezclar 0.5 ml de plasma de conejo y una ansada cargada de
la bacteria a ensayar. Rotar suavemente el tubo sin sacudir. Incubar a 35ºC 2-4 horas y
observar cada 30 minutos.
PRECAUCIÓN: no sacudir el tubo durante la observación, inclínelo suavemente para ver el
coágulo. Si este no es visible al final de las 3 horas, déjelo en la estufa por 24 hs.
La lectura a las 4 horas es fundamental porque puede suceder que las fibrinolisinas de S.
aureus lisen el coágulo luego de 18 horas de incubación y de esta manera se produzca un
test falso negativo.
Prueba positiva: Coágulo completo o coágulo parcial (el coágulo no abarca
completamente la columna del fluido)
Prueba negativa: No hay formación de coágulo, la suspensión permanece homogénea
Presencia de la enzima catalasa
Esta enzima se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas.
Es una hemo-proteína. Uno de sus sustratos es el H2O2 que se forma durante la degradación
de los azúcares. Este compuesto es tóxico si se acumula en la célula. Su descomposición
puede producirse a través de dos enzimas, catalasa y peroxidasa.
La prueba se realiza a partir de un cultivo del microorganismo en caldo nutritivo, agregando
unas gotas de agua oxigenada y observando la formación de burbujas.
Es importante partir de cultivos libres de sangre ya que los glóbulos rojos contienen la
enzima.
Utilización del citrato como única fuente de carbono
Esta prueba se realiza para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato
como única fuente de C y energía.
El citrato puede ser metabolizado mediante la enzima citrato oxalacetato liasa que lo
desdobla en acetato y oxalacetato (Ciclo reductivo de Krebs). Este último es convertido
luego en piruvato, que proporciona así materias primas para la biosíntesis.
Para evaluar la utilización del citrato se utiliza el medio de Simmons que contiene azul de
Bromotimol como indicador de pH, citrato y sales de amonio. Si la bacteria crece, eleva el
pH y hace virar el indicador de verde (pH 6.6) a azul (pH 7.7).
Las bacterias que utilizan el citrato como fuente de C utilizarán el amonio presente en el
medio de cultivo, como fuente de nitrógeno.
Medio de Simmons
(Composición en g/l)
MgSO4
(NH4)H2PO4
K2HPO4
Citrato de Na
NaCl
Agar
Azul de Br timol
0,2
0,1
1
2
5
15
0,08
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Se envasa, esteriliza y deja solidificar en posición inclinada. Se siembra por estrías con ansa
recta. Se incuba durante 24 hs.
La aparición de desarrollo con intenso color azul indica un resultado positivo.
Hidrólisis del DNA
Esta prueba permite demostrar la presencia de la enzima DNAsa producida por los
microorganismos, mediante la hidrólisis del DNA contenido en el medio de cultivo.
Medio de cultivo
(Composición g/l)
Extracto de carne
5
Peptona de caseína 10
Peptona de carne
5
NaCl
5
DNA
2
Agar
15
A partir de un cultivo de 24 hs se siembra en la superficie del medio de cultivo contenido en
placa de Petri, con ansa en anillo en forma puntual (spot) sobre la placa. Se pueden
sembrar varios cultivos en una placa. Incubar durante 24 hs a 37ºC.
Revelado e interpretación:
Se revela cubriendo la placa con una solución de HCl 1N. El HCl provocará la precipitación
del DNA intacto.
Ensayo positivo: se observa una zona clara alrededor del spot que contrasta con la turbidez
del medio (el cultivo produce DNAsa).
Ensayo negativo: ausencia de dicha zona clara.
El medio se puede modificar agregando azul de toluidina o verde de metilo en
concentración de 0.05 gr/lt. El método tiene una ventaja que permite detectar la actividad
de DNasa mediante la transparencia del colorante alrededor de las colonias productoras
de DNasa. NO se agrega ácido y las colonias se pueden recoger directamente de la placa
para estudios posteriores.
Hidrólisis del almidón
Esta prueba pone en evidencia la capacidad del microorganismo del hidrolizar el almidón
presente en el medio de cultivo.
Medio de cultivo
(Composición g/l)
Infusión de carne
hidrolizado de caseína
almidón
Agar
2
17.5
1.5
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Se siembra el microorganismo en la superficie del medio contenido en placa de Petri,
mediante una estría realizada con ansa en anillo. Se lleva a incubar 24 hs a 37ºC.
Revelado e interpretación:
Se revela bañando el desarrollo con una solución I 2-Iodurada (Lugol al 5%).
