Estruct. 3D proteinas (pract.bioquim.2006)

UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, BIOLOGÍA MOLECULAR Y FARMACOLOGÍA
SECCION BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
AULA INTERACTIVA
PRACTICA III: ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL (3D) DE LAS PROTEÍNAS
Las biomoléculas poseen tamaños y estructuras 3D características, que son el resultado de su
esqueleto estructural y sus grupos funcionales sustituyentes. La conformación 3D de las moléculas
determina sus interacciones y su función; por ejemplo en la unión de un sustrato al centro activo de
una enzima, las moléculas deben encajar exactamente de forma complementaria para que se produzca
la acción biológica.
El estudio de la estructura 3D de las biomoléculas se realiza principalmente por métodos
físicos. El método más informativo es la difracción de rayos X. Si un compuesto puede ser
cristalizado, la difracción de los rayos X por el cristal puede usarse para determinar las posiciones
relativas de cada uno de los átomos de la molécula con gran precisión. Mediante este método se han
deducido las estructuras de gran número de biomoléculas como proteínas y ácidos nucleicos.
Otro método para resolver estructuras 3D es la resonancia magnética nuclear (RMN). Esta
técnica es complementaria a la cristalografía de rayos X al proporcionar información acerca de la
estructura 3D de biomoléculas en disolución, pero está limitado a moléculas pequeñas de menos de
80 kD de peso molecular.
En los últimos años muchas proteínas han sido modeladas mediante métodos teóricos que
determinan, de forma aproximada, la estructura 3D de biomoléculas. El modelaje molecular es la
alternativa sugerida cuando por motivos de purificación, solubilidad, cristalización u otros, la
proteína no puede ser resuelta aplicando los métodos experimentales. Uno de los métodos de
modelaje molecular es el modelaje por homología, que involucra la superposición de una secuencia
conocida (proteína que deseamos modelar) a una estructura 3D determinada experimentalmente de
una molécula similar en secuencia (proteína molde). Los resultados de este tipo de modelaje tienden a
ser más confiables que aquellos derivados puramente a partir del conocimiento teórico.
El conocimiento de la estructura 3D detallada de una molécula es útil porque puede brindar
indicios sobre los mecanismos de las reacciones en las que la molécula participa. Los datos sobre las
estructuras 3D de macromoléculas proteicas se encuentran disponibles en la base de datos de
proteínas (Protein Data Bank 3D Browser): http://www.rcsb.org/pdb/ como archivos *.pdb.
Para la visualización de las proteínas en su estructura 3D se utilizarán el programa SwissPDBViewer/DeepView. Este programa es uno de los más conocidos y empleados al tener una
interface visual bastante amigable y ser capaz de brindar información estructural relevante. Entre
otras funciones, este programa permite analizar varias estructuras al mismo tiempo (superposición
estructural), calcular puentes de hidrógeno, visualizar diagramas de Ramachandran y calcular
potenciales electrostáticos. Una de las funciones que emplearemos en esta práctica será la
superposición estructural de proteínas la cual permite extraer información sobre regiones similares en
proteínas homólogas, por ejemplo sitios activos de enzimas homólogas. Además, SPDBV tiene una
conexión directa con el servidor de modelado por homología Swiss Model y algunas herramientas de
minimización de energía.
Ejercicio Práctico 1:
El objetivo de esta primera parte de la práctica es familiarizarse con la imagen 3D de una
proteína y entrenarse en la manipulación de su estructura. Para ello deberá seguir las instrucciones en
cada caso y contestar cada pregunta a continuación. Luego de lo cual presentará un breve informe con
las respuestas consignadas en la presente guía.
Se trabajará a partir de los archivos *.pdb de dos proteínas: hemoglobina y albumina
utilizando el programa SPDBV.
Uso de SPDBV
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Una vez iniciado el programa ir a File y mediante la orden Open PDB file seleccionar el
archivo .pdb que queramos abrir.
