D-ConcentrEnz02

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA.
Como las enzimas son catalizadores, se espera que la velocidad inicial sea proporcional
a la concentración de enzima (Ec.1, Fig.1). Esta es la situación en la mayoría de los
casos. donde en los gráficos vo versus concentración total de enzima se obtiene una
recta que pasa por el origen (actividad cero a cero concentración de enzima).
v 
Vmax S
K m  S
v
k cat S
E
K m  S
Ec.1
Fig. 1. Criterio para un ensayo enzimático válido. La curva (a) muestra el aumento lineal
de la absorbancia en el tiempo para una reacción catalizada por una enzima. La curva (b)
muestra la respuesta lineal deseada de la velocidad de la reacción en función con el
volumen de la enzima en L de la muestra enzimática.
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Como en algunas situaciones esta relación directa entre la velocidad y la concentración
de enzima no se da, es importante controlar siempre la linealidad entre estas variables.
Para ello es necesario trabajar en un intervalo de absorbancia en el cual se cumpla la ley
de Lambert y Beer, y a tiempos de ensayo en los cuales la absorbancia varíe en forma
proporcional (directa o inversa) (Fig. 2).
Fig.2. Importancia de trabajar con velocidades iniciales. Figura (a),
curvas progreso de la reacción con tres cantidades diferentes cantidades
de enzima. Figura (b), velocidades aparentes, obtenidas a tres tiempos
de la figura (a), graficadas versus la cantidad de enzima.
En ocasiones la pérdida de linealidad puede ser un artefacto, como cambios de pH o
fuerza iónica al agregar cantidades crecientes de la solución de enzima; debe controlarse
que esto no ocurra.
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El gráfico de velocidad versus concentración de enzima puede presentar ya sea una
curvatura hacia ascendente (Fig. 3, curvas (b) y (c)), como también descendente (Fig. 4).
[enzima]
Fig. 3. Dependencia entre la vo y la [E] que da una curva ascendente. La curva (a) da la
relación normalmente esperada. La curva (b) representa el caso en el que un inhibidor
irreversible contamina la mezcla de ensayo. La curva (c) muestra el comportamiento posible si en
la preparación enzimática hay un activador reversible.
Fig.
4.
Dependencia de la vo de la reacción con la [E] que da una curva descendente.
3
Curvatura ascendente:
1.
La presencia de una pequeña cantidad de un inhibidor irreversible en la
mezcla de ensayo (no en el extracto enzimático).
Cantidades pequeñas de la enzima serán totalmente inhibidas, se detectará actividad
después que se haya agregado suficiente cantidad de la enzima que reaccione con todo
el inhibidor quedando enzima sin reaccionar (Fig. 3, curva b).
Varias enzimas son inhibidas por metales pesados, la contaminación de tampones o del
sustrato da lugar a tal comportamiento. Como la inhibición irreversible es dependiente del
tiempo, el orden de adición de los componentes a la mezcla de ensayo puede afectar los
resultados. Si la enzima es preincubada en una mezcla incompleta de ensayo en la que
el inhibidor está presente se obtiene una curva como la b. Si la reacción se inicia con la
adición de la enzima, se esperaría una respuesta no lineal en el tiempo, y si fuera posible
determinar la vo antes que la inhibición irreversible sea significativa se obtendría una
relación lineal con la concentración de enzima.
2.
La presencia de un activador disociable en la solución enzimática.
Fig. 5
Efecto del activador en la
preparación enzimática.
Arilsulfatasa (EC 3.1.6.1.)
4
Se puede representar el equilibrio entre el activador y la enzima
E + A