El medio conteniendo almidón se teñirá de azul, contrastando con el halo incoloro que se
observa alrededor de la estría del cultivo capaz de hidrolizar el almidón.
Prueba de la Ureasa
Es particularmente útil para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
El medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo contenido de nutrientes
y alta capacidad buffer. El extracto de levadura es la única fuente de carbono, nitrógeno,
vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano. Las
sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de pH y la urea
es el sustrato de la enzima ureasa. Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden
utilizar el nitrógeno proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando 2 moléculas de
amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos metabólicos alcalinizan el medio,
haciendo virar el indicador rojo fenol del amarillo al rojo. Su uso, se recomienda para
diferenciar Proteus spp. de otros géneros. Para organismos que hidrolizan la urea
lentamente, es recomendable usar el medio de Christensen.
Medio de cultivo
(Composición g/l)
Urea
Fosfato monopotásico
Fosfato disódico
Extracto de levadura
Rojo fenol
pH final: 6.8 ± 0.2
20
9.1
9.5
0.1
0.01
Incubación
A 35-37 ºC, en aerobiosis. Observar las reacciones a las 8, 12, 24 y 48 horas de incubación.
Para aquellos microorganismos que hidrolizan lentamente la urea, incubar hasta 72 horas. La gran capacidad buffer de este medio de cultivo, puede enmascarar la actividad
ureásica en bacterias que hidrolizan lentamente la urea.
No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone fácilmente.
Producción de pigmentos
Agar F:
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la detección y la diferenciación de especies
de Pseudomonas spp. en base a la producción de fluoresceína. Conocido también como
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medio King B. En el medio de cultivo, la tripteína y la peptona de carne aportan los
nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la producción de
pigmentos, la concentración de fosfatos estimula la producción de fluoresceína e inhibe la
producción de piocianina y piorrubina.
agar F
(composición en g/l)
Tripteína
Peptona de carne
Fosfato dipotásico
Sulfato de magnesio
Agar
pH final: 7.2 ± 0.2
10
10
1.5
1.5
15
Al medio, luego de esterilizado, se le agrega 10 ml de glicerina estéril.
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospeche la presencia de
Pseudomonas spp., tomar una colonia y estriar la superficie del medio. Incubar durante 1824 horas a 35-37ºC, en aerobiosis. Si no se observa crecimiento, reincubar a 25-30ºC, o dejar
a 22 ºC y observar diariamente hasta 7 días.
Interpretación de resultados
Examinar las colonias bajo luz ultravioleta, a 260 nm. Se considera un resultado positivo la
observación de fluoresceína, que es un pigmento de color amarillo, amarillo-verdoso
fluorescente que rodea la colonia o que se extiende por todo el medio de cultivo debido a
fenómenos de difusión.
Limitaciones
Algunas cepas de P. fluorescens y P. putida solo producen fluoresceína a temperatura
ambiente, y se pueden obtener resultados falsos negativos si el medio se incuba a 30-35ºC,
por eso, ante la ausencia de crecimiento luego de incubación a 35-37ºC, se recomienda
dejar los tubos conteniendo el medio de cultivo a temperatura ambiente.
Agar P: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la detección y la diferenciación de
especies de Pseudomonas spp. en base a la producción de piocianina. Conocido también
como medio King A. En el medio de cultivo, la peptona de gelatina aporta los nutrientes
necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la producción de pigmentos,
las sales de magnesio y potasio estimulan la producción de piocianina y piorrubina e
inhiben la producción de fluoresceína.
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agar P
(composición en g/l)
Peptona de gelatina
Sulfato de potasio
Cloruro de magnesio
Agar
pH final: 7.0 ± 0.2
20
10
1.4
15
Al medio, luego de esterilizado, se le agrega 10 ml de glicerina estéril.
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospeche la presencia de
Pseudomonas spp., tomar una colonia y estriar la superficie del medio. Se incuba durante
18-24 horas a 35-37 ºC, en aerobiosis. Si no se observa crecimiento, re-incubar a 25-30 ºC, o
dejar a 22 ºC y observar diariamente hasta 7 días.
Interpretación de resultados
Un resultado positivo se verifica por observación de los pigmentos piocianina y/o piorrubina.
La producción de piocianina se observa como una zona color azul, azul-verdoso que rodea
la colonia, o que se extiende en todo el medio de cultivo debido a la difusión del pigmento.
La producción de piorrubina se observa como una zona de color rojo oscuro-pardo
alrededor de la colonia o que se extiende en todo el medio de cultivo debido a la difusión
del pigmento.
