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MÁSTER EN CALIDAD, DESARROLLO E INNOVACIÓN DE ALIMENTOS
UNIVERSIDAD DE PALENCIA
TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
TÍTULO:
ENCAPSULACIÓN DE RESVERATROL EN β-GLUCANOS.
A PRODUCTOS NUTRACÉUTICOS
AUTOR:
VIRGINIA GALÁN GUTIÉRREZ
FECHA:
JULIO 2013
APLICACIONES
INDICE
RESUMEN .............................................................................................................................. 1
ABSTRACT............................................................................................................................. 1
1.
ANTECEDENTES .......................................................................................................... 2
2.
OBJETIVOS .................................................................................................................... 6
3.
MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................... 7
3.1.
MATERIALES.......................................................................................................... 7
3.2.
MÉTODOS .............................................................................................................. 7
3.2.1. Precipitación por antisolvente supercrítico (Supercritical Antisolvent,
SAS)………………………………………………………………………………………………………………………………..7
4.
3.2.2.
Determinación de la solubilidad de los β - glucanos .................................... 8
3.2.3.
Determinación del peso molecular de los β -glucanos ................................ 9
3.2.4.
Caracterización del producto.......................................................................... 9
3.2.6.
Actividad antioxidante (ORAC) .................................................................... 10
3.2.7.
Perfiles de liberación controlada de resveratrol ......................................... 10
RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................... 11
4.1.
DETERMINACIÓN DE LA SOLUBILIDAD DE LOS β-GLUCANOS ................ 11
4.2.
PRECIPITACIÓN POR SUPERCRITICAL ANTISOLVENT (SAS) .................. 11
4.3. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y PERFILES DE LIBERACIÓN CONTROLADA
EN FLUIDOS SIMULADOS ............................................................................................. 15
5.
CONCLUSIONES ......................................................................................................... 17
BIBLIOGRAFÍA..................................................................................................................... 18
RESUMEN
El resveratrol es un compuesto natural presente en diversas plantas y
alimentos. Se le atribuyen múltiples efectos protectores frente a algunas
enfermedades, debido a sus propiedades antioxidantes. Sin embargo, su
biodisponibilidad es baja, por ello se buscan técnicas que mejoren su absorción. Este
trabajo pretende encapsular resveratrol en β-glucanos de cebada, para estudiar su
capacidad para disminuir la degradación de éste. El proceso de encapsulación se ha
realizado con el sistema de antidisolvente supercrítico (SAS), basado en el uso de
fluidos supercríticos y DMSO como disolvente. El rango de presión fue 10-11 MPa; y el
de temperatura de 35-50ºC. Otros parámetros como el flujo de CO 2, el de la disolución
o la concentración de los β-glucanos y el resveratrol se variaron en los distintos
ensayos. Además se realizaron pruebas de liberación controlada en fluidos simulados
(gástrico e intestinal) y se determinó su capacidad antioxidante.
ABSTRACT
Resveratrol is a natural compound present in many plants and foods. Multiple
protective effects against diseases are attributed to resveratrol due to its antioxidant
properties. However, its bioavailability is low, therefore different techniques and
encapsulation matrices are being investigated to improve its absorption. This paper
aims to encapsulate resveratrol in barley β-glucans for this purpose. The encapsulation
process was carried out by supercritical carbon dioxide as antisolvent and DMSO as a
solvent for the β-glucans. The pressure range was 10-11 MPa; and the temperature of
35-50 °C. Other parameters such as the flow rate of SC-CO2, and solution or the
concentration of β-glucan and resveratrol were studied. Furthermore, dissolution tests
were conducted in simulated gastric and intestinal fluids and their antioxidant activity
was determined.
1
1. ANTECEDENTES
El resveratrol (3,5,4´-trihidroxiestilbeno) es un compuesto que pertenece a la
familia del estilbeno. Podemos distinguir dos isómeros del resveratrol (Figura 1), uno
cis- y uno trans-. Parece que ambos realizan las mismas funciones, pero
tradicionalmente la forma más estudiada ha sido la trans-, ya que es la forma más
estable. (Amri et al., 2012) (Filip et al., 2003) (Chung- Fu et al., 2013)
Fig-1. Estructura química del trans- y cis-resveratrol.
