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EFECTOS DE LOS PLAGUICIDAS EN EL ADN Y PROTEÍNAS DE LARVAS DE
CAMARÓN AZUL Litopenaeus stylirostris (STIMPSON, 1874) DEL GOLFO DE
CALIFORNIA.
J. G. Galindo Reyesa, N. Leyva Rivasb, O. G. Millán Aguilar y M. G. Lazcano Alvarezc.
Facultad de Ciencias del Mar, Universidad Autónoma de Sinaloa.
Paseo Claussen s/n, Mazatlán, Sinaloa. C.P. 82000. México.
a.- [email protected]
b.- [email protected]
c.- [email protected]
RESUMEN
Recientemente, ha ocurrido alta mortalidad y patologías diversas en larvas de camarón cultivado del Golfo de
California; hay antecedentes que indican que esto puede estar asociado al efecto de plaguicidas. Se expusieron
las larvas de camarón Litopenaeus stylirostris a Endosulfán, Azinfosmetilo, Permetrina, Paratión, Malatión,
Chlorpyrifos, Carbaryl y DDT para estimar la dosis letal del 50% (LC 50), y detectar posibles aductos y
rupturas en la molécula de ADN, así como el contenido de proteínas. Se expusieron lotes de 20 larvas en
matraces de 2 litros, a soluciones subletales de cada uno de los plaguicidas durante 4 días. Se extrajo el ADN
de las larvas y se evaluó por espectrofotometría UV comparándolo y cuantificándolo contra un estándar. Se
analizaron los extractos por cromatografía de líquidos de alta resolución, previamente tratados por el método
del desdoblamiento alcalino propuesto por Shugart (1988). La concentración de proteínas se estimó por el
método de Biuret. La LC50 menor correspondió al Carbaryl y la mayor al Malatión, lo cual indica que son el
más y el menos tóxico, respectivamente. Sólo hubo rupturas del ADN en larvas expuestas a DDT. También
hubo una reducción en el contenido de proteínas que es un índice del crecimiento de las larvas.
1. INTRODUCCIÓN
Los plaguicidas en ecosistemas acuáticos.
Cuando los plaguicidas son empleados, sus residuos son transportados a las distintas matrices (aire, agua,
suelo) y la contaminación de fuentes de alimento para los organismos silvestres, conllevan la posibilidad de
que se produzcan efectos adversos que afecten a poblaciones enteras y pongan en riesgo la supervivencia de
las especies en peligro de extinción, dañando también a organismos predadores y polinizadores, entre otros.
Entre los efectos más notorios están, la incapacidad reproductiva de los organismos expuestos y la muerte
misma (SEMARNAP, 1996). Los plaguicidas con solubilidad en agua mayor a 500 mg/l son muy móviles en
los suelos y otros elementos de los ecosistemas, su mayor concentración se encuentra en ecosistemas
acuáticos. Aquellos de solubilidad mayor a 25 mg/l (como ocurre en general con los organofosforados) son
menos persistentes en los organismos vivos y los que tienen solubilidad menor (como los organoclorados)
tienden a inmovilizarse en suelos y concentrarse en organismos (SEMARNAP, 1996).
Ácidos nucleicos.
En estudios recientes con organismos acuáticos, se ha utilizado el contenido de ácidos nucleicos (ADN y
ARN) como un indicador de toxicidad crónica en estos; en algunos casos, esta toxicidad es ocasionada por
plaguicidas (Galindo, 1997). En el presente estudio no sólo se cuantificó el porcentaje relativo de ADN en los
organismos tratados y el control, sino también se buscaron alteraciones en esta biomolécula, ocasionadas por
los agroquímicos; cabe aclarar que el ARN no fue objeto de estudio.
Aductos en el ADN.
El potencial para utilizar los aductos en el ADN como un biomarcador de la exposición a complejas mezclas
de químicos genotóxicos ha iniciado a ser válido en el campo de estudios sofisticados como el método 32Ppost-marcación. Actualmente, la técnica 32P-post-marcación es semicuantitativa, laboriosa, y de costo
moderado.
