2 Problemas anexos

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Ejercicios de TP anexos
Ejercicio 1
Usted dispone de 3 muestras de tejido de hígado de ratas, siendo 2 de ellos
aparentemente tumorales.
Una de las características de este tipo de tumor, entre otras cosas es que
aparentemente sobreexpresan la proteína AYUDINA.
No se sabe si se trata de amplificación génica (varias copias del mismo gen en
distintas posiciones de un cromosoma) o simplemente un descontrol en la
transcripción del mismo, existiendo una copia única (con sus dos alelos, uno en
cada cromosoma homólogo).
Para resolver este interrogante, usted realiza una serie de experimentos:
1-Northern blot
Se analizan tejidos de las 3 ratas. Se utiliza como sonda un fragmento de DNA
doble cadena, marcado y desnaturalizado correspondiente a la secuencia del
segundo exón de la ayudina.
Se observa lo siguiente:
Hígado 1 riñón 1
Hígado 2 riñón 2
Hígado 3 riñón 3
1,5 kb
0,9 kb
Responda:
1-A qué corresponden las bandas observadas en la figura anterior? Qué es un
Northern blot? Para qué sirve?
2-Por qué no se observan bandas en las muestras de riñón?
3-Aqué se debe que se observen 2 bandas en un experimento de Northern blot
en condiciones de baja sal con una sonda altamente específica?
4-Aqué se debe la diferencia de intensidad de bandas en las distintas calles?
5-Qué otro cambio importante ocurrió en la rata 3?
6-Cuál es la rata de expressión normal?
2-Southern blot
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Se utilizó la misma sonda que para los ensayos de Northern blot y se observó lo
siguiente:
Hígado 1 riñón 1
Hígado 2 riñón 2
Hígado 3 riñón 3
Responda:
1-Brevemente, como se hizo el Southern blot y para qué sirve.
2-A qué corresponden las bandas observadas en este experimento?
3-Existirán sitios de restricción para la enzima utilizada en estos experimentos
dentro del exón 2? Utilice esquemas para facilitar su interpretación y su
respuesta.
4-A qué podrían deberse las diferencias observadas en cuanto al patrón de
bandas en la rata 2? Vuelva a leer el enunciado del problema.
5-Tomando en cuenta los resultados de todos los experimentos (Northern y
Southern blot) responda si es possible y según su criterio Y JUSTIFIQUE:
a-Qué rata sería la normal y cuales las portadoras de tumor.
b-Cuál presentaría amplificación génica y cuál un descontrol de expressión?
6-Aqué podría deberse un descontrol de expressión?
7-Cómo podría determinar la participación de un factor de transcripción en el
control de la expression de este gen? Para que sirven los vectores con genes
reporteros?
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Ejercicio 2
El esquema de la figura 1 corresponde al gen que codifica para el factor de
transcripción FT, el cual controla la expresión de una enzima, exclusiva de
hígado y responsable de la degradación de una droga quimioterapéutica: la
tumorina. Se sospecha que la resistencia de ciertos tumores a tumorina es la
sobreexpresión de FT.
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ATG
TAA
E1
E2
EcoRI
EcoRI
E3
EcoRI
2500 pb
3000 pb
DATOS
E1=300 pb
E2=800 pb
E3=500 pb
PM de un aa=110 Da
ATG= a 65 pb del 5' de E1.
TAA= a 35 pb del 3' de E3
1-Esquematice el mRNA maduro correspondiente a FT.
En los esquemas que corresponda (mRNA y/o la figura 1) marque el +1,
ubicación del promotor, secuencias conservadas dentro del mismo, etiqueta
de poliadenilación y clivaje.
2-Represente en un par de esquemas las bandas y sus correspondientes
tamaños que se observarían en un Southern blot y en un Northern blot con
muestras obtenidas de hígado, riñón y cerebro de rata, utilizando como sonda un
oligonucleótido con la secuencia completa correspondiente al exón 2.
3-Determine el peso molecular del FT sabiendo que es un homodímero.
4-Indique los pasos necesarios para la amplificación y chequeo del plásmido que
se muestra en la figura 2.
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5a-Indique cuál de los siguientes cultivos de tejidos sobrevive al tratamiento con
tumorina y justifique su respuesta:
cerebro - hígado normal – riñón - tumor de hígado
b-En los mismos cultivos, explique qué resultados espera obtener sin son
transfectados con una construcción como la de la figura 2 y luego los exctractos
citoplasmáticos enfrentados a luciferina.
2
Promotor que
respondea FT
Luciferasa
4 kb
1.5 kb
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