Se encuentra de forma común en muchas plantas, pero las fuentes
alimentarias son reducidas. Lo encontramos en cacahuetes y derivados, pistachos,
fresas y chocolate negro. Pero su principal fuente de extracción es la uva y el vino
tinto, ya que éste es macerado junto a la semilla y las pepitas que es donde podemos
encontrarlo. (Fernández-Mar et al., 2012)
Entre sus múltiples acciones hay que destacar su actividad antioxidante,
principalmente la eliminación de las especies reactivas del oxígeno (ROS). Se
considera que estas especies son causantes de la peroxidación de los lípidos y el
daño oxidativo en el ADN y el resto de proteínas corporales. (Jing et al., 2012) (LucasAbellán et al., 2011)
Así mismo se han realizado una gran cantidad de estudios que demuestran los
efectos protectores que tiene el resveratrol sobre otros procesos biológicos,
principalmente sobre enfermedades cardiovasculares y/o procesos cancerígenos. La
mayor parte de estos estudios se han desarrollado in-vitro, sin embargo en los
ensayos in-vivo realizados con animales ha sido más difícil demostrar esta relación
protectora. La razón por la que hay discrepancia entre estos resultados puede ser
debido a su baja biodisponibilidad. (Walle, 2011)
Diversos estudios en humanos y animales han demostrado que la
biodisponibilidad del resveratrol no conjugado es baja; siendo la absorción oral en
humanos de aproximadamente el 75%. Así mismo se ha descrito que la forma de
absorción de este compuesto tiene lugar principalmente mediante difusión
transepitelial. A pesar de esto el proceso de metabolismo que tiene lugar en el
intestino y el hígado hace que su biodisponibilidad real sea menor del 1%. La
administración repetida y el aumento de las dosis no han variado de manera
significativa estos resultados. (Walle, 2011)
2
Los metabolitos de resveratrol alcanzan su máxima concentración en plasma a
los 30 minutos después de la ingesta, aproximadamente, y su vida media suele ser de
unas 9 horas. (Fernández-Mar et al., 2012)
Las propiedades de los extractos naturales activos, como es el caso del
resveratrol, se pueden mejorar mediante la formulación adecuada del material
portador. Los principales objetivos a la hora de realizar este tipo de formulación
pueden ser: la protección del compuesto activo, mejorar su dosificación y su
biodisponibilidad y garantizar la funcionalidad del producto. Cuando el compuesto
activo se administra por vial oral se deberá elegir un material que lo proteja frente a la
degradación que sufrirá en el tracto gastrointestinal y además favorezca su absorción.
Entre las sustancias que se utilizan frecuentemente como materiales de transporte de
compuestos activos hay que destacar el almidón, la lecitina, las gomas, el
polietilenglicol o las proteínas. En este caso las sustancias utilizadas serán los βglucanos. (Martín, 2013)
Los β-glucanos son polisacáridos sin almidón compuestos por unidades de
glucosa unidas por enlaces (1 → 3) (1 → 4). Principalmente se encuentran en las
paredes del endospermo de diferentes granos de cereal, en su mayoría en los de
avena y cebada, en concentraciones del 3-7% del peso. (Benito- Román et al., 2011).
También podemos encontrarlos en las paredes de levaduras como la
Sacharomyces cerevisiae [(1→ 3) (1 → 6)-β- D –glucano]. (Vetvicka and Vancikova,
2010)
Estos compuestos pertenecen a un grupo fisiológicamente activo que se
denomina modificadores de la respuesta biológica. Han sido ampliamente estudiados
por sus propiedades saludables. Los β-glucanos con enlaces (1 → 3) (1 → 4)
presentan propiedades como la reducción del colesterol en sangre o los niveles de
glucosa postprandial; mientras que los que presentan enlaces (1 → 3) (1 → 6) son
conocidos por su actividad modificadora de la respuesta inmune. La FDA aprobó una
declaración sobre las propiedades saludables de la fibra de avena y cebada para la
reducción del riesgo de enfermedades cardiovasculares. (Comin et al., 2012)
Existen alegaciones acerca de la capacidad que tienen los β-glucanos con
enlaces (1 → 3) (1 → 4) procedentes de avena para actuar como vehículo de
transporte de determinadas sustancias químicas hacia el interior de la piel a través de
los diferentes estratos hasta las capas más profundas. (Röding, 2006)
La encapsulación del resveratrol en β-glucanos con enlaces (1 → 3) (1 → 6)
podría hacer que este compuesto se libere progresivamente, mejorando así su
absorción y eficacia, ya que aumenta la respuesta endógena de los individuos. Hay
estudios que demuestran que la administración conjunta de algunas moléculas
bioactivas con β-glucanos proporciona efectos sinérgicos, en este caso la mólecula
activa es el resveratrol. (Vetvicka and Vancikova, 2010)
En la literatura reciente encontramos diversos estudios sobre la encapsulación
de resveratrol con la finalidad de mejorar su solubilidad y su biodisponibilidad.
3
Amri et al., (2012) realizaron una revisión sobre las mejores sustancias
encapsulantes y métodos para lograr aumentar la biodisponibilidad del resveratrol.
