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Inhibición enzimática La actividad de una enzima puede ser disminuida o eliminada completamente por la acción de ciertas sustancias a las cuales se las conoce con el nombre genérico de inhibidores enzimáticos. Debemos aclarar que no deben ser incluidos en este grupo de sustancias, aquellos agentes que producen simplemente una destrucción irreversible de la enzima, como podrían ser todos aquellos que conducen a su desnaturalización, como por ejemplo los ácidos fuertes. La inhibición enzimática es de gran importancia fisiológica, ya que a veces la inhibición de una sola enzima que forma parte de una cadena de reacciones metabólicas puede inhibir por completo a todo el proceso metabólico involucrado y ejercer en esa forma un efecto profundo y a veces fatal sobre el organismo. De más está recalcar la importancia que este fenómeno tiene en farmacología y toxicología como así también en el desarrollo de herbicidas e insecticidas. De ahí que el estudio del mecanismo de acción de los inhibidores se haya constituido en una de las más exploradas de la enzimología práctica. Los inhibidores pueden clasificarse en dos grandes grupos: 1) Irreversibles. 2) Reversibles i) competitivos ii) no competitivos En el primer caso la enzima no recobra su actividad por remoción del inhibidor libre. Esto es debido a que el inhibidor irreversible, actúa por lo general modificando irreversiblemente o aún destruyendo algunos de los grupos esenciales del centro activo. En el segundo caso, la enzima recobra su actividad por remoción del inhibidor libre (por ejemplo por simple diálisis). Lo cual demuestra que hay un equilibrio entre el inhibidor libre y la enzima. Ejemplos de uno y otro tipo de inhibidores los encontramos entre los llamados reactivos de tioles. Estas sustancias tienen la particularidad de reaccionar específicamente con grupos sulfhidrilos de las proteinas, aportados por los grupos laterales correspondientes a los residuos de cisteína. Existen ciertas enzimas que requieren para actuar que algunos de esos grupos sulfhidrilos estén libres. Es evidente que en esos casos los reactivos de tioles, al bloquear los grupos sulfhdrilos esenciales de estas enzimas, pueden actuar como inhibidores. Entre algunos reactivos de tioles podemos mencionar al p-cloromercuribenzoato y el alquilante iodoacetato, que ejemplifican a un inhibidor reversible y aun inhibidor irreversible respectivamente. Ambos reaccionan con los grupos sulfhidrilos libres (-SH) de las proteinas, pero en tanto que el primer lo hace formando un complejo reversible (mercaptida), el segundo forma un carboximetil-derivado de gran estabilidad, incapaz de disociarse. Cl-Hg Enzima COO- ↔ P-cloromecuribenzoato Hg COO- + ClH Enzima inactiva En el primer caso, una vez establecido el equilibrio, si se elimina el pcloromercuribenzoato, la reacción, por el principio de acción en masa, se va a desplazar hacia la izquierda, disociándose el complejo enzima-inhibidor en enzima libre e inhibidor. Si la eliminación es total, toda la enzima recuperará su forma libre activa. En cambio, en el segundo caso, una vez formado el carboximetil-derivado, es imposible disociarlo dada su extraordinaria estabilidad, por ende, la eliminación del exceso del inhibidor será ineficaz para hacer recuperar la actividad original. Otro ejemplo de inhibición irreversible es el representado por los llamados gases neurotóxicos que se desarrollaron durante la 2ª guerra mundial, para ser utilizados como gases de guerra. Son sustancias que reaccionan con el grupo alcohólico del resto lateral correspondiente a la serina de algunas enzimas que tienen un hidroxilo en el centro activo y que es necesario para que la enzima presente actividad. Una enzima de ese tipo es la acetilcolinestearasa que interviene en los procesos de transmisión del impulso nervioso, causando entre otros efectos, parálisis de los músculos estriados. acetilcolinestearasa Acetilcolina + H2O ↔ colina + acetato Una de las primeras sustancias que se utilizó con es fin es el diisopropilfluorofosfato que reacciona con la enzima en la siguiente forma. Se lo utilizó también como insecticida (pertenece al grupo de los