CENTRO NACIONAL DE BIOPREPARADOS XVI FORUM DE CIENCIA Y TECNICA

CENTRO NACIONAL DE BIOPREPARADOS
XVI FORUM DE CIENCIA Y TECNICA
Título:
Aumento de la capacidad de producción del
ior-LeukoCIM en el BioCen, sobrecumplimiento
de la producción en el 2004.
Autores:
Marco A. Alvarez Soto
Julio C. Mayo Aquiles
Yoel Perea Martínez
Gabriel González García
Ángel Rafael Meneses García
José Denis Cuevas Díaz
Ernesto Fernández Díaz
Alledyne Rodríguez Hernandez
Maria Digna Hernández
Youdelin Rivero Blanco
Tomás Pérez Fernández
Anddis Molliner Rodríguez
Hanoy Suñol Vázquez
Michael Machado Vega
Lourdes Chi Ramírez
Jorge Luís Contreras
Lázaro Gutiérrez Pendas
Yadnahy González Foyedo
Oscar Gracial Videaux
Mireya Carus
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1. Resumen.
Se logra estabilizar la producción del Ingrediente Farmacéutico Activo G-CSF (LeukoCIM®)
obteniéndose lotes de más de 2 000 dosis como promedio y producir mas 80 248 dosis para
sobre-cumplir el primer plan. El aporte productivo permite ahora cubrir todas las necesidades
de los pacientes en Cuba y exportarlo, logrando así la recaudación de importantes cantidades
de divisas.
Este producto, es de importancia social como tratamiento de apoyo a los pacientes de cáncer
que reciben quimioterapia, en especial importante en oncopediatría, pues muchos tumores de
los niños son curables con quimioterapia, si se logra las dosis y plazos óptimos, lo cual es
facilitado al disponer del LeukoCIM®. Este producto no estaba antes disponible para todos los
pacientes cubanos, por su origen norteamericano y por su alto precio.
Al analizar la eficiencia productiva por etapas se evidenció que, en la etapa de Fermentación
se concluyó con pérdidas del 11 % superando el 20 % estimado, de los 111 lotes de Cuerpos
de Inclusión procesados, ninguno fue rechazado cumpliendo así las especificaciones de
calidad. En la etapa de purificación del ingrediente farmacéutico activo (IFA) se realizaron 39
lotes de ellos solo 4 fueron rechazados, para un 90% de eficiencia.
Lo anterior se encuentra incluido en el logro institucional # 5 “Cumplimiento en tiempo y
cantidad de los planes de producción de G-CSF (80,248 dosis) para un sobre-cumplimiento
del 105 %. Se estabilizó la producción de IFA obteniéndose lotes de más de 2 000 dosis como
promedio”.
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2. Introducción.
El factor estimulante de colonias granulocíticas, conocido como G-CSF por sus siglas en
ingles, de nombre genérico filgrastin, es un producto biológico clasificado como una
citoquina, es una proteína terapéutica elaborado por tecnología de ADN recombinante a partir
de una cepa de Echericia Coli en la cual se ha insertado un plásmido para codificar la
expresión de la proteína de interés.
En el Centro de Inmunología Molecular se realizan procesos fermentativos con células
superiores, por lo cual no es posible realizar fermentaciones a partir de bacterias. Por lo
anterior; se decidió pasar este resultado científico a BioCen para desarrollar la capacidad
productiva. En una primera etapa de producción se comenzó por obtener los cuerpos de
inclusión en BioCen, producto intermedio obtenido a partir de la fermentación de la E. coli
BL 21 DE3 con el plásmido PET 9ª, modificado por ingeniería genética para expresar el GCSF. Una vez obtenidos los resultados en esta etapa (años 2001-2002), se obtuvo la licencia
de producción del CECMED hasta CI para las instalaciones y la inclusión de BioCen en el
Registro Sanitario como fabricante de CI del LeukoCIM®, el proceso de purificación se
realizó durante esta etapa en el CIM. En el 2003 como estrategia de aumentar las capacidades
de producción, se paso a la implementación de la etapa de purificación de los CI para obtener
el IFA de rhG-CSF en el BioCen, lográndose también la licencia de producción por parte del
CECMED para esta etapa y lograr la homologación del G-CSF producido en el BioCen con el
producido en el CIM.
Es así que para el 2004 el Centro nos planteo varios objetivos fundamentales:
ü Lograr estabilidad y reproducibilidad de la producción en todas sus etapas.
ü Aumento de la cantidad de dosis por lotes de IFA.
ü Disminución de los lotes rechazados.