Estudiaron diversas formulaciones para conseguir la liberación controlada de
resveratrol, entre las que podemos destacar el uso de nanoesponjas de βciclodextrinas, nanocápsulas lipídicas, nanopartículas sólidas de naturaleza lipídica o
el uso de liposomas en distintas formas.
Guorong et al. (2008) realizaron investigaciones sobre la encapsulación de
resveratrol en células cultivadas de S. cerevisiae. El rendimiento de encapsulación de
resveratrol que obtuvieron fue del 6%. Demostraron que tras el proceso de
encapsulación el compuesto no sufría ninguna modificación química. Así mismo los
resultados que obtuvieron demostraban que la solubilidad en agua del resveratrol era
de entre dos y tres veces más alta y que se mejoraba su biodisponibilidad.
Otros compuestos que se han utilizado frecuentemente para la encapsulación
de resveratrol han sido las ciclodextrinas, que son un grupo de oligosacáridos cíclicos
derivados del almidón y cuya estructura tiene forma de cilindro. Las investigaciones
realizadas demuestran que gracias a su encapsulación se consigue aumentar la
concentración total de resveratrol en agua y retrasar su oxidación. (Lucas- Abellán et
al., 2006)
Isailović et al. (2013) realizaron investigaciones sobre diferentes métodos de
encapsulación de resveratrol en liposomas. El método utilizado consistía en preparar
dos tipos de liposomas: unos que contenían resveratrol y otros utilizados como control
que estaban vacíos. Para la realización de los análisis se usaron dos métodos: el
método de la película lipídica delgada (TF) y el método del Ubiquinol (PRO). Para
reducir el tamaño de los liposomas utilizaron una técnica de extrusión y otra de
sonicación. En la mayor parte de los casos consiguieron una eficacia de encapsulación
superior al 90%, excepto en el caso de los liposomas sometidos a sonicación, cuya
eficacia variaba entre el 40 y el 50%. Los resultados que obtuvieron mostraban que los
liposomas eran unos buenos portadores de resveratrol, ya que conseguían obtener
partículas muy estables y con una liberación del compuesto más prolongada.
Zhou et al, 2010 realizaron ensayos de encapsulación de resveratrol en βciclodextrinas utilizando la técnica de SAS. Los resultados que obtuvieron mostraban
que con esta técnica se conseguía aumentar la solubilidad del resveratrol de las 30
ppm (0,03 mg/mL) (Jiang, 2008) hasta 25,13 mg/mL en una solución salina normal.
En este caso la metodología utilizada para realizar el proceso de encapsulación ha
sido el uso de fluidos supercríticos.
Un fluido supercrítico es una sustancia cuyas condiciones de presión y
temperatura son superiores a su punto crítico. Tienen unas características entre las de
los gases y los líquidos, ya que son capaces de disolver sustancias como los líquidos y
de difundir como los gases. Los compuestos más usados en condiciones supercríticas
son el CO2, el agua o el etano. En la Figura 2 podemos ver el diagrama de fases que
determina las condiciones supercríticas del CO2 en las que se llevaron a cabo todos
los ensayos.
4
Fig.2. Diagrama de fases.
En las últimas décadas se ha observado un aumento significativo en el interés por
el estudio de estas técnicas. Las principales áreas de estudio son:
-
Como alternativa a los procesos clásicos de separación, como la extracción, la
cromatografía o la cristalización.
En técnicas de polimerización o despolimerización.
En la producción de partículas, fibras o espumas.
Estas investigaciones han dado lugar a la aparición de una gran variedad de
técnicas, que se diferencian principalmente en el papel que desempeña el fluido
supercrítico o el disolvente orgánico, pudiendo actuar como disolvente, co-disolvente o
anti-disolvente. (Sang-Do and Erdogan, 2005) (Jung and Perrut, 2000)
Las técnicas más importantes de formación de partículas mediante el uso de
fluidos supercríticos se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1
Principales técnicas de formación de partículas con fluidos supercríticos.
Proceso
GAS
PGSS
RESS
SAS
SEDS
Papel de fluido supercrítico
Anti-disolvente
Soluto
Disolvente
Anti-disolvente
Anti-disolvente/ Dispersante
5
Papel de disolvente orgánico
Disolvente
Co-disolvente
Disolvente
Disolvente/ No disolvente
El sistema de antidisolvente supercrítico (SAS) es una técnica de precipitación
que se ha usado frecuentemente para la producción de micro- o nanopartículas, ya
que ofrece un mejor control del tamaño de partícula que los métodos convencionales.