organofosforados). Es muy efectivo pero sumamente peligroso por su volatilidad. Vamos ahora a referirnos exclusivamente a la inhibición reversible en la cual el inhibidor también interactúa con algún grupo esencial de la enzima, pero haciéndolo en forma reversible. Las distintas formas de interacciones se traducen en varios tipos de inhibición perfectamente diferenciables experimentalmente. Los dos tipos más comunes son la competitiva y la no competitiva. En la inhibición competitiva el inhibidor se combina reversiblemente con la enzima en el sitio por el cual se debería unir el sustrato, impidiendo por lo tanto la formación del complejo activo enzimasustrato. De ahí el nombre de competitiva porque efectivamente tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y tratan de desplazarse mutuamente de la enzima. Las posibles formas de reaccionar del sustrato y el inhibidor con la enzima pueden presentarse por las ecuaciones: Por ello este tipo de inhibición se caracteriza en que puede disminuirse considerablemente aumentando la concentración de sustrato. En este tipo de inhibidores se incluyen sustancias que estructuralmente son muy parecidas al sustrato y que por lo pueden ocupar el lugar que ocuparía el mismo sobre la enzima pero que no pueden ser atacas por la misma. Un ejemplo clásico de este tipo de inhibición es el de la inhibición de la succinato deshidrogenasa, enzima que tiene por sustrato el ácido succínico, por otras sustancias estructuralmente parecidas al ácido succínico, como el ácido malónico, el ácido oxálico, y el ácido glutárico. Ácido succínico Ácido malónico Ácido oxálico Ácido glutárico En la inhibición no competitiva, se postula que el inhibidor se une con la enzima en otro sitio, que no es aquel por el cual se une el sustrato. Por esa razón la unión del sustrato con la enzima no es afectada por la presencia del inhibidor y se puede formar entones un complejo enzimasustrato-inhibidor. Pero este complejo es catalíticamente inactivo y no puede escindirse en productos de la reacción y complejo enzima-inhibidor. En este caso, las posibles formas de reaccionar del sustrato y el inhibidor con la enzima se representan por las ecuaciones siguientes. Este tipo de inhibición se caracteriza entonces porque no puede ser revertido por un aumento de la concentración de sustrato. El sustrato no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima. Experimentalmente ambos tipos de inhibición pueden distinguirse fundamentalmente mediante la aplicación del método de Lineweaver y Burk antes descripto a la reacción enzimática con y sin inhibidor en cuyos respectivos casos se obtendrán los gráficos indicados en las figuras siguientes. Inhibición competitiva Lineweaver-Burk Michaelis-Menten Vo 1/Vo Vmáx Sin inhibidor con inhibidor sin inhibidor Vmáx/2 1/Vmáx Sin inhibidor Km Km inh 10 (sustrato) 0 -1/Km -1/Km inh 1/(S) Como puede apreciarse en el gráfico, en el caso de la inhibición competitiva la Vmáx para una dada cantidad de enzima no se modifica por el agregado de inhibidor porque agregando una concentración lo suficientemente grande de sustrato se puede desplazar completamente al inhibidor. Sin embargo, el Km aumenta porque la presencia del inhibidor hace que se necesite una mayor cantidad de sustrato para saturar a la enzima que la que se necesitaría si el inhibidor no estuviera presente. En contraposicion a lo anterior, en la inhibición no competitiva, el inhibidor disminuye el valor de la Vmáx sin modificar la Km ya que la unión del sustrato a la enzima no está alterada por la simultánea unión del inhibidor. Inhibición NO competitiva Lineweaver-Burk Michaelis-Menten 1/Vo Vo Vmáx sin inhibidor con inhibidor Vmáx/2 con inhibidor sin inhibidor 1/Vmáx inh Vmáx inh Vmáx inh/2 1/Vmáx Km = Km inh (sustrato) 1/(S) -1/Km En resumen. Tipo de Inhibicion reversible Sitio de unión de la enzima - La unión del substrato y competitiva del inhibidor son mutuamente excluyentes - A muy altas concentraciones de sustrato desaparece la inhibición En presencia del inhibidor - el valor de Km aumenta - Se mantiene el valor de Vmáx - Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del substrato. no competitiva - Se une a un lugar diferente