EA
Ka es la constante de disociación del complejo. Despejando [EA] se obtiene,
[E] [A]
[EA] =
Ka
donde [E] es la concentración de la enzima libre. La concentración total de la enzima [E]T
será :
[E] T = [E] + [EA]
E
 ET  EA 
Como el activador estará presente en la solución enzimática en una proporción constante
de la concentración de la enzima, su concentración puede expresarse como x[E]T.
A
 xET
Reemplazando,
([E] T - [EA]) x[E]
[EA] =
T
Ka
x ET
[EA] xET
2
-
Ka
= [EA]
Ka
xET
2
x[E] T
= (
Ka
+ 1) [EA]
Ka
xET
(xET + Ka)
2
= [EA]
Ec. 2
De acuerdo a esta ecuación la concentración del complejo EA no aumenta linealmente
con la concentración de enzima, dando una curva como la mostrada en la Fig. 5, curva A.
La forma precisa de la curva dependerá del mecanismo cinético de activación y de la
posible actividad de la enzima libre. La adición de un exceso de activador a la mezcla de
ensayo desplazará el equilibrio, de modo que la enzima estará esencialmente como EA,
obteniéndose una relación lineal entre vo y [E].
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3.
Asociaciones / disociaciones.
Fig. 6 Efecto de asociación de subunidades. Fosfofructoquinasa ensayada con F-6-P 200 M y en curva
A, 200 M ATP + 200 M AMP; en curva B, 500 M ATP; y en curva C, 500 M ATP + 500 M citrato.
Un caso particular ocurre cuando la enzima presenta un equilibrio de asociación, siendo
la forma agregada la activa. Como el aumento de la concentración de enzima favorece la
agregación de la enzima la curva vo versus [E] es ascendente. La fosfofructoquinasa del
corazón de buey presenta un equilibrio entre estas formas (Fig.6). El activador alostérico
AMP se une a la forma agregada y promueve la asociación, dando una dependencia
lineal cuando la concentración de AMP es alta. El inhibidor alostérico citrato promueve la
disociación, lo que resulta en una curvatura más pronunciada. El ATP se puede unir a
ambas formas de la enzima, aunque a altas concentraciones favorece la disociación.
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Curvatura descendente.
La enzima alcanza un máximo aparente a concentraciones más altas de enzima.
Fig. 7 Restricción de la velocidad determinada por el
método de ensayo
1.
Falla en la medida de velocidad inicial; puede producir un máximo aparente en
la curva v/[E], si se utiliza un ensayo discontinuo a un tiempo fijo. (Fig. 7).
A alta concentración de enzima la reacción es completa o ha alcanzado el
equilibrio. En este caso la adición de más enzima no resulta en un aumento de la
cantidad de producto formado.
El método de detección puede resultar limitante a concentraciones altas de
enzima.
Si se utiliza un ensayo acoplado, la actividad de la enzima auxiliar puede resultar
limitante de modo que aumento de la enzima en estudio no resultará en aumento
de la velocidad.
Resultados similares se obtienen si hay una falla en la respuesta del equipo en
forma lineal a aumentos de concentración.
Es necesario asegurarse que mediante el procedimiento utilizado se mida velocidad
inicial en todas las condiciones.
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2.
La presencia de un inhibidor disociable en la solución enzimática.
Si la preparación de la enzima contiene un inhibidor reversible que se une a la enzima
para dar un complejo EI, el porcentaje de la enzima como EI aumenta a medida que la
concentración de enzima aumenta en tal forma que hay más enzima inactiva a altas
concentraciones de enzima (Ec. 3).
Fig. 8
Efecto de un inhibidor en la preparación enzimática. Arilsulfatasa (EC 3.1.6.1).
xET
(xET + KI)
2
= [EI]
Ec. 3
De acuerdo a la ecuación anterior un aumento de la concentración de enzima no resulta
en un aumento proporcional del inhibidor, la concentración de enzima presente como
complejo E-I aumentará en una proporción mayor. Si el complejo es totalmente inactivo,
al gráfico v/[E] tenderá a un máximo aparente. Si el inhibidor es una molécula pequeña
será posible removerla de la solución enzimática por diálisis o filtración en gel.
En la Fig. 8 se muestra la velocidad de hidrólisis de p-nitrofenilsulfato catalizada por un
extracto de hígado de rata versus la concentración de enzima. La no-linealidad de la
curva A se debe a trazas de fosfato en el extracto, que al ser removido por diálisis da la
curva B.
8
Fig. 9
Efecto de un inhibidor añadido a la preparación enzimática. Tripsina (EC 3.4.21.4).
A pesar de estas excepciones, en la gran mayoría de los casos se encuentra una
proporcionalidad entre la velocidad inicial y la concentración de enzima.
Enzyme Assays, A Practical Approach.
Principles of Enzyme Assays and Kinetic Studies. Keith Tipton.
Edited by R. Eisenthal and M. J. Danson.
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Actividades
1.




2.
3.
Explique las siguientes aseveraciones:
Una relación lineal entre [P] ([S], A) y el tiempo de reacción no asegura una
relación directamente proporcional entre la vo y la [E].
Una relación lineal entre la v y la [E] permite postular una relación directa entre
la [P] ([S], A) y el tiempo de ensayo.
Es discutible trabajar a un solo tiempo en el ensayo enzimático, aunque ese
tiempo esté en el intervalo lineal en la curva progreso de la reacción.
Si en un ensayo usted obtiene una absorbancia fuera del intervalo de la ley de
Lambert y Beer, debe volver a realizar el ensayo variando un factor ([E],
temperatura, tiempo de reacción) y no simplemente diluir la solución del
cromóforo.
Analice la concordancia entre la ecuación y la curva ascendente obtenida
cuando en la preparación enzimática hay un activador reversible.
Analice la concordancia entre la ecuación y la curva descendente obtenida
cuando en la preparación enzimática hay un inhibidor reversible.
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