Trabajo práctico DNA fingerprinting

Trabajo práctico DNA fingerprinting
Introducción.
Las características morfológicas y fisiológicas de cada individuo, sea este
un ser humano, un animal, una planta o un microorganismo, responden a un
patrón único que es su composición hereditaria o genética. Esta identidad genética
puede ser evidenciada a través de técnicas de biología molecular que permiten
analizar su DNA. Dos estrategias desarrolladas para este fin son la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), que permite analizar pequeñas cantidades de
DNA, y el análisis del polimorfismo del tamaño de fragmentos de restricción
(RFLP), si mayores cantidades de DNA son disponibles. Cada una de estas
metodologías nos entrega fragmentos de DNA que luego pueden ser resueltos
mediante electroforesis en geles de agarosa con lo cual se forman patrones
característicos de cada individuo. Estos perfiles de ADN, únicos por individuo, al
igual que las huellas dactilares, pueden tener amplias aplicaciones en medicina
forense, análisis de paternidad, medicina diagnóstica o ciencias naturales.
Independientemente de si la muestra es obtenida de sangre, bulbo piloso o
semen, los patrones de DNA de un individuo son idénticos y además, presentan
estabilidad en la línea germinal, por lo que las características correspondientes a
un individuo pueden ser identificadas como pertenecientes a uno u otro progenitor.
Estos principios de identidad única, heredabilidad e idéntica estructura del DNA
dentro de todos los tejidos del mismo individuo son los fundamentos de la técnica
de DNA fingerprinting.
El análisis de regiones repetidas del genoma de humanos (minisatélites) ha
permitido conocer que su tamaño es variable en alelos de diferentes loci genéticos
por variaciones en el número de estas repeticiones. Así, cuando DNA de un
individuo es aislado y tratado con enzimas de restricción de modo de obtener
fragmentos, la observación del tamaño de los mismos arroja un perfil característico
y a la vez diferente al de otros individuos (RFLP). El perfil varía considerablemente
entre personas no emparentadas. Por lo tanto es posible utilizar esta técnica para
la identificación de relaciones familiares con una alta eficiencia. Por comparación
de los patrones de DNA fingerprinting de una madre y su hijo es posible identificar
los fragmentos de DNA presentes en el hijo que están ausentes en la madre y por
lo tanto han sido heredados de su padre biológico. Si un presunto padre no es el
padre biológico la mayor parte de las bandas de origen paterno identificadas en el
hijo no estarán presentes en su patrón de DNA fingerprinting. Si por el contrario,
el presunto padre es el biológico, todas las bandas paternas del hijo
corresponderán con bandas en su DNA fingerprinting.
Este tipo de análisis en cuestiones legales ha adquirido creciente interés en
los últimos años. Aplicaciones forenses por DNA fingerprinting comprenden
situaciones de determinación de identidad de sospechosos en homicidios y
violaciones, la confirmación de la veracidad de una evidencia y la identificación de
un hecho delictivo como aislado o serial. Además, las técnicas modernas de
análisis del DNA han abierto un camino de gran interés por sus aplicaciones en
medicina, que incluyen aspectos como la determinación del origen genético de
mellizos (mono o dicigóticos), el análisis de marcadores para transplante de
médula ósea, la identificación de contaminación entre tejidos materno y fetal en
análisis de vellosidades coriónicas, la identificación de patógenos y los estudios
familiares para el diagnóstico prenatal de enfermedades de interés.
En este trabajo práctico, usted deberá aportar evidencia científica que
permita la identificación de un criminal por medio de la comparación del DNA de
cinco sospechosos con DNA encontrado en la escena del crimen. Para ello deberá
proceder a generar patrones de restricción de las muestras de DNA de los
sospechosos y del encontrado en la escena del crimen.
Objetivos:

Conocer los fundamentos de la técnica de DNA fingerprinting

Realizar un análisis de RFLP

Estudiar las técnicas de restricción y electroforesis de DNA.
Procedimiento:
1.- Análisis de restricción: Proceda a tratar las seis muestras de DNA con las
enzimas de restricción EcoRI/PstI, según el siguiente protocolo.
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Rotule los tubos con su nombre y con la clave siguiente:
CS (escena del crimen) y S1 a S5 (sospechosos)
Transfiera 10 ul de cada DNA a los tubos del paso anterior
Transfiera 10 ul de la mezcla de enzimas a cada tubo.
Mezcle.
Coloque los tubos en un baño termoregulado a 37 °C por 45 minutos
2.- Electroforesis en gel de agarosa: Una vez transcurrido el tiempo de incubación,
realice el análisis de las restricciones según el siguiente protocolo.
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Utilizando puntas independientes, agregue 5 ul de la tinción de carga (LD) a
cada tubo.
Mezcle.
Cargue 10 ul del marcador de tamaño molecular en el carril 1 de su gel
Cargue 20 ul de cada una de sus muestras en los carriles 2 al 7 del gel.
Cuidadosamente cierre la cámara de electroforesis y conecte los cables de
energía a la fuente de poder
Encienda la fuente de poder y realice la electroforesis a 100 V por 30
minutos
Transcurrido el tiempo de corrida, desconecte la fuente de poder
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Transfiera cuidadosamente el gel a una bandeja para tinción
Agregue 120 ml de una solución 100X de tinción Fast Blast
Incube a temperatura ambiente por 2 minutos con agitación suave
Recupere el líquido de tinción
Transfiera cuidadosamente el gel a una bandeja mayor y agregue agua
destilada a 40-55°C. Mantenga así por 10 segundos.
Cambie el agua y deje por 5 minutos mas
Repita el paso anterior
Registre sus resultados
3.- Observación y expresión de resultados.
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Observe el gel proveniente de la corrida electroforética.
Determine la similitud de patrones entre los sospechosos y el presente en la
escena del crimen.
Calcule el tamaño de cada banda presente en los patrones obtenidos, para
ello construya una curva estándar de tamaño molecular (kb) vs migración
(cm) utilizando papel milimetrado semilogarítmico.
Determine los tamaños moleculares de las bandas presentes en todos los
carriles.