del sitio activo la enzima - El valor de Km se mantiene - Se une a la enzima libre y también al complejo enzima-sustrato - Disminuye el valor de Vmáx esquema Enzimas alostéricas Las enzimas a las cuales nos hemos referido hasta este momento, enzimas michaelianas, corresponden a lo que se ha dado en llamar enzimas clásicas. Pero además existen ciertas enzimas con características regulatorias que poseen propiedades que las distinguen de las primera y que e denominan enzimas alostéricas. Las enzimas alostéricas como las clásicas reconocen y se asocian en su centro activo a un sustrato específico y catalizan su conversión en productos. Pero además estas enzimas tienen la propiedad de reconocer selectivamente a uno o varios compuestos distintos del sustrato cuya asociación reversible con la proteina tiene por efecto modificar su actividad frente al sustrato, ya sea activándolo o inhibiéndolo, sin participar en nada en la reacción en sí. Dichos compuestos que reciben el nombre de efectores o moduladores alostéricos interaccionan con la enzima en un sitio distinto y generalmente distante del centro activo que recibe el nombre de sitio alostérico. Se acepta que la asociación del efector alostérico a la proteina en el sitio alostérico produce una alteración de la configuración espacial de la enzima (transición alostérica) que se transmite al centro activo modificándolo de tal manera que la actividad de la enzima aumenta o disminuye según se trate de un efector o modulador alostérico positivo o negativo respectivamente. Las enzimas alostéricas tienen por lo general una estructura proteica más compleja que la de las enzimas no regulables, están constituídas por subunidades. Además puden responder a la acción de más de un efector alostérico (positivos y negativos), en cuyo caso poseen en su estructura un sitio alostérico distinto para cada uno de ellos. Desde ese punto de vista las enzimas alostéricas pueden clasificar en tres grandes grupos: a) Homotróficas: en las cuales el mismo sustrato puede actual como modulador, generalmente positivo. b) Heterotróficas: aquellas que son moduladas positiva o negativamente por sustancias distintas del sustrato para cada una de las cuales la enzima posee un sitio específico de reconocimiento, y c) Homotróficas-heterotróficas: responden a efectos regulatorios del mismo sustrato y de sustancias distintas del mismo Desde el punto de vista metabólico, estas enzimas, que generalmente catalizan reacciones prácticamente irreversibles, se encuentran ubicadas estratégicamente en ciertos puntos de las vías metabólicas, de tal manera que su regulación coopera en forma efectiva en la economía general de la célula. Así por ejemplo las encontramos como primera enzima de una secuencia de reacciones de tal manera que su activación o inhibición aumente o disminuya respectivamente la velocidad de toda la vía metabólica involucrada de acuerdo a las necesidades de la célula. Modelos para las enzimas alostéricas Se han propuesto algunos modelos para interpretar las interacciones entre la proteina, el sustrato y el o los efectos de las enzimas alostéricas. Entre ellos vamos a describir brevemente los debidos a Monod, Wyman y Changeux (1965) y a Koshland, Nemethy y Filmes (1966). El primero de ellos, conocido con el nombre de modelo concertado simétrico, parte del supuesto de que la proteina regulatoria (oligómero) consiste de dos o más subunidades idénticas (protómeros) que se asocian de tal manera que la molécula posea por lo menos un eje de simetría. Cada subunidad contiene un sitio de unión para cada sustrato y efector manteniéndose la simetría de la molécula. Cada subunidad puede existir en dos estados conformacionales distintos denominados estados R y T, que difieren en la posibilidad que poseen de unirse al o los sustratos y los efectores. Así R tiene afinidad por el sustrato mientras que T tiene baja afinidad por el mismo. La transición de una conformación de una subunidad es concertada con la correspondiente transición en las subunidades vecinas de tal manera que todas las subunidades se encuentren en el mismo estado conformacioneal simultáneamente y la simetría molecular se mantenga. Por otra parte el equilibrio