Ruptura en la cadena.
Muchas sustancias tóxicas pueden causar rupturas en la cadena del ADN, ya sea directa o indirectamente. El
método del desdoblamiento alcalino permite estimar el incremento en el nivel de ruptura superior a la
condición normal de la molécula, resultando de la exposición a estos xenobióticos. La técnica puede ser
aplicada al análisis de muchas muestras sin la necesidad de reactivos o equipo de laboratorio demasiado
costoso. Para el campo de estudios, los análisis de laboratorio se hacen con tejidos frescos o congelados. La
información está disponible en pocas horas y es mejor interpretada en relación a la información proporcionada
por otros biomarcadores. El método está idealmente adaptado para la rutina, monitoreo in situ de especies
indicadoras de contaminación ambiental, debido a su facilidad y relativo bajo costo (Shugart, 1990a, b).
Proteínas.
Las proteínas poseen muy diversas funciones biológicas. Las enzimas representan la clase más amplia.
Algunas como por ejemplo, el Citocromo “c”, transfieren electrones hacia el oxígeno molecular durante la
respiración, o bien, como la ADN-polimerasa y las enzimas activadoras de aminoácidos, participan en la
biosíntesis de los componentes celulares. En resumen, las proteínas desempeñan gran diversidad de
funciones: actúan como catalizadores, como elementos estructurales, en los sistemas contráctiles, como
reserva de elementos nutritivos, como vehículos de transporte, y también actúan como hormonas y como
elementos de protección (Lehninger, 1995).
Los Plaguicidas en el Golfo de California.
A lo largo de la costa Occidental del Golfo de California, México, se localizan alrededor de 300 granjas de
camarón, donde se cultivan larvas de Litopenaeus spp., principalmente Litopenaeus stylirostris (Stimpson,
1874), ya que esta especie ha demostrado buen desarrollo en las condiciones ecológicas de esta región, y más
resistencia a algunas patologías que otras especies cultivadas en estas granjas acuícolas (Galindo et al., 2000).
La producción acuícola de camarón en esta región es de aproximadamente 24,000 ton métricas por año, las
cuales representan aproximadamente 119 millones de dólares, puesto que entre el 80 y el 85% de esta
producción es exportada a EUA y Europa; pero en años recientes la producción de camarón en las granjas ha
declinado, y las causas que se señalan son diversas (SEDESOL, 1999). La contaminación por plaguicidas es
una de éstas, ya que a lo largo de la costa, una actividad agrícola intensiva es practicada y grandes cantidades
de plaguicidas son aplicadas en los cultivos de estas tierras, para proteger las cosechas de plagas adversas;
consecuentemente los residuos de estos xenobióticos son transportados por el viento y escurrimientos de
aguas continentales hasta las lagunas costeras y estuarios donde se localizan las granjas. Debido a esto, fue
considerado muy importante estudiar algunos efectos tóxicos de estos agroquímicos en larvas de Litopenaeus
stylirostris, y usar las respuestas tóxicas como biomarcadores indicando la presencia de plaguicidas en el agua
que se usa en las granjas de camarón, y si esto representa un riesgo para el crecimiento de las larvas, así como
pérdidas económicas (Galindo et al., 2000).
La calidad del agua que se administra y las necesidades de los monitoreos ambientales, requiere el desarrollo
de marcadores significativos e indicadores biológicos de exposición de tóxicos como previsores de los efectos
de la contaminación. El mejor biomarcador podría ser aquel que responda rápidamente a la presencia del
xenobiótico, fácil en la realización de los análisis, y a un precio accesible. Varios biomarcadores están ahora
en proceso de evaluación (Adams, 1990; Benton et al., 1994; Galindo et al., 2000). Debido a que algunas
sustancias xenobióticas producen alteraciones en las biomoléculas genéticas de los organismos dañados, se
consideró importante conocer si los plaguicidas ensayados en este trabajo, causan cambios en el ADN de las
larvas de camarón L. stylirostris. Las proteínas han sido utilizadas como biomarcadores, debido a que su
metabolismo es directamente afectado por muchos xenobióticos. Varias publicaciones citan alteraciones en
proteínas totales o su metabolismo en organismos acuáticos expuestos a plaguicidas (Al-Chalabi y Al-Khayat,
1989; Benton et al., 1994; Galindo et al., 1997). Por lo tanto, en este trabajo las proteínas totales fueron
evaluadas para saber si los plaguicidas tienen algunos efectos sobre el metabolismo de estas biomoléculas en
larvas de camarón.