Esta técnica produce la precipitación de la parte sólida de un soluto orgánico, en
general mediante la interacción que se produce entre ésta y un fluido supercrítico que
se suministra de forma continua a una cámara de precipitación de alta presión, gracias
a esto se produce una mayor relación de sobresaturación de la solución, provocando
la nucleación y el crecimiento rápido de las partículas, que adquieren un tamaño más
pequeño. De esta forma permite controlar el tamaño de partícula y su morfología
mediante las variaciones que se introducen en los parámetros asociados, como la
temperatura, la presión de operación y la concentración de la disolución. También
permite eliminar el residuo generado por el disolvente de forma fácil y no requiere un
procesado posterior de la muestra. Entre los materiales que se han procesado
mediante esta técnica podemos destacar productos farmacéuticos, precursores de
catalizadores, pigmentos y polímeros. El tamaño medio de las partículas que se
pueden obtener mediante esta técnica puede ser de entre 50 nm a varios micrómetros.
(Cocero et al., 2008)
2. OBJETIVOS
El objetivo de este estudio era comprobar la viabilidad de la encapsulación de
resveratrol utilizando como soporte β-glucanos de cebada, mediante el uso de fluidos
supercríticos. Con esta técnica se pretendía obtener un producto sólido que facilitara
su dosificación y que permitiera evaluar de forma posterior la eficiencia de su
encapsulación.
Una vez que el resveratrol fuera encapsulado en el interior de los β-glucanos se
estudiaría el efecto controlado de su liberación en medio simulado gástrico e intestinal,
y se analizaría su actividad antioxidante in-vitro.
6
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1.
MATERIALES
Para la realización de todas las pruebas se han usado β-glucanos de cebada con
una pureza del 78% (GLUCAGEL TM, Alkem Laboratories LTD, India) y un peso
molecular de 125 kDa (determinado en el laboratorio mediante cromatografía de
exclusión de tamaños según el método descrito en el apartado 3.2.3), resveratrol con
una pureza del 98% (Pure Bulk, EE.UU) y DMSO (Sigma-Aldrich, España). El CO2,
con una pureza del 99,5%, fue suministrado por S.E. Carburos metálicos S.A.
(España). Para la preparación de los fluidos simulados gástrico e intestinal y para la
prueba de la actividad antioxidante (ORAC) se utilizaron reactivos suministrados por
Panreac.
3.2.
MÉTODOS
3.2.1. Precipitación por antisolvente supercrítico (Supercritical Antisolvent,
SAS)
El aparato de laboratorio SAS que se ha usado en este trabajo consta de una
bomba de HPLC (Gilson, modelo 850) que se utiliza para suministrar la solución
líquida, y una bomba de alta presión (Milton Royal) utilizada para bombear el CO2. La
cámara de precipitación está compuesta por un recipiente cilíndrico con un volumen
interno de 1,5 L. La mezcla líquida se pulveriza en el precipitador a través de una
boquilla de acero inoxidable con un diámetro de 0,180 mm. La presión de operación
está regulada por una válvula manorreductora (GO, BP-66) situada a la salida del
precipitador y en la que se produce la expansión de la mezcla de CO 2 y el disolvente
hasta presión atmosférica. La separación del líquido y el CO2 gas se realiza en un
recipiente de 2 L. Como medidas de seguridad en caso de sobrepresión la instalación
dispone de una válvula de seguridad tarada a 12 MPa y un disco de ruptura tarado a
20 MPa, ambos conectados al recipiente de expansión a baja presión. En la Figura 3
se muestra una representación gráfica de la planta de laboratorio SAS.
7
Etilenglicol
Medidor de flujo
coriolis
Fmáx: 82 kg/h
V-7
Tara: 140 bar
V-9
V-7
CO2
V-1
P-1
PI
FI
V-2
P-1
MD00Q4.8P300
Qmáx: 4,8 L/h
Pmáx: 300 bar
V-8
Tara: 120 bar
V-8
Alimentación
TI
V-3
P-2
PI
Agua baño
Disco de ruptura
Tara: 210 bar
Venteo
V-4
V-6
PI
BP10
BP10
Cv = 0,04
Pmáx = 138 bar
V-5
Disolvente
Fig. 3. Representación gráfica de la planta de laboratorio SAS.
El experimento de SAS comienza con el paso de CO2 supercrítico a la cámara
de precipitación hasta que se alcanza la presión deseada. Posteriormente se fija un
flujo constante. Cuando los parámetros de presión, temperatura y flujo de CO 2 ya son
constantes en los valores deseados, se comienza a bombear la muestra. El
experimento se da por concluido cuando todo el contenido de muestra ha sido
bombeado. Antes de despresurizar la planta se debe pasar una pequeña cantidad de
disolvente, seguido del paso de CO2 a un flujo igual al usado en el ensayo durante al
menos 30 minutos, que sirve para eliminar de la cámara el contenido de disolvente
que haya podido quedar.