entre la forma R y la forma T, se establece en ausencia de los sustratos y efectores. En la figura se representa esquemáticamente este modelo para una proteina oligométrica constituida por dos subunidades en la cual sustrato S y el efector positivo A se unen sólo al estado R, mientras que el inhibidor I lo hace exclusivamente al estado T. En ausencia de sustrato y activador el equilibrio entre los estados T y R está desplazado hacia el estado T, es decir la mayor parte de las moléculas de la enzima se encuentran al estado T, pero al agregarse el sustrato S o el activador A, y al unirse selectivamente estos ligandos a las moléculas que se encuentran en el estado R, el equilibrio se desplaza en este sentido. Como la transición entre las formas T y R para las subunidades es concertada, es suficiente la unión de la molécula de sustrato o activador a una sola de las subunidades para que la otra quede en la forma R dejando de esa forma disponible otro sitio de más alta afinidad para el sustrato. Cuanto más sustrato o activador se agregue mayor será el número de oligómeros en la forma R, observándose en consecuencia lo que se denomina un efecto coorperativo positivo del estrato y del activador, que se traduce en una curva de saturación sigmoide. En el primer caso (sustrato) y de acuerdo a lo que se indicó anteriormente el efecto será homotrófico cooperativo o positivo y en el segundo caso (activador), heterotrófico cooperativo o positivo. Pero si se agrega activador en cantidad suficiente, el equilibrio quedará totalmente desplazado hacia la forma R, y todas las moléculas del oligómero estarán exclusivamente en esa forma y la adición del sustrato en ese caso, no podrá producir un mayor desplazamiento del equilibrio, comportándose entonces el sistema como un sistema para el cual es válido un tratamiento cinético del tipo MichaelisMenten, obteniéndose entonces una curva de saturación para el sustrato de tipo hiperbólico. En contraste con lo que ocurre con el sustrato y el activador, el inhibidor se une exclusivamente a la forman T. Si debido a la presencia de sustrato en concentración saturante, la enzima se encontraba originalmente casi exclusivamente en el estado R, el agregado de inhibidor producirá un desplazamiento hacia la forma T y por ende la curva de saturación para el sustrato se hará más sigmoide a medida que aumenta la concentración del inhibidor. El efecto en este caso será heterotrófico negativo (del inhibidor con respecto al sustrato). El modelo de Koshland, Nemethy y Filmer también denominado secuencial se basa en la explicada teoría del ajuste inducido. El modelo establece que la unión de un ligando (sustrato, activador o inhibidor) a una de las subunidades de la molécula enzimática oligométrica, produce un cambio conformacional de dicha subunidad. Esa distorsión en una subunidad puede afectar secuencialmente la estabilidad y configuración de las subunidades vecinas, en la misma forma que la distorsión de una parte de una cadena polipeptídica, aumentando o disminuyendo la afinidad de las mismas por el sustrato. La figura siguiente ilustra lo dicho para el caso de una enzima alostérica que posee dos subunidades, cada una de ellas capaz de unirse a una molécula de sustrato y que presenta un efecto homotrófico positivo de S sobre S. En el modelo secuencial las interacciones entre las subunidades son posibles estando las subunidades en distintos estados conformacionales. En el modelo concertado sólo serían posibles los estados AA y BB de la figura anterior y no el híbrido AB, los cuales por otra parte deben preexistir actuando el ligando como estabilizador del estado al cual se une preferencialmente. En cambio el modelo secuencial si bien no descarta la posibilidad extrema de un cambio simultáneo en todas las subunidades, sostiene preferentemente la existencia de cambios secuenciales en la conformación de las subunidades inducidas por la unión del o los ligandos, con la posibilidad de ocurrencia de estados conformacionales híbridos cuando la proteina está parcialmente saturada. Enzimas alostéricas - Las enzimas alostéricas presentan estructura cuaternaria. - Tienen diferentes sitios activos, unen más de una molécula