En la barra de herramientas dentro de la opción Window seleccionar Control Panel. La nueva
ventana que se abre nos muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína seleccionada. En
esta ventana podemos seleccionar los aminoácidos que queramos ver en pantalla, así como
cambiar la representación de la proteína.
Usando la barra de herramientas existe la posibilidad de seleccionar diferentes grupos de la
proteína, cambiar el tipo de coloración y la posibilidad de realizar diferentes actividades
relacionadas con la ingeniería de proteínas. (SUGERENCIA: antes de preguntar al
profesor sobre como hacer alguna acción con el programa, curiosea un poco por tu
parte).
 Lisozima (1REX)
La lisozima es una enzima que se encuentra en la clara del huevo y en las lágrimas y salina humanas.
Cataliza la rotura hidrolítica de los enlaces glucosídicos entre la N-acetilglucosamina y el ácido Nacetilmurámico que forman parte de los polisacáridos de las paredes celulares de algunas familias de
bacterias y que se encuentran formando una estructura conocida como peptidoglicano.
Cuatro puentes disulfuro contribuyen a la estabilidad de la estructura de la lisozima. Las hélices a se
hallan situadas en una larga hendidura en el lado lateral de la molécula, denominada centro activo,
donde tiene lugar la fijación del sustrato y se lleva a cabo la función biológica.
Emplearemos esta estructura para familiarizarnos con el uso del programa SPDBV. Tienes que oír
atentamente todas las indicaciones que de tu profesor para no perder ni un detalle sobre el
programa.
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Representaremos en ribbons la proteína.
Colorearemos de distinto color las alfa hélices, láminas beta y loops.
Buscaremos algunos residuos hidrófobos y otros hidrófilos y veremos su localización en la
estructura 3D de la proteína.
Seleccionaremos con un color los residuos de cisteína (Cys) de la molécula (formadores de
puentes disulfuro).
Seleccionaremos con otro color los residuos Asp 53 y Glu 35 para identificar el sitio activo de
la enzima.
 Hemoglobina (1A3N)
Esta es una proteína plasmática que transporta oxígeno y dióxido de carbono a través de la sangre a
los tejidos. Su estructura es más compleja que la de lisozima, veamos por qué.
1. ¿Cuántas cadenas polipeptídicas o subunidades observa? ¿Son estas cadenas iguales o diferentes?
¿A que proteína es similar cada uno de los monómeros de la hemoglobina? ¿Mediante qué
interacciones cree usted que interactuan los monómeros de la hemoglobina?.
2. Seleccione los grupos Hemo con otro color. ¿Cuántos grupos Hemo observa? ¿Qué constitución
tiene el grupo Hemo?.
3. ¿Cuántas láminas beta y alfa hélices posee cada monómero de hemoglobina? ¿Existen loops en
su estructura?
4. Seleccione los residuos His 45 e His 87 cada uno con un color diferente. ¿Con qué grupos de la
molécula interactúan? ¿Qué importancia tienen? ¿Qué tipo de interacción cree que establece el
grupo Hemo con la hemoglobina?.
 Albúmina (1E7H)
Esta es una proteína plasmática bastante grande y compleja que transporta en su interior una variedad
de ligandos, grupos funcionales, coenzimas, etc. Vamos a analizar la estructura 3D de la proteína y
analizar algunos sitios de unión a estos cofactores.
1. ¿A que grupo de estructura proteica corresponde la albumina? De otro ejemplo dentro del mismo
grupo ¿Qué tipo de estructura secundaria predomina en la albumina?
2. ¿Cuántos ácidos palmíticos transporta la molécula? ¿Qué tipo de residuos de la albúmina
interaccionarán con el ácido palmítico y mediante qué tipo de interacciones lo harán?
3. Marque los residuos de prolina (Pro), ¿En qué regiones de la proteína se encuentran en mayor
proporción? ¿Por qué aparecen en menor medida en el interior de las hélices?
Problema:
Baje el archivo “.pdb” de la página del Protein Data Bank de la holoflavodoxina de Anabaena
PCC 7119 (código 1FLV) y responda a las siguientes preguntas sobre dicha proteína:
1. ¿Cuántas hélices alfa y hojas beta tiene la holoflavodoxina?