Si no se realizara la purga final con CO 2 el disolvente podría condensarse durante
la despresurización y las muestras contenidas en la cámara podrían modificarse.
3.2.2. Determinación de la solubilidad de los β - glucanos
Para la determinación de la solubilidad de los β-glucanos se usaron los siguientes
disolventes: acetato de etilo, acetona, dimetilsulfóxido (DMSO), etanol y
tetrahidrofurano (THF).
Adicionalmente se determinó la solubilidad en agua como referencia, ya que es el
mejor disolvente para estos compuestos. Sin embargo el agua no es adecuado para la
precipitación por SAS, debido a su baja solubilidad en CO2-SC en el rango de
condiciones de operación típicas de este proceso (35-50ºC; 8-15 MPa)
Se tomaron 10 mL de cada uno de los disolventes y 500 mg de β-glucanos. Estas
muestras se introdujeron en viales cerrados y se mantuvieron en agitación a 25ºC
durante 24 horas.
8
Una vez transcurrido este tiempo se tomaron 2 mL de cada uno de ellos y se
filtraron en otro vial (Millipore, 0,45 µm). Las muestras se mantuvieron en una
campana de extracción durante 48 horas. Las muestras que contenían DMSO se
mantuvieron durante 4 días en una estufa a 200ºC y presión atmosférica, y durante 24
horas en una estufa de vacío a una temperatura de 70 ºC y una presión de -0,08 MPa,
debido a su elevada temperatura de evaporación (189ºC). Tras este proceso se
determinó la masa del sólido seco.
Esta operación se realizó por triplicado para cada uno de los disolventes, salvo
para el DMSO que se realizaron un total de 6 muestras.
3.2.3. Determinación del peso molecular de los β -glucanos
La determinación del peso molecular de los β-glucanos se realizó mediante
cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC). Se utilizó un sistema de
cromatografía que consistía en una bomba isocrática (Waters 1515), un inyector
automático (Waters 717), una columna de seguridad (Guard Column Ultrahydrogel
Aguas), una columna de GPC (Waters Ultrahydrogel 1000) y un detector de índice de
refracción diferencial (Waters 410). La columna se mantuvo a 35ºC, y el caudal de la
fase móvil (0.1MNaNO3 0.02% de NaN3) se fijó en 0,6 mL min -1. Los estándares de
peso molecular b-glucano se compraron a Megazyme International Ltd. (Irlanda).
3.2.4. Caracterización del producto
La morfología externa del material precipitado se analizó usando un microscopio
electrónico de barrido (SEM) (JEOL JSM-820) a alto vacío. Antes de realizar el análisis
las muestras fueron recubiertas con oro en atmósfera de argón.
Los perfiles de análisis por calorimetría diferencial se obtuvieron utilizando un
calorímetro diferencial de barrido (DSC) (Mettler-Toledo 822e). La velocidad de
calentamiento fue de 10ºC min -1 en el intervalo de temperatura de -40 a 280ºC bajo
flujo constante de Nitrógeno (60 mL/min). Para el análisis se tomaron muestras de
aproximadamente 5 mg en cápsulas de aluminio cerradas, no herméticas. Las
muestras se sometieron a un primer calentamiento y después de ser enfriadas a
temperatura ambiente se procedió a realizar el segundo calentamiento. El proceso se
realizó en dos etapas porque tras el segundo calentamiento no se observan las curvas
de evaporación de la humedad y los disolventes y permite observar mejor los
resultados de las muestras.
3.2.5. Concentración de resveratrol por UV
Para determinar la concentración de resveratrol se utilizó un espectrofotómetro
(Shimadzu UV-2550). La muestra se disolvió en agua pura a la concentración
requerida, con un rango de entre 1,67 y 2,5 ppm de resveratrol. Se realizó un primer
barrido para determinar la longitud de onda a la que se obtenía la máxima absorbancia
y se determinó en 305 nm.
Mediante el análisis por triplicado de una de las muestras obtenidas en los
ensayos se consiguió determinar el porcentaje de encapsulación del resveratrol en los
β-glucanos.