de sustrato - La unión del sustrato es cooperativa - La curva de velocidad en función de la (s) presenta una forma sigmoidea - Pequeños cambios en la concentración del modulador se asocian con grandes cambios en la actividad de la enzima Regulación enzimática Cuanto más se avanza en el conocimiento de la bioquímica celular, especialmente por los aportes hechos en los últimos años por la biología molecular, más se afianza el concepto enunciado oportunamente por Changeux, de equiparar el funcionamiento de una célula al de una “verdadera fábrica química automática diseñada para aprovechar lo más eficientemente la energía disponible”. En efecto, en una fábrica automática coexisten varias líneas de producción que trabajan simultáneamente en forma concertada y que se regulan a sí mismas y entre ellas por medio de controles automáticos, consistentes en circuitos electrónicos específicos de retroalimentación. Estos principios pueden aplicarse también a los seres vivos, Así, el funcionamiento de la célula más sencilla, implica la existencia de una verdadera maraña de procesos metabólicos consistentes en secuencias de reacciones químicas catalizadas por enzimas específicas. Cada una de estas vías metabólicas sería equiparable a las mencionadas líneas de producción de la fábrica automática y las máquinas elementales de la fábrica celular serían las mencionadas enzimas. Existen en principio cuatro formas posibles de que la célula controle la velocidad de funcionamiento de dichas vías metabólicas: 1) DISPONIBILIDAD DE SUSTRATO Como ya hemos indicado, la actividad de la enzima guarda proporcionalidad con los niveles de sustrato. Estos determinan la mayor o menor velocidad en la actividad enzimática. Al aumentar la concentración de sustrato, en la célula aumenta su utilización y viceversa. Generalmete el sustrato debe ingresar a la célula o al interior de una organela. Ejemplo: β-oxidación y síntesis de cuerpos cetónicos. 2) MODIFICACIÓN COVALENTE Muchas enzimas son reguladas por el agregado o sustracción de grupos unidos covalentemente a la misma. La regulación covalente más frecuente se realiza por modificación de los residuos de tirosina, serina y/o treonina de las enzimas por un proceso de unión o eliminación de grupos fosfatos. Existen también enzimas cuya actividad es modulada por la inserción covalente de otros grupos., como se muestra en la siguiente tabla. En la siguente tabla se dan ejemplos de algunas enzimas cuyas actividades estan reguladas por modificación covalente que implica fosfo- desfosforilaciones. 3) MODULACIÓN ALOSTÉRICA. Ya se describió anteriormente. Algunos casos particulares dan origen a diferentes modos regulatorios. En algunas vías metabólicas, la enzima que cataliza la primera etapa de la serie suele ser inhibida por el producto de la última. Cuando la concentración de ese producto final aumenta, ello indica que su elaboración excede las necesidades y se frena el funcionamiento de la vía reduciendo la actividad de la enzima reguladora. Se habla de un proceso de retroinhibición. También puede suceder que una enzima sea estimulada por algún agente que se acumula en el medio. Cuando existe un exceso de sustrato, él mismo promueve su utilización activando a la enzima. E1 E2 E3 E4 S1 → A → B → C → P + E1 E2 E3 E4 S1 → X → Y → Z → P 4) INDUCCIÓN O REPRESIÓN DE LA SINTÉSIS DE LA ENZIMA. Implica el control de la síntesis de las enzimas regulatorias involucradas en un camino metabólico. Se habla entonces de inducción enzimática o represión enzimática según que la velocidad de producción de una dada enzima, o de un conjunto de enzimas metabólicamente relacionadas, y por ende su concentración celular, sea aumentada o disminuída respectivamente como respuesta a las necesidades de la célula, actuando por lo general un metabolito particular como señal desencadenante del proceso. En el caso de la inducción, ese metabolito puede ser el mismo sustrato de la enzima (metabolito inductor), y en la represión, el producto final de la vía metabólica de la cual la enzima reprimida forma parte (metabolito represor). Este mecanismo es mucho más lento que los anteriores ya que implica la síntesis o degradación de las enzimas involucradas.
