Trabajo práctico DNA fingerprinting Introducción. Las características morfológicas y fisiológicas de cada individuo, sea este un ser humano, un animal, una planta o un microorganismo, responden a un patrón único que es su composición hereditaria o genética. Esta identidad genética puede ser evidenciada a través de técnicas de biología molecular que permiten analizar su DNA. Dos estrategias desarrolladas para este fin son la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que permite analizar pequeñas cantidades de DNA, y el análisis del polimorfismo del tamaño de fragmentos de restricción (RFLP), si mayores cantidades de DNA son disponibles. Cada una de estas metodologías nos entrega fragmentos de DNA que luego pueden ser resueltos mediante electroforesis en geles de agarosa con lo cual se forman patrones característicos de cada individuo. Estos perfiles de ADN, únicos por individuo, al igual que las huellas dactilares, pueden tener amplias aplicaciones en medicina forense, análisis de paternidad, medicina diagnóstica o ciencias naturales. Independientemente de si la muestra es obtenida de sangre, bulbo piloso o semen, los patrones de DNA de un individuo son idénticos y además, presentan estabilidad en la línea germinal, por lo que las características correspondientes a un individuo pueden ser identificadas como pertenecientes a uno u otro progenitor. Estos principios de identidad única, heredabilidad e idéntica estructura del DNA dentro de todos los tejidos del mismo individuo son los fundamentos de la técnica de DNA fingerprinting. El análisis de regiones repetidas del genoma de humanos (minisatélites) ha permitido conocer que su tamaño es variable en alelos de diferentes loci genéticos por variaciones en el número de estas repeticiones. Así, cuando DNA de un individuo es aislado y tratado con enzimas de restricción de modo de obtener fragmentos, la observación del tamaño de los mismos arroja un perfil característico y a la vez diferente al de otros individuos (RFLP). El perfil varía considerablemente entre personas no emparentadas. Por lo tanto es posible utilizar esta técnica para la identificación de relaciones familiares con una alta eficiencia. Por comparación de los patrones de DNA fingerprinting de una madre y su hijo es posible identificar los fragmentos de DNA presentes en el hijo que están ausentes en la madre y por lo tanto han sido heredados de su padre biológico. Si un presunto padre no es el padre biológico la mayor parte de las bandas de origen paterno identificadas en el hijo no estarán presentes en su patrón de DNA fingerprinting. Si por el contrario, el presunto padre es el biológico, todas las bandas paternas del hijo corresponderán con bandas en su DNA fingerprinting. Este tipo de análisis en cuestiones legales ha adquirido creciente interés en los últimos años. Aplicaciones forenses por DNA fingerprinting comprenden situaciones de determinación de identidad de sospechosos en homicidios y violaciones, la confirmación de la veracidad de una evidencia y la identificación de un hecho delictivo como aislado o serial. Además, las técnicas modernas de análisis del DNA han abierto un camino de gran interés por sus aplicaciones en medicina, que incluyen aspectos como la determinación del origen genético de mellizos (mono o dicigóticos), el análisis de marcadores para transplante de médula ósea, la identificación de contaminación entre tejidos materno y fetal en análisis de vellosidades coriónicas, la identificación de patógenos y los estudios familiares para el diagnóstico prenatal de enfermedades de interés. En este trabajo práctico, usted deberá aportar evidencia científica que permita la identificación de un criminal por medio de la comparación del DNA de cinco sospechosos con DNA encontrado en la escena del crimen. Para ello deberá proceder a generar patrones de restricción de las muestras de DNA de los sospechosos y del encontrado en la escena del crimen. Objetivos: Conocer los fundamentos de la técnica de DNA fingerprinting Realizar un análisis de RFLP Estudiar las técnicas de restricción y electroforesis de DNA. Procedimiento: 1.- Análisis de restricción: Proceda a tratar las seis muestras de DNA con las enzimas de restricción EcoRI/PstI, según el siguiente protocolo. - Rotule los tubos con su nombre y con la clave siguiente: CS (escena del crimen) y S1 a S5 (sospechosos) Transfiera 10 ul de cada DNA a los tubos del paso anterior Transfiera 10 ul de la mezcla de enzimas a cada tubo. Mezcle. Coloque los tubos en un baño termoregulado a 37 °C por 45 minutos 2.- Electroforesis en gel de agarosa: Una vez transcurrido el tiempo de incubación, realice el análisis de las restricciones según el siguiente protocolo. - Utilizando puntas independientes, agregue 5 ul de la tinción de carga (LD) a cada tubo. Mezcle. Cargue 10 ul del marcador de tamaño molecular en el carril 1 de su gel Cargue 20 ul de cada una de sus muestras en los carriles 2 al 7 del gel. Cuidadosamente cierre la cámara de electroforesis y conecte los cables de energía a la fuente de poder Encienda la fuente de poder y realice la electroforesis a 100 V por 30 minutos Transcurrido el tiempo de corrida, desconecte la fuente de poder - Transfiera cuidadosamente el gel a una bandeja para tinción Agregue 120 ml de una solución 100X de tinción Fast Blast Incube a temperatura ambiente por 2 minutos con agitación suave Recupere el líquido de tinción Transfiera cuidadosamente el gel a una bandeja mayor y agregue agua destilada a 40-55°C. Mantenga así por 10 segundos. Cambie el agua y deje por 5 minutos mas Repita el paso anterior Registre sus resultados 3.- Observación y expresión de resultados. - - Observe el gel proveniente de la corrida electroforética. Determine la similitud de patrones entre los sospechosos y el presente en la escena del crimen. Calcule el tamaño de cada banda presente en los patrones obtenidos, para ello construya una curva estándar de tamaño molecular (kb) vs migración (cm) utilizando papel milimetrado semilogarítmico. Determine los tamaños moleculares de las bandas presentes en todos los carriles.