Como resultado del trabajo realizado en BioCen como único productor de IFA de G-CSF, se
hizo posible durante el 2004 duplicar la producción de ior LeukoCIM respecto a las dosis
obtenidas durante el 2003 y que había sido un resultado logrado con la producción de dos
unidades de purificación una en el CIM y la otra en nuestro centro, para comenzar el
suministro a los hospitales y el registro en varios países, con inicio de la comercialización.
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3. Materiales y Métodos.
El proceso de obtención de G-CSF consta de tres grandes etapas: la primera es una
fermentación en tanque agitado de la cepa bacteriana de E. Coli que contiene el gen
recombinante, la cual conduce a la obtención de Cuerpos de Inclusión luego de extraer las
moléculas proteicas, se realiza una Semipurificación para lograr la renaturalización y
finalmente una purificación con un paso cromatográfico bajo condiciones apropiadas. En las
figuras siguientes se observa la descripción del proceso productivo.
fig.1 Diagrama de flujo (G-CSF) etapa de Fermentación
fig.2 Diagrama de flujo (G-CSF) etapa de Ruptura
fig.3 Diagrama de flujo (G-CSF) etapa de Purificación
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En la etapa de fermentación se comenzó a realizar las fermentaciones alternativamente por
siembra en placas, lo que ha permitido evitar riegos de contaminación en las fermentaciones y
la realización de muchas más, con el mismo banco de células de trabajo.
En la etapa de ruptura se mejoro la seguridad biológica del proceso, al realizarlo bajo flujo
laminar así como la eficiencia en el enfriamiento de la crema de ruptura, durante le paso de
ruptura celular al instalarse un intercambiador de calor recuperado de un fermentador que no
estaba en uso, para este paso.
En la etapa de purificación, se instalo en nuestra planta en el segundo semestre del 2004, un
generador de agua para inyección, que evito tener que traer en botellones de 20 L el agua para
inyección desde la planta de parenterales, esto humanizo tremendamente el proceso y
aumento la seguridad microbiológica al contar con esta agua en la propia área de producción.
En la etapa de purificación durante el primer semestre se trabajo en una escala de
procesamiento de 30 000 mg de proteínas totales utilizando columnas BPG 100/870 con
Sephadex G-25M y XK 50/30, ya para el segundo semestre se comenzó a procesar 60 000 mg
de proteínas totales y la utilización de una columna BPG 200/900 para el paso de
renaturalización y otra BPG 100/380 para el paso de intercambio iónico, así como una
centrífuga de mesa Beckman J-B6, para la precipitación con acetona y otra centrífuga de mesa
Beckman J2-21 para la disolución de los cuerpos de inclusión con sarcosyl, que permitió que
no existiera contaminación cruzada ya que anteriormente se tenia que utilizar una sola
centrifuga para los pasos de ruptura celular y purificación, además se comenzó a trabajar con
un cartucho de ultrafilración del doble de área de filtración que el anterior, lo que permitió
que disminuyera el tiempo de procesamiento en el paso de concentración formulación. A
finales de año se comenzó a filtrar el IFA con una cápsula de filtración Sartobran 150,
aumentando, la seguridad en esta parte del proceso al ser filtros listo para el uso y también el
recobrado al disminuir el volumen muerto en el filtro.
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4. Resultados y Discusión.
Durante el 2003 se realizaron 139 fermentaciones y se realizaron 109 rupturas, obteniéndose
9 101,5 g de C.I. Para el 2004 en la etapa de fermentación se realizaron 120 fermentaciones y
111 rupturas donde se obtuvieron 7 347 g de C.I. Según los resultados que se muestran en la
tabal 1 la eficiencia lograda en la etapa de fermentación continúa siendo la adecuada para este
tipo de producción según las referencias internacionales (menos de un 20% de perdidas) y los
resultados son reproducibles, lo que evidencia una gran estabilidad en esta etapa de
producción.
Parámetro
Fermentación
Año 2003
139
Año 2004
120
% de expresión
16.25
341.88
25.23
17.69
380
20.39
Pureza microbiana del
cultivo
12 lotes no cumplen
11 lotes no cumplen
Lotes Rechazados
14 (10%)
11 (11%)
No lotes procesados
Densidad óptica (DO)
Gramos de Biomasa
Tabla 1 Etapa de Fermentación
Para la etapa de ruptura celular también se obtuvo una gran reproducibilidad entre los dos
años de trabajo como se observa en la tabla 2 y en el 2004 no se rechazo ningún lote por
roturas en el equipamiento como en el año anterior, a pesar de continuar presentando
problemas de fallas en el homogenizador de alta presión utilizado para esta parte de proceso.
Parámetro
Ruptura
No lotes procesados
Gramos de cuerpo de inclusión/lotes
Gramos de cuerpo de inclusión totales
Concentración de proteínas totales
El % de pureza en la ruptura
Concentración de proteínas de interés
Peso del sedimento húmedo por litros de
fermentación
Lotes Rechazados
Año 2003
Año 2004
109
83.9 g
9145,1
234.77 mg/g
70.77 %
168.12 mg/g
4.2 g/L
111
68.7 g
7625,7
222.7 mg/g
65.8 %
147.6 mg/g
3.4 g/L
2 (1.4%)
0 (0%)
Tabla 2 Etapa de Ruptura
En el 2003 los cuerpos de inclusión utilizados al realizarse la purificación para obtener el IFA
solo produjeron 37 631 dosis entre las dos unidades de producción (CIM y BioCen), debido a
que en la unidad de purificación del CIM solo se obtenía 6 dosis por gramo de cuerpo de
inclusión y en la nuestra a pesar de ser mas eficiente al obtener 18 dosis/g CI solo se
realizaron 14 lotes en el año.
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En el 2004 todos los cuerpos de inclusión producidos se utilizaron en nuestro centro y es así
que en la etapa de purificación se aumento en 6.8 veces el total de dosis producidas en el
BioCen al poder realizar 39 lotes de purificados (80,248 dosis), además al trabajar con
columnas de mayor tamaño se duplico las dosis por lotes producidos. Se disminuyo en un
38% los lotes rechazados al contar con las facilidades del agua para inyección y de centrifugas
dedicadas dentro del área de purificación. Asimismo se logro aumentar un 10% el recobrado
en el paso de filtración esterilizante y se disminución tremendamente la contaminación en el
eluato de intercambio iónico.
Parámetro
Purificación
No lotes procesados
Año 2003
14
6.8 %
83.3 %
46 %
No cumplen :1
Media 98.11 %
No cumplen: 0
No cumplen: 8(57%)
95.7 %
80.0 %
Año 2004
39
7.3 %
73.02 %
36.5 %
No cumplen.0
Media 100 %
No cumplen: 0No cumplen: 3(7.8%)
93.1 %
89.9 %
No cumplen:1
No cumplen: 1
No cumplen: 0
No cumplen: 0
No cumplen :2
No cumplen :1
1074
No cumplen: 4
No cumplen: 1
No cumplen: 2
No cumplen: 2
No cumplen: 0
No cumplen: 1
2452
80 248
19
5 (13 %)
Recobrado en el paso de renaturalización
Pureza por electroforesis SDS-PAGE en G25
Recobrado en el paso de intercambio iónico(I.I.)
Pureza por electroforesis SDS-PAGE en el
eluato de intercambio iónico
Cantidad de proteína en el eluato de I.I.
Contaminación microbiana en el eluato de I.I
Recobrado de concentración formulación
Recobrado en el paso de filtración esterilizante.
En el Ingrediente Farmacéutico Activo:
Concentración de proteínas:
pH
Pureza por cromatografía de Fase Reversa y
Gel Filtración
Esterilidad:
Pirógeno:
Dosis /lotes
Total de dosis
10 925
18
Dosis/ g Cuerpo de Inclusión
3 (21 %)
Total de lotes rechazados
Tabla 3 Etapa de purificación.
G-CSF Dosis Producidas
Biocen
2003
10925
BioCen
2004
80248
CiM BioCen
2003
37631
1
fig. 4 Aumento de la producción entre el 2003 y el 2004
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5. Valoración Económica
Como resultado de la venta del IFA de G-CSF del BioCen al Centro de Inmunología
Molecular (CIM) nuestro centro ha recibido:
Año
Dosis
$ (pesos)
2003
10 925
186 818
2004
80 248
1 372 240,8
Este resultado de dosis obtenidas, junto con otros productos biotecnológicos del Centro de
Inmunología Molecular, le permitió facturar al CIM más de 10 millones en divisas, con un
sobrecumplimiento del plan para el 2004.
Aspecto social
Este producto, significativo como tratamiento de apoyo a los pacientes de
cáncer que reciben quimioterapia, es especialmente importante en
oncopediatría, pues muchos tumores de los niños son curables con
quimioterapia, si se logra dar esta en las dosis y plazos óptimos, lo cual es
facilitado al disponer del LeukoCim para recuperar las neutropenias. Este
producto no estaba antes disponible para los pacientes cubanos, por su origen
norteamericano y por su alto precio.
Comentario [M1]: La
neutropenia es una condición
que ocurre cuando el conteo de
neutrófilos cae por debajo del
rango normal de
9
aproximadamente 1.5 * 10
/litros. Una de las principales
aplicaciones de la terapia con
G-CSF está basada en
disminuir la neutropenia. Esta
condición está presente en una
amplia variedad de
enfermedades. El G-CSF
puede disminuir el periodo de
neutropenia o prevenir este
completamente. El tratamiento
con G-CSF puede facilitar un
esquema de dosis de altas
intensidades de quimoterapia,
las cuales pudieran dar mejores
efectos antitumorales (Herman
et al., 1996).
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6. Conclusiones.
ü Se logró duplicar la producción del G-CSF (iorLeukoCIM) en el país respecto al
2003, realizándose todo el proceso de obtención del IFA en el BioCen.
ü Se logró estabilidad y reproducibilidad en todas las etapas del proceso productivo.
ü Se logró una disminución de los lotes rechazados en las distintas partes del proceso.
ü Se aumentó la cantidad de dosis por lotes de IFA, producto del aumento en la
capacidad de producción de la etapa de Purificación.
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7. Avales
LOGROS 2004 BioCen
1- Renovación de la certificación del sistema para la ISO 9001:2000.
Mantenimiento de la Certificación por 6 años.
2- Renovación de la certificación de la contabilidad del Centro. Calificación de
SATISFACTORIO avalado por el Ministerio de Finanzas y Precios.
3- Introducción en la Planta de Parenterales 2 de la producción en campaña de
EPOCIM y Quimi-Hib. Obtención de la licencia de producción.
4- Cumplimiento de los planes de producción para la Vacuna HB. Se produjeron
más de 15 millones de dosis (por primera vez se termina con niveles de
stock).
5- Cumplimiento en tiempo y cantidad de los planes de producción de
GCSF (80,248 dosis) para un sobrecumplimiento del 105 %. Se estabilizó
la producción de IFA obteniéndose lotes de más de 2 000 dosis como
promedio.
6- Obtención de la Licencia de Producción de Heberitro (EPO) en PPP1.
7- Se ejecutó la producción de más de 370,000 dosis de vacuna DPT del
Instituto Finlay garantizando el abastecimiento del mercado nacional.
8- Se produjeron más de 750,000 dosis (equivalentes de 2 000 UI) de EPOCIM,
para el contrato de FioCruz (Brasil).
9- Cumplimiento de la demanda de extractos alergénicos financiada por el
MINSAP.
10- Producción de Quimi-Hib. Cumplimiento de la demanda (1,065,301 dosis).
11- Producción de Trivac-HB. Cumplimiento de la demanda (436 390 dosis).
12- Mantenimiento de las Licencias de Producción para las plantas de productos
Parenterales 1 y 2
13- Participación en la obtención del registro de Quimi-Hib y TRIVAC-HB.
14- Renovación de la Licencia de Producción de Trofín.
15- Sobrecumplimiento de plan de facturación e ingresos por ventas en plaza
(divisas) de Medios de Cultivos y Trofin.
16- Se concluyeron exitosamente los ensayos clínicos de 3 vacunas terapéuticas
convencionales contra los ácaros del polvo.
17- Se otorgó el Premio Nacional de Propiedad Industrial de la OCPI al
reconstituyente Trofin.
18- Participación en el colectivo de autores que logró el premio relevante único de
la ciencia otorgado por la Universidad de la Habana al desarrollo de la
primera vacuna humana con un antígeno sintético (Hib).
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El arte de conquistar mercados (25 de marzo de 2004)
Orfilio Peláez
Para asombro de la comunidad internacional, los productos de la biotecnología cubana
comienzan a ganar espacio en ese complejo mercado controlado por las grandes compañías
farmacéuticas del Primer Mundo…
Precisamente, CIMAB S.A. acaba de recibir el Premio Nacional al Exportador en la categoría
de Empresa Mediana, estímulo que anualmente entrega el Ministerio de Comercio Exterior…
Entre los productos con mayores ventas al mercado externo figuran la Eritropoyetina
Humana Recombinante (ior EPOCIM), una glicoproteína indicada para el tratamiento de la
anemia por diferentes causas como puede ser la insuficiencia renal crónica, y el llamado
Factor Estimulante de Formación de Colonias Granulocíticas Recombinante (ior
LeuKoCim), que eleva los leucocitos y con ello la capacidad de los pacientes para
asimilar los tratamientos de quimioterapia…
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