Análisis de hidratos de carbono

Primer informe de laboratorio de Bioquímica
Trabajo práctico N°1
Análisis de hidratos de carbono: caracterización y cuantificación de un azúcar desconocido.
Objetivos:
Objetivo general:
Familiarizarse con algunas de las técnicas mas usadas en el análisis de los hidratos de carbono.
Objetivos específicos:
Determinar la cantidad de azúcar presente en una muestra, mediante el método del fenol−Sulfúrico.
Determinar la presencia de azucares reductores en dicha muestra utilizando dinitrosalicilato.
Realizar una cromatografía en papel, que permita dilucidarla estructura de un azúcar desconocido.
P r o c e d i m i e n t o s:
1) Cuantificación de azucares:
Preparación de la curva de calibración:
Se tomaron 7 tubos, a los cuales se les agregaron los siguientes compuestos a los siguientes volúmenes:
1
(blanco)
Compuesto
3
4
5
6
7
2
Se procedió a depositar la glucosa en los 7 tubos de ensayo, todos con volúmenes diferentes, (especificados en
la tabla), además de un tubo sin glucosa, para ser utilizado como patrón para el Espectrofotometro.
Luego de esto, a cada tubo, incluyendo el ultimo, se les agregó agua destilada a los tubos, luego Fenol al 5%,
los cuales e agitaron. Luego 5 ml. de ácido Sulfúrico concentrado. Terminado este proceso, con su debida
precaución, se agitaron bien los tubos y se esperó por 30 minutos. Pasado esto, se procedió a medir la
Absorbancia en el Espectrofotometro a 490 nm. utilizando el tubo sin glucosa como blanco para calibrar la
maquina. Se pasó el contenido de los tubos a los tubos especiales, calibrando cada dos tubos hasta haber
terminado con los tubos.
Resultados:
Los resultados obtenidos de la absorbancia fueron:
Tubos
1
2
Absorbancia
0
0.135
1
3
4
5
6
7
0.253
0.417
0.658
0.574
0.768
Discusión:
Los resultados obtenidos por el Espectrofotometro dieron como muestra lo indicado en la tabla anterior. El
monosacárido reaccionó con el ácido sulfúrico el cual causa la deshidratación del monosacárido, formando así
un furfural, y reaccionando con el Fenol al 5%, se transforma en un compuesto altamente conjugado. Luego,
de esta reacción, se pudo realizar la medición de Absorbancia a 490 nm.
Es notable que el tubo 2 posee menos absorbancia que el tubo 7, debido a que, a medida que la concentración
de glucosa aumenta hasta 1,0 ml aumenta la absorbancia. Con lo cual, existe una mayor superficie de contacto
con los haces de luz de el espectrofotometro, y por ende una mayor absorbancia de la luz.
Análisis de la muestra problema:
A 3 tubos, se les agregó la muestra problema de azúcar, que nosotros ya sabíamos que era glucosa, pero no
sabíamos la cantidad de azucar en la solución.
Compuesto
Muestra problema (ml)
Agua destilada (ml)
tubo 1
0.1
0.9
tubo 2
0.2
0.8
tubo 3
0.5
0.5
Luego, se le aplico a cada tubo1 ml. De Fenol al 5%. Se mezclo bien, y luego se les adicionaron 5 ml de
Acido Sulfurico concentrado. Se agitaron y se espero durante 30 minutos.
Luego se procedio a medir la absorbancia a 490 nm. Los resultados fueron los siguientes:
Muestra Problema
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Absorbancia
0.31
0.464
0.85
Además, gracias al grafico adjunto, se pudieron calcular las concentraciones de los 3 tubos de muestras
problemas, y asi, calcular la concentración aproximada de la muestra problema:
Muestra problema
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Conc. Prom:
Concentración
0