9
3.2.6. Actividad antioxidante (ORAC)
El ensayo ORAC se utilizó para evaluar la capacidad antioxidante frente a los
radicales hidroxilo de las muestras. Este ensayo mide la capacidad de las especies
antioxidantes presentes en las diferentes muestras para inhibir la oxidación de la
fluoresceína (FL) catalizada por AAPH (2,2 '-azobis (2-amidinopropano)), generando
radicales libre peroxilo (ROOH7), se llevó a cabo utilizando el método modificado de
Ou et al. (2002), que fue descrito previamente por Serra et al. (2011). La composición
de la mezcla de reacción fue de 150 μLx 100 nM (FL), (25μL x 240mM) AAPH
(preparada en 10 mM de tampón fosfato (PBS), pH 7.4) y las muestras a la dilución en
PBS a la concentración necesaria, que constituye un volumen total de 200 μL. Esta
mezcla se colocó en una microplaca de 96 pocillos a una temperatura de 37ºC y la
reacción se inició con la adición de AAPH. La fluorescencia emitida por la forma
reducida de FL se midió con un lector de Fluostar Optima (BMG Labtech, Offenburg,
Germany) y se registró cada minuto a una longitud de onda de emisión de 520 nm y a
una longitud de onda de excitación de 485 nm a los 30 minutos. El tampón fosfato se
utilizó como blanco y distintas soluciones de Trolox (12.5-200 μM) se utilizaron como
estándares de control. Los valores finales del ensayo fueron calculados mediante una
ecuación de regresión entre la concentración de Trolox y el área bajo la curva de FL.
El resultado se expresó como equivalentes de Trolox con capacidad antioxidante por
cada gramo de partículas (μmol TEAC/g). Para cada una de las partículas el análisis
se realizó al menos en 6 réplicas.
3.2.7. Perfiles de liberación controlada de resveratrol
Para la realización de los perfiles de liberación controlada del resveratrol se
utilizaron dos fluidos que simulaban el fluido gástrico y el intestinal.
Para la preparación del fluido gástrico se usó cloruro sódico (2 g/L) y se ajustó el
pH a 1,2 con ácido clorhídrico. Para preparar el fluido intestinal se usó fosfato sódico
monobásico (6,8 g/L) y se empleó hidróxido sódico para conseguir un pH de 6,8. En
ninguno de los dos casos se añadieron enzimas.
En estos ensayos se utilizaron tres tipos de muestras: resveratrol puro, una mezcla
física de resveratrol y β-glucanos y una muestra de resveratrol encapsulado.
La temperatura a la que se mantuvieron las muestras durante la prueba fue de
37ºC. El volumen utilizado para cada una de ellas fue de 0,1 L y la concentración de
resveratrol de 25 mg/L. La toma de las muestras se realizó a los 5, 15, 30, 60, 120 y
180 minutos, tomando cada vez 2 mL de muestra y reponiendo en cada uno de los
casos el fluido inicial en la misma cantidad. Las muestras se filtraron con filtros de
teflón con un tamaño de poro de 0,45 µm.
10
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1.
DETERMINACIÓN DE LA SOLUBILIDAD DE LOS β-GLUCANOS
Los resultados obtenidos en las pruebas de solubilidad de los β-glucanos se
detallan en la Tabla 2.
Tabla 2
Datos solubilidad β-glucanos
Disolvente
Acetato
Acetona
Agua
DMSO
Etanol
THF
Media (mg/mL)
2,6
0,28
24,5
14,8
ND
1,40
Desviación estándar
0,3
0,06
0,3
0,9
ND
0,19
Como se puede observar el disolvente que presentaba mejores datos de
solubilidad era el DMSO, por esta razón se determinó como el mejor disolvente para la
realización de las pruebas de precipitación por SAS. A pesar de que el DMSO
presenta una solubilidad un 37% menor que la del agua, ésta es muy superior a la del
resto de los disolventes analizados.
4.2.
PRECIPITACIÓN POR SUPERCRITICAL ANTISOLVENT (SAS)
La influencia de las principales variables que condicionan el proceso, la presión y
la temperatura, está determinada por las propiedades supercríticas del CO 2.
La presión de trabajo se fijó en valores de entre 10 y 11 MPa, ya que éste es el
límite máximo al que permite trabajar el equipo.
La elección de la temperatura de trabajo estaba determinada por el equilibrio de
fase que se muestra en el diagrama de la Figura 4. La temperatura que nos permitía
alcanzar las condiciones de una única fase para la mezcla de CO2–SC y DMSO a la
presión elegida y obtener unas partículas secas era de entre 34 y 35 ºC.
.
11
Fig.4. Diagrama del equilibrio de fases. De menor a mayor la presión de las isotermas
corresponden a 5. 15, 25, 35, 55, 65, 75 y 85 ºC.
En las siguientes tablas se muestran los experimentos que se llevaron a cabo.
Para su realización se modificaron las distintas variables de trabajo: concentración de
β-glucanos, flujo de la disolución, flujo de CO 2 y temperatura.