2. ¿A que grupo de estructura proteica corresponde la flavodoxina? ¿De otro ejemplo dentro
del mismo grupo?
3. ¿Cuál es el coenzima de la holoflavodoxina? ¿Qué función tiene?
Ejercicio Práctico 2:
El objetivo de esta segunda parte de la práctica es relacionar los conceptos de estructura y
función de enzimas que se han revisado en clase teórica. Para ello deberá seguir las instrucciones en
cada caso y contestar cada pregunta a continuación. Luego de lo cual presentará un breve informe con
las respuestas consignadas en la presente guía. Aplique lo aprendido sobre el programa Swiss
PDBViewer y proceda a desarrollar cada uno de los siguientes ejercicios:
 Citocromo C (Cód. PDB 1YCC)
Esta enzima interviene en la cadena transportadora de electrones durante la respiración celular,
llevada a cabo en la mitocondria. Como podrán apreciar su estructura es bastante compleja y está
unida al grupo Hemo. Visualiza detenidamente la estructura de la proteína ligado a su cofactor, el
Hemo.
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Cuántas cadenas polipeptídicas puede apreciar.
Ubique el grupo Hemo (HEM). ¿Cuántos tiene la molécula? Posee átomos de Hierro ¿Cuántos?
¿Qué tipo de estructuras secundarias se encuentran albergando al Hemo?
Determine, usando la opción de libreto, a qué organismo pertenece la proteína y con qué
resolución se determinó la estructura.
 Compara las estructuras del citocromo C en su forma cristalizada (1YCC) y el que se encuentra
en disolución (1J3S) resuelta por RMN. Cite 2 diferencias estructurales y sugiera una explicación
de dichas variaciones.
 Hexoquinasa humana (Cód. PDB 1QHA)
Esta enzima interviene en la conversión de glucosa a glucosa 6 fosfato dentro de la célula para que de
esa forma el azucar sea degradado mediante el proceso de glucólisis hasta piruvato. Revisa con
cuidado la estructura de la proteína y observa los sitios de unión a glucosa, donde se lleva a cabo la
reacción enzimática.
 Cuántas cadenas polipeptídicas puede apreciar.
 Ubique a la glucosa (GLC) Y glucosa-6 fosfato (G6P). ¿Puede intuir cuántas unidades catalíticas
posee la enzima?
 Ubique al análogo del ATP (ANP). ¿En qué parte de la enzima se ubica? ¿Qué función tiene?
 ¿Qué tipo de interacciones establecerán la glucosa y el ANP con la proteína?
 Determine, usando la opción de libreto, a qué organismo pertenece la proteína y con qué
resolución se determinó la estructura.
Problema:
Responda las siguientes preguntas para las dos enzimas arriba propuestas. Para responderlas,
puede ingresar a las siguientes páginas web: brenda.bc.uni-koeln.de, y www.expasy.org/enzyme/
1. Indique la nomenclatura internacional para la enzima.
2. Indique sus parámetros funcionales: Km, Ki, pH óptimo y el Kcat (turnover number).
3. Indique un cofactor y un inhibidor para la enzima.
Secuencias de Proteínas y Evolución:
Si dos especies están estrechamente relacionadas en términos de evolución, entonces las
secuencias de sus genes y proteínas deberían ser similares. Las secuencias divergen grandemente
cuando la distancia evolutiva entre dos organismos también aumenta.
Con la venida de los proyectos de genomas que abarcan desde bacterias hasta el humano, el
número de secuencias disponibles es enorme. Esta información puede ser usada para trazar la historia
biológica.
El reto está en aprender a utilizar los términos y las herramientas informáticas que nos
permitan hacer los análisis respectivos. Por ejemplo, las similitudes en secuencia y función de dos
proteínas, las ubicarán dentro de una misma familia de proteínas y se llamarán proteínas homólogas.
Si dos proteínas de una familia (es decir, homólogas), están presentes en la misma especie se llaman
parálogas. Si están en diferentes especies se llaman ortólogas.