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La contaminación por plaguicidas en los ecosistemas acuáticos provoca pérdidas por enfermedades y
mortandades de camarones que pueden atribuirse a la presencia de estos compuestos en el Golfo de
California, como consecuencia de la gran actividad agrícola en la planicie costera. Entre las consecuencias
que provoca la exposición a plaguicidas están las alteraciones en la molécula del ADN y proteínas en
organismos acuáticos, por lo tanto en este trabajo tomamos esta referencia para estudiar los daños que pueden
producir en las larvas de camarón azul Litopenaeus stylirostris.
3. HIPÓTESIS
Los Plaguicidas causan alteraciones en la molécula del ADN y proteínas de larvas de Litopenaeus stylirostris
del Golfo de California, expuestos a concentraciones subletales de estos tóxicos.
4. OBJETIVO GENERAL
Determinar si la exposición de las larvas de Litopenaeus stylirostris a concentraciones subletales de
Plaguicidas pueden causar alteraciones a nivel de ADN y proteínas en los mismos.
4.1 OBJETIVOS PARTICULARES
 Determinar la concentración letal media (LC50) en larvas L. stylirostris expuestos a estos plaguicidas.
 Comprobar la existencia de daños al ADN de los organismos expuestos a diversos Plaguicidas, mediante
la determinación de ruptura y/o presencia de aductos (“parches”) en la doble cadena de ADN.
 Detectar el efecto tóxico de los plaguicidas sobre la cantidad de proteína en larvas de camarón.
5. METODOLOGÍA
Dos lotes certificados de 1,000 larvas de L. stylirostris en cada uno, fueron obtenidos del productor comercial
“Super Shrimp”, mismo que vende estas larvas a granjas locales de camarón. Las larvas fueron aclimatadas a
las condiciones de laboratorio (Temperatura 22-24°C, Salinidad 33-35 0/00, pH 8.4-8.7) y mantenidas con
alimento comercial, durante 3-4 días previos a los ensayos de toxicidad. Se expusieron las larvas a
Endosulfán, Azinfosmetilo, Permetrina, Paratión, Malatión, Chlorpyrifos, Carbaryl y DDT para estimar la
dosis letal del 50% (LC50), y detectar posibles aductos y rupturas en la molécula de ADN, así como el
contenido de proteínas. Se expusieron lotes de 20 larvas en matraces de 2 litros, a soluciones subletales de
cada uno de los plaguicidas durante 4 días. Se extrajo el ADN de las larvas y se evaluó por espectrofotometría
UV comparándolo y cuantificándolo contra un estándar. Se analizaron los extractos por cromatografía de
líquidos de alta resolución, previamente tratados por el método del desdoblamiento alcalino propuesto por
Shugart (1988). La concentración de proteínas se estimó por el método de Biuret.
6. RESULTADOS
El valor de LC50 más bajo correspondió al Carbaryl y el más alto al Malatión, lo cual indica que estos
plaguicidas son el más y el menos tóxico, respectivamente, para las larvas de L. stylirostris.
Al extraer ADN de las larvas expuestas a plaguicidas y del control, las muestras fueron observadas por
espectrofotometría para verificar la presencia de esta molécula. En los resultados se puede ver en cada una de
ellas un máximo entre los 260 nm, siendo este valor el indicativo de la existencia del ADN.
La cantidad de ADN para cada lote de larvas expuestas a plaguicidas y sus controles se presentan en la Tabla
1. En todos los casos, la cantidad en los tratamientos fue menor que en el control.
Plaguicida
Peso larval Absorbancia
ADN
(g)
260 (nm)
(mg/g)
DDT
0.39
0.664
1.746
Azinfosmetilo
0.29
0.491
1.693
Permetrina
0.38
0.805
2.118
Paratión
0.3
0.659
2.196
Chlorpyrifos
0.36
0.694
1.927
Malatión
0.33
0.565
1.712
Endosulfán
0.36
0.698
1.938
Carbaryl
0.31
0.568
1.718
Control
0.33
0.793
2.403
Tabla 1. Peso de las larvas, absorbancia y cantidad de ADN.
Fig. 1.- Cromatogramas de ADN de larvas de
camarón Litopenaeus stylirostris.
En los valores de ADN (expresados como porcentaje relativo) con respecto al control, las larvas tratadas con
los plaguicidas Paratión y Azinfosmetilo registraron los porcentajes más bajo y alto, respectivamente. Como
se muestra en la Fig. 1, la presencia de aductos y/o rupturas en la cadena de la molécula del ADN se
presentaron solamente en las larvas que se expusieron al DDT, ya que este fue el único caso donde el
cromatograma mostró dos picos, por el contrario en todos los demás cromatogramas correspondientes a los
tratamientos y al control sólo presentan uno, esto último indica que no hubo alteración molecular. Por último,
en los resultados de la cantidad de proteínas de las larvas de camarón expuestas a plaguicidas, encontramos
que en todos los casos la concentración de proteína fue menor a la del control (larvas que no estuvieron
expuestas). Todos los datos fueron procesados estadísticamente, y la prueba de “t de student” dio diferencias
significativas, excepto para Carbaryl, (P<0.05), es decir, las muestras expuestas a este plaguicida registraron
el mayor porcentaje relativo de proteínas (92%), y las expuestas a Permetrina, el menor (80%).
7. CONCLUSIÓN
Con los resultados que obtuvimos en esta tesis, se concluye que el Carbaryl y el Malatión son los plaguicidas
más y menos tóxicos, respectivamente para las larvas de L. stylirostris en las condiciones de laboratorio que
utilizamos, éstas fueron: Temperatura 22-24ºC, pH 7.4-8.7 y salinidad 33-35 PPM, ya que el valor del LC50
para el primero fue de 0.0298 mg/l, y para el segundo 34.197 mg/l.
Las alteraciones en el ADN que observamos en las larvas expuestas a los contaminantes, pueden ser la causa
de aductos, rupturas en la cadena, mutaciones, y otras alteraciones en el ADN, como un resultado de una
interacción del contaminante con la molécula, tal como se observó con el DDT, ya que en los cromatogramas
se muestra claramente una diferencia (dos picos) de éste con respecto a los otros plaguicidas (un pico).
El DDT está considerado dentro de los xenobióticos conocidos como “Docena sucia”, estipulados en el
Convenio de Estocolmo, realizado en esta ciudad a principios del año 2001. En esta reunión, México se
comprometió con todos los países firmantes, a eliminar del mercado definitivamente a este agroquímico en un
lapso máximo de tres años.
A partir de los análisis que efectuamos en las larvas de camarón azul L. stylirostris para determinar la
cantidad de proteínas, y teniendo como resultados que todos los plaguicidas les causaron una disminución,
principalmente la Permetrina, concluimos que esto está relacionado con un bajo crecimiento de los
organismos, ya que el estrés tóxico provoca, inicialmente, una reducción de lípidos, seguido de los
carbohidratos y, finalmente, de proteínas. Existe un ordenamiento jurídico que regula la utilización de los
plaguicidas, residuos peligrosos, entre otros tóxicos, mismo que debe ser considerado antes de su utilización
para evitar que sigan afectando a los ecosistemas, tanto acuáticos, como aéreos, como terrestres.
8. BIBLIOGRAFÍA
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