Limitaciones
- La ausencia de piocianina no descarta que el microorganismo aislado sea P. aeruginosa.
- Bajas cantidades de piocianina pueden no ser evidenciadas, por eso, ante la sospecha
de su presencia, se recomienda agregar al medio de cultivo unas gotas de cloroformo,
para exaltar la visualización del pigmento.
- La presencia concomitante de piorrubina y/o piomelanina, puede afectar la visualización
del color característico de la piocianina.
- La producción de pigmento, puede aumentarse dejando los tubos conteniendo medio de
cultivo a 22 ºC luego de haberlos incubado previamente toda la noche a 35-37 ºC.
Medio SIM
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Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de
sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
Fundamento: El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y
particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias para
formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El
indol producido se combina con el aldehído del reactivo de Kovac´s o de Erlich, para
originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este
medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que
aquellas cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un
precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se
mantenga a un pH mayor a 7.2.
Fórmula (en gramos por litro)
Tripteína
20.0
Peptona
6.1
Sulfato de hierro y 0.2
amonio
Tiosulfato de sodio
0.2
Agar
3.5
Instrucciones
Suspender 30 g del polvo por
litro de agua destilada.
Mezclar
hasta
disolver;
calentar agitando y hervir
durante un minuto. Distribuir
unos 4 ml en tubos de
hemólisis
y
esterilizar
en
autoclave a 121°C durante 15
minutos. Solidificar en posición
vertical.
pH final: 7.3 ± 0.2
Siembra: A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción
profunda con aguja de inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el
centro del tubo, y la punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de
cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se realice en línea recta.
Incubación:
Durante
24
horas,
a
35-37
°C,
en
aerobiosis.
Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich.
Resultados:
Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas allá de la línea de
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Microbiología General - 2011
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siembra.
Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el
medio.
Cepas
SH2
negativas:
el
medio
permanece
sin
cambio
de
color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o
de Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.
Limitaciones
-En las bacterias aerobias estrictas, que sólo crecen en superficie, la movilidad puede ser
difícil de observar.
-Algunas bacterias productoras de melanina como M. morganii, pueden dar un color
parduzco, que no debe confundirse con el color negro debido a la producción de
ácido sulfhídrico.
Caldo Mac Conkey.
Medio de cultivo selectivo, utilizado para la investigación presuntiva de microorganismos
coliformes en aguas, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.
Fundamento: En el medio de cultivo, la peptona es la fuente de aminoácidos y de otros
factores de crecimiento, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, la bilis de buey
estimula el crecimiento de las bacterias coliformes e inhibe a gran parte de la flora gram
positiva, y el púrpura de bromocresol es el indicador de pH.
Los coliformes, son microorganismos que fermentan la lactosa, con producción de ácido
y gas. Al acidificar el medio, se produce un viraje del indicador de pH del color púrpura
al amarillo.
Fórmula (en gramos por litro)
Bilis de buey
5.0
Peptona
20.0
Lactosa
10.0
Púrpura de
0.01
bromocresol
Instrucciones
Suspender 35 g de polvo por
litro de agua destilada.
Disolver y distribuir 10 ml por
tubo con campanita de
Durham.
Esterilizar
en
autoclave a 121°C durante 15
minutos.
pH final: 7.3 ± 0.2
Siembra:
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Microbiología General - 2011
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Para recuento de coliformes totales, técnica del Número Mas Probable:
Para el análisis de muestras fluidas como el agua, sembrar por triplicado: 10 ml en caldo
doble concentración y 1ml y 0,1 ml en caldo simple concentración.
Número Volumen Volumen
de tubos de
la de
muestra medio
3
10 ml
10 ml
3
1 ml
10 ml
3
0.1 ml
10 ml
Concentración
del medio
Doble
Simple
Simple
Para muestras sólidas (alimentos, cosméticos, fármacos), efectuar diluciones seriadas 101, 10-2 y 10-3 y sembrar cada dilución por triplicado en medio de cultivo simple
concentración.
Número Dilución
de tubos de
la
muestra
3
10-1
3
10-2
3
10-3
Volumen
de
la
muestra
1 ml
1 ml
1 ml
Volumen
de
medio
10 ml
10 ml
10 ml
Concentración
del medio
Simple
Simple
Simple
Incubación
Incubar los tubos 24-48 horas a 35-37 °C.
Resultados
Se considera resultado positivo el viraje al amarillo del color del medio y la producción
de gas
Expresión de resultados: Para muestras de fluidos expresar el NMP por 100 ml de muestra,
y para muestras sólidas, expresarlo por gramo de producto.
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