CENTRO NACIONAL DE BIOPREPARADOS XVI FORUM DE CIENCIA Y TECNICA Título: Aumento de la capacidad de producción del ior-LeukoCIM en el BioCen, sobrecumplimiento de la producción en el 2004. Autores: Marco A. Alvarez Soto Julio C. Mayo Aquiles Yoel Perea Martínez Gabriel González García Ángel Rafael Meneses García José Denis Cuevas Díaz Ernesto Fernández Díaz Alledyne Rodríguez Hernandez Maria Digna Hernández Youdelin Rivero Blanco Tomás Pérez Fernández Anddis Molliner Rodríguez Hanoy Suñol Vázquez Michael Machado Vega Lourdes Chi Ramírez Jorge Luís Contreras Lázaro Gutiérrez Pendas Yadnahy González Foyedo Oscar Gracial Videaux Mireya Carus 1 1. Resumen. Se logra estabilizar la producción del Ingrediente Farmacéutico Activo G-CSF (LeukoCIM®) obteniéndose lotes de más de 2 000 dosis como promedio y producir mas 80 248 dosis para sobre-cumplir el primer plan. El aporte productivo permite ahora cubrir todas las necesidades de los pacientes en Cuba y exportarlo, logrando así la recaudación de importantes cantidades de divisas. Este producto, es de importancia social como tratamiento de apoyo a los pacientes de cáncer que reciben quimioterapia, en especial importante en oncopediatría, pues muchos tumores de los niños son curables con quimioterapia, si se logra las dosis y plazos óptimos, lo cual es facilitado al disponer del LeukoCIM®. Este producto no estaba antes disponible para todos los pacientes cubanos, por su origen norteamericano y por su alto precio. Al analizar la eficiencia productiva por etapas se evidenció que, en la etapa de Fermentación se concluyó con pérdidas del 11 % superando el 20 % estimado, de los 111 lotes de Cuerpos de Inclusión procesados, ninguno fue rechazado cumpliendo así las especificaciones de calidad. En la etapa de purificación del ingrediente farmacéutico activo (IFA) se realizaron 39 lotes de ellos solo 4 fueron rechazados, para un 90% de eficiencia. Lo anterior se encuentra incluido en el logro institucional # 5 “Cumplimiento en tiempo y cantidad de los planes de producción de G-CSF (80,248 dosis) para un sobre-cumplimiento del 105 %. Se estabilizó la producción de IFA obteniéndose lotes de más de 2 000 dosis como promedio”. 2 2. Introducción. El factor estimulante de colonias granulocíticas, conocido como G-CSF por sus siglas en ingles, de nombre genérico filgrastin, es un producto biológico clasificado como una citoquina, es una proteína terapéutica elaborado por tecnología de ADN recombinante a partir de una cepa de Echericia Coli en la cual se ha insertado un plásmido para codificar la expresión de la proteína de interés. En el Centro de Inmunología Molecular se realizan procesos fermentativos con células superiores, por lo cual no es posible realizar fermentaciones a partir de bacterias. Por lo anterior; se decidió pasar este resultado científico a BioCen para desarrollar la capacidad productiva. En una primera etapa de producción se comenzó por obtener los cuerpos de inclusión en BioCen, producto intermedio obtenido a partir de la fermentación de la E. coli BL 21 DE3 con el plásmido PET 9ª, modificado por ingeniería genética para expresar el GCSF. Una vez obtenidos los resultados en esta etapa (años 2001-2002), se obtuvo la licencia de producción del CECMED hasta CI para las instalaciones y la inclusión de BioCen en el Registro Sanitario como fabricante de CI del LeukoCIM®, el proceso de purificación se realizó durante esta etapa en el CIM. En el 2003 como estrategia de aumentar las capacidades de producción, se paso a la implementación de la etapa de purificación de los CI para obtener el IFA de rhG-CSF en el BioCen, lográndose también la licencia de producción por parte del CECMED para esta etapa y lograr la homologación del G-CSF producido en el BioCen con el producido en el CIM. Es así que para el 2004 el Centro nos planteo varios objetivos fundamentales: ü Lograr estabilidad y reproducibilidad de la producción en todas sus etapas. ü Aumento de la cantidad de dosis por lotes de IFA. ü Disminución de los lotes rechazados. Como resultado del trabajo realizado en BioCen como único productor de IFA de G-CSF, se hizo posible durante el 2004 duplicar la producción de ior LeukoCIM respecto a las dosis obtenidas durante el 2003 y que había sido un resultado logrado con la producción de dos unidades de purificación una en el CIM y la otra en nuestro centro, para comenzar el suministro a los hospitales y el registro en varios países, con inicio de la comercialización. 3 3. Materiales y Métodos. El proceso de obtención de G-CSF consta de tres grandes etapas: la primera es una fermentación en tanque agitado de la cepa bacteriana de E. Coli que contiene el gen recombinante, la cual conduce a la obtención de Cuerpos de Inclusión luego de extraer las moléculas proteicas, se realiza una Semipurificación para lograr la renaturalización y finalmente una purificación con un paso cromatográfico bajo condiciones apropiadas. En las figuras siguientes se observa la descripción del proceso productivo. fig.1 Diagrama de flujo (G-CSF) etapa de Fermentación fig.2 Diagrama de flujo (G-CSF) etapa de Ruptura fig.3 Diagrama de flujo (G-CSF) etapa de Purificación 4 En la etapa de fermentación se comenzó a realizar las fermentaciones alternativamente por siembra en placas, lo que ha permitido evitar riegos de contaminación en las fermentaciones y la realización de muchas más, con el mismo banco de células de trabajo. En la etapa de ruptura se mejoro la seguridad biológica del proceso, al realizarlo bajo flujo laminar así como la eficiencia en el enfriamiento de la crema de ruptura, durante le paso de ruptura celular al instalarse un intercambiador de calor recuperado de un fermentador que no estaba en uso, para este paso. En la etapa de purificación, se instalo en nuestra planta en el segundo semestre del 2004, un generador de agua para inyección, que evito tener que traer en botellones de 20 L el agua para inyección desde la planta de parenterales, esto humanizo tremendamente el proceso y aumento la seguridad microbiológica al contar con esta agua en la propia área de producción. En la etapa de purificación durante el primer semestre se trabajo en una escala de procesamiento de 30 000 mg de proteínas totales utilizando columnas BPG 100/870 con Sephadex G-25M y XK 50/30, ya para el segundo semestre se comenzó a procesar 60 000 mg de proteínas totales y la utilización de una columna BPG 200/900 para el paso de renaturalización y otra BPG 100/380 para el paso de intercambio iónico, así como una centrífuga de mesa Beckman J-B6, para la precipitación con acetona y otra centrífuga de mesa Beckman J2-21 para la disolución de los cuerpos de inclusión con sarcosyl, que permitió que no existiera contaminación cruzada ya que anteriormente se tenia que utilizar una sola centrifuga para los pasos de ruptura celular y purificación, además se comenzó a trabajar con un cartucho de ultrafilración del doble de área de filtración que el anterior, lo que permitió que disminuyera el tiempo de procesamiento en el paso de concentración formulación. A finales de año se comenzó a filtrar el IFA con una cápsula de filtración Sartobran 150, aumentando, la seguridad en esta parte del proceso al ser filtros listo para el uso y también el recobrado al disminuir el volumen muerto en el filtro. 5 4. Resultados y Discusión. Durante el 2003 se realizaron 139 fermentaciones y se realizaron 109 rupturas, obteniéndose 9 101,5 g de C.I. Para el 2004 en la etapa de fermentación se realizaron 120 fermentaciones y 111 rupturas donde se obtuvieron 7 347 g de C.I. Según los resultados que se muestran en la tabal 1 la eficiencia lograda en la etapa de fermentación continúa siendo la adecuada para este tipo de producción según las referencias internacionales (menos de un 20% de perdidas) y los resultados son reproducibles, lo que evidencia una gran estabilidad en esta etapa de producción. Parámetro Fermentación Año 2003 139 Año 2004 120 % de expresión 16.25 341.88 25.23 17.69 380 20.39 Pureza microbiana del cultivo 12 lotes no cumplen 11 lotes no cumplen Lotes Rechazados 14 (10%) 11 (11%) No lotes procesados Densidad óptica (DO) Gramos de Biomasa Tabla 1 Etapa de Fermentación Para la etapa de ruptura celular también se obtuvo una gran reproducibilidad entre los dos años de trabajo como se observa en la tabla 2 y en el 2004 no se rechazo ningún lote por roturas en el equipamiento como en el año anterior, a pesar de continuar presentando problemas de fallas en el homogenizador de alta presión utilizado para esta parte de proceso. Parámetro Ruptura No lotes procesados Gramos de cuerpo de inclusión/lotes Gramos de cuerpo de inclusión totales Concentración de proteínas totales El % de pureza en la ruptura Concentración de proteínas de interés Peso del sedimento húmedo por litros de fermentación Lotes Rechazados Año 2003 Año 2004 109 83.9 g 9145,1 234.77 mg/g 70.77 % 168.12 mg/g 4.2 g/L 111 68.7 g 7625,7 222.7 mg/g 65.8 % 147.6 mg/g 3.4 g/L 2 (1.4%) 0 (0%) Tabla 2 Etapa de Ruptura En el 2003 los cuerpos de inclusión utilizados al realizarse la purificación para obtener el IFA solo produjeron 37 631 dosis entre las dos unidades de producción (CIM y BioCen), debido a que en la unidad de purificación del CIM solo se obtenía 6 dosis por gramo de cuerpo de inclusión y en la nuestra a pesar de ser mas eficiente al obtener 18 dosis/g CI solo se realizaron 14 lotes en el año. 6 En el 2004 todos los cuerpos de inclusión producidos se utilizaron en nuestro centro y es así que en la etapa de purificación se aumento en 6.8 veces el total de dosis producidas en el BioCen al poder realizar 39 lotes de purificados (80,248 dosis), además al trabajar con columnas de mayor tamaño se duplico las dosis por lotes producidos. Se disminuyo en un 38% los lotes rechazados al contar con las facilidades del agua para inyección y de centrifugas dedicadas dentro del área de purificación. Asimismo se logro aumentar un 10% el recobrado en el paso de filtración esterilizante y se disminución tremendamente la contaminación en el eluato de intercambio iónico. Parámetro Purificación No lotes procesados Año 2003 14 6.8 % 83.3 % 46 % No cumplen :1 Media 98.11 % No cumplen: 0 No cumplen: 8(57%) 95.7 % 80.0 % Año 2004 39 7.3 % 73.02 % 36.5 % No cumplen.0 Media 100 % No cumplen: 0No cumplen: 3(7.8%) 93.1 % 89.9 % No cumplen:1 No cumplen: 1 No cumplen: 0 No cumplen: 0 No cumplen :2 No cumplen :1 1074 No cumplen: 4 No cumplen: 1 No cumplen: 2 No cumplen: 2 No cumplen: 0 No cumplen: 1 2452 80 248 19 5 (13 %) Recobrado en el paso de renaturalización Pureza por electroforesis SDS-PAGE en G25 Recobrado en el paso de intercambio iónico(I.I.) Pureza por electroforesis SDS-PAGE en el eluato de intercambio iónico Cantidad de proteína en el eluato de I.I. Contaminación microbiana en el eluato de I.I Recobrado de concentración formulación Recobrado en el paso de filtración esterilizante. En el Ingrediente Farmacéutico Activo: Concentración de proteínas: pH Pureza por cromatografía de Fase Reversa y Gel Filtración Esterilidad: Pirógeno: Dosis /lotes Total de dosis 10 925 18 Dosis/ g Cuerpo de Inclusión 3 (21 %) Total de lotes rechazados Tabla 3 Etapa de purificación. G-CSF Dosis Producidas Biocen 2003 10925 BioCen 2004 80248 CiM BioCen 2003 37631 1 fig. 4 Aumento de la producción entre el 2003 y el 2004 7 5. Valoración Económica Como resultado de la venta del IFA de G-CSF del BioCen al Centro de Inmunología Molecular (CIM) nuestro centro ha recibido: Año Dosis $ (pesos) 2003 10 925 186 818 2004 80 248 1 372 240,8 Este resultado de dosis obtenidas, junto con otros productos biotecnológicos del Centro de Inmunología Molecular, le permitió facturar al CIM más de 10 millones en divisas, con un sobrecumplimiento del plan para el 2004. Aspecto social Este producto, significativo como tratamiento de apoyo a los pacientes de cáncer que reciben quimioterapia, es especialmente importante en oncopediatría, pues muchos tumores de los niños son curables con quimioterapia, si se logra dar esta en las dosis y plazos óptimos, lo cual es facilitado al disponer del LeukoCim para recuperar las neutropenias. Este producto no estaba antes disponible para los pacientes cubanos, por su origen norteamericano y por su alto precio. Comentario [M1]: La neutropenia es una condición que ocurre cuando el conteo de neutrófilos cae por debajo del rango normal de 9 aproximadamente 1.5 * 10 /litros. Una de las principales aplicaciones de la terapia con G-CSF está basada en disminuir la neutropenia. Esta condición está presente en una amplia variedad de enfermedades. El G-CSF puede disminuir el periodo de neutropenia o prevenir este completamente. El tratamiento con G-CSF puede facilitar un esquema de dosis de altas intensidades de quimoterapia, las cuales pudieran dar mejores efectos antitumorales (Herman et al., 1996). 8 6. Conclusiones. ü Se logró duplicar la producción del G-CSF (iorLeukoCIM) en el país respecto al 2003, realizándose todo el proceso de obtención del IFA en el BioCen. ü Se logró estabilidad y reproducibilidad en todas las etapas del proceso productivo. ü Se logró una disminución de los lotes rechazados en las distintas partes del proceso. ü Se aumentó la cantidad de dosis por lotes de IFA, producto del aumento en la capacidad de producción de la etapa de Purificación. 9 7. Avales LOGROS 2004 BioCen 1- Renovación de la certificación del sistema para la ISO 9001:2000. Mantenimiento de la Certificación por 6 años. 2- Renovación de la certificación de la contabilidad del Centro. Calificación de SATISFACTORIO avalado por el Ministerio de Finanzas y Precios. 3- Introducción en la Planta de Parenterales 2 de la producción en campaña de EPOCIM y Quimi-Hib. Obtención de la licencia de producción. 4- Cumplimiento de los planes de producción para la Vacuna HB. Se produjeron más de 15 millones de dosis (por primera vez se termina con niveles de stock). 5- Cumplimiento en tiempo y cantidad de los planes de producción de GCSF (80,248 dosis) para un sobrecumplimiento del 105 %. Se estabilizó la producción de IFA obteniéndose lotes de más de 2 000 dosis como promedio. 6- Obtención de la Licencia de Producción de Heberitro (EPO) en PPP1. 7- Se ejecutó la producción de más de 370,000 dosis de vacuna DPT del Instituto Finlay garantizando el abastecimiento del mercado nacional. 8- Se produjeron más de 750,000 dosis (equivalentes de 2 000 UI) de EPOCIM, para el contrato de FioCruz (Brasil). 9- Cumplimiento de la demanda de extractos alergénicos financiada por el MINSAP. 10- Producción de Quimi-Hib. Cumplimiento de la demanda (1,065,301 dosis). 11- Producción de Trivac-HB. Cumplimiento de la demanda (436 390 dosis). 12- Mantenimiento de las Licencias de Producción para las plantas de productos Parenterales 1 y 2 13- Participación en la obtención del registro de Quimi-Hib y TRIVAC-HB. 14- Renovación de la Licencia de Producción de Trofín. 15- Sobrecumplimiento de plan de facturación e ingresos por ventas en plaza (divisas) de Medios de Cultivos y Trofin. 16- Se concluyeron exitosamente los ensayos clínicos de 3 vacunas terapéuticas convencionales contra los ácaros del polvo. 17- Se otorgó el Premio Nacional de Propiedad Industrial de la OCPI al reconstituyente Trofin. 18- Participación en el colectivo de autores que logró el premio relevante único de la ciencia otorgado por la Universidad de la Habana al desarrollo de la primera vacuna humana con un antígeno sintético (Hib). 10 11 / http://www.granma.cubasi.cu / en: http://www.granma.cubaweb.cu http://granma.co.cu CANAL RSSXML El arte de conquistar mercados (25 de marzo de 2004) Orfilio Peláez Para asombro de la comunidad internacional, los productos de la biotecnología cubana comienzan a ganar espacio en ese complejo mercado controlado por las grandes compañías farmacéuticas del Primer Mundo… Precisamente, CIMAB S.A. acaba de recibir el Premio Nacional al Exportador en la categoría de Empresa Mediana, estímulo que anualmente entrega el Ministerio de Comercio Exterior… Entre los productos con mayores ventas al mercado externo figuran la Eritropoyetina Humana Recombinante (ior EPOCIM), una glicoproteína indicada para el tratamiento de la anemia por diferentes causas como puede ser la insuficiencia renal crónica, y el llamado Factor Estimulante de Formación de Colonias Granulocíticas Recombinante (ior LeuKoCim), que eleva los leucocitos y con ello la capacidad de los pacientes para asimilar los tratamientos de quimioterapia… 12