Tabla 3
Experiencias realizadas con β-glucanos y distintas variables de trabajo con la técnica SAS
Ensayo Concentración
(mg/ml)
A
2
B
5
C
5
D
5
E
5
F
5
G
5
H
10
F. dis.
(ml/min)
2
2
2
2
2
2
4
2
F. CO2
(kg/h)
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
5
2,5
2,5
T. (Cº)
34-35
37
38
50
34-35
34-35
34-35
34-35
Para realizar la co-precipitación de resveratrol con β-glucanos se seleccionaron
las condiciones de trabajo utilizadas en los ensayos anteriores en las que el producto
obtenido presentaba unas mejores características visuales, es decir, aquellas en las
que las muestras tenían un aspecto de polvo seco. La concentración de resveratrol se
escogió de manera que las partículas obtenidas tuvieran una proporción 1:1 de
resveratrol: β-glucanos.
12
Tabla 4
Experiencias realizadas con resveratrol y β-glucanos con la técnica SAS
Ensayo
I
J
Concentración Concentración
β-glucanos
Resveratrol
(mg/ml)
(mg/ml)
5
5
5
5
F. dis.
(ml/min)
F. CO2
(kg/h)
T. (Cº)
2
2
2,5
5
34-35
34-35
En la Figura 5 se muestran las partículas que se obtuvieron en uno de los
ensayos, observadas mediante SEM.
Fig.5. Imágenes obtenidas con el SEM pertenecientes a la muestra F.
Como podemos observar en las imágenes anteriores las partículas
encapsuladas de resveratrol y β-glucanos no se han formado adecuadamente. En la
primera de las imágenes observamos los agregados de partículas de entorno a 1mm.
La segunda imagen corresponde a las partículas submicrónicas fusionadas que han
dado lugar a los agregados, pese a ser las condiciones en las que se obtenían
partículas con mejor aspecto visual y con un mayor flujo de CO 2 para favorecer la
eliminación de disolvente.
Reverchon et al. (2000) realizaron ensayos con la misma técnica pero con
dextranos y obtuvieron micropartículas de 0,1 mm de diámetro. Los dextranos son
polisacáridos de glucosa unidos mediante enlaces α 1-6. Esta variabilidad en los
resultados puede deberse a las diferencias de peso molecular y de viscosidad de las
disoluciones en el disolvente orgánico de ambos compuestos, ya que en el caso de los
β-glucanos estos dos parámetros son más altos.
13
El análisis de las partículas mediante DSC pretendía usarse para determinar si
la estructura de los β-glucanos era amorfa o semi-cristalina, pero debido a la forma de
los perfiles obtenidos esta característica no se pudo observar. Por el contrario esta
prueba nos permitió determinar que en todas las muestras analizadas había una
cantidad de DMSO que no se había eliminado y estaba incluida en la matriz de estas
partículas. Esto se debe a que el CO2 no ha conseguido extraer todo el disolvente de
las muestras. El valor medio del porcentaje de DMSO que ha quedado es de entre un
20 y un 30% en masa.
En la Figura 6 se muestra uno de los resultados del análisis de DSC. El pico 1
corresponde al dato de la humedad de la muestras, mientras que el pico 2
corresponde al DMSO, cuyo punto de ebullición es de 189ºC. Todos los análisis
realizados mostraban resultados similares.
Fig.6. Resultados análisis DSC pertenecientes a la muestra E
La pureza del resveratrol usado se determinó por espectrofotemetría UV-VIS
mediante el coeficiente de extinción molar (e) de la Ley de Lambert Beer (A = e · l · C).
El coeficiente de extinción molar que se obtuvo fue de 33190 M-1 cm-1, dato que
concuerda con el encontrado en la bibliografía (Jiang, 2008). Por esta razón se puede
afirmar que el resveratrol usado era puro, con un valor próximo al 100%.
Se comprobó que a esa longitud de onda no había interferencias con los βglucanos ni con el DMSO a la concentración utilizada.
14
La concentración de resveratrol determinada en las partículas obtenidas fue de
230 mg resveratrol/g partícula (± 20 mg/g), que equivale a un valor medio de eficiencia
de encapsulación de resveratrol de 45% (± 4%).
4.3.
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y PERFILES DE LIBERACIÓN
CONTROLADA EN FLUIDOS SIMULADOS
Puesto que el producto que se obtuvo mediante la técnica SAS no cumplía con
los requisitos de concentración residual de disolvente orgánico (DMSO), las pruebas
de actividad antioxidante (ORAC-FL) y los perfiles de disolución en fluidos biológicos
simulados se realizaron con un producto obtenido mediante la técnica de secado en
spray con aire caliente (130ºC), partiendo de una suspensión acuosa de resveratrol y β
-glucanos. Este producto tenía una concentración de resveratrol de 27 mg/g de
partícula.
Fig.7. Imágenes de las partículas obtenidas mediante secado en spray
Los resultados obtenidos para la prueba de la actividad antioxidante se
muestran en la Tabla 5.
Tabla 5
Resultados de las pruebas de la actividad antioxidante
Muestra
Resveratrol puro
β-glucano puro
Formulado secado en spray
Mezcla física (resv. + β-glucano)
Resultado
17000 (±1800) μmol TEAC/g
300 μmol TEAC/g
30000 (±4000) μmol TEAC/g
22620 μmol TEAC/g
15
Los resultados obtenidos en la prueba de ORAC son positivos, ya que la
encapsulación del resveratrol en los β-glucanos incrementa sustancialmente el valor
de la actividad antioxidante. El resultado obtenido para los β- glucanos no era el
esperado, ya que en la forma pura no presentan actividad. A pesar de esto es
necesario repetir los análisis, ya que se han presentado dificultades a la hora de
realizar la disolución de las muestras y los valores de la desviación estándar son
elevados.
Los resultados obtenidos en las pruebas de liberación controlada en fluidos
simulados se muestran en la Figura 8.
100
90
80
% disolución
70
60
50
40
30
20
10
0
0
50
100
150
200
t (min)
Fig.8. Resultados de las pruebas de liberación controlada en fluidos simulados. Resveratrol
puro: (♦) Fluido gástrico, (■) Fluido intestinal. Mezcla física: (▲) Fluido gástrico, (X ) Fluido
intestinal. Formulado secado en spray: (ӿ) Fluido gastrointestinal, ( ) Fluido intestinal
La desviación entre los resultados de ambos test fue inferior al 10%; en
algunos casos este valor es superior, por lo que se plantea desarrollar una mejora en
el protocolo de análisis para realizar las pruebas mediante HPLC para la identificación
del resveratrol de forma independiente.
Hay que destacar que los valores de disolución del β-glucano se mantuvieron
prácticamente constantes durante todo el test, siendo de un 30% para el fluido gástrico
y de un 50% para el intestinal. Este factor se tuvo en cuenta a la hora de calcular la
concentración de resveratrol, ya que en esta cantidad si se observan interacciones
entre ambas señales.
16
Para la muestra de resveratrol solo no se observan cambios significativos en la
disolución entre el fluido gástrico y el intestinal, obteniendo unos valores de disolución
de aproximadamente hasta un 80% de la cantidad inicial. Para la muestra física de βglucanos y resveratrol observamos que la cantidad disuelta es similar que la de la
muestra anterior, aunque hay que destacar que el proceso es más lento posiblemente
por la dificultad a la hora de disolver los β-glucanos. En el caso de la muestra obtenida
por secado en spray el valor de disolución es solo del 30%, lo que representa un
resultado positivo, ya que el compuesto queda protegido especialmente en el fluido
gástrico y teniendo en cuenta que la absorción del compuesto tiene ligar a nivel
intestinal.
Para seguir investigando en este aspecto se podrían realizar test in-vitro de
absorción de partículas por células epiteliales del intestino (Caco2) (Almeida et al.,
2010)
5. CONCLUSIONES
A la vista de los resultados obtenidos podemos afirmar que esta técnica no es
adecuada para la encapsulación del resveratrol en β-glucanos, puesto que en todas
las muestras que se han obtenido aparece una cantidad de DMSO que no se ha
eliminado y esto hace que la aplicación del producto resultante inviable.
Estos resultados posiblemente puedan deberse a la elevada viscosidad que
presentan las disoluciones de β-glucanos en DMSO.
Por esta razón es necesario desarrollar otras técnicas alternativas que permitan
eliminar todo el disolvente de las muestras.
Ya que la morfología de las partículas obtenidas mediante la técnica de secado
en spray es adecuada, así como el contenido en β-glucano y los resultados
preliminares de los test de disolución y actividad antioxidante han resultado positivos,
se podría estudiar de forma más sistemática este proceso, para conocer los límites de
encapsulación, analizar el disolvente residual y la posible degradación de
trans-resveratrol a cis- por efecto de las condiciones de trabajo.
Desde hace algunos años se están realizando investigaciones con fluidos
supercríticos que permiten obtener proteínas con formulaciones de polvo seco, en las
que se utilizan azúcares como estabilizadores. El mayor inconveniente que se
presentaba fue que para esta técnica se necesitaban flujos muy altos de CO 2, debido a
la baja solubilidad que presenta el agua en el CO2. Como solución a este problema se
usó etanol, que actúa como modificador de manera que se disminuye la cantidad de
CO2 necesaria para el proceso. (Bouchard et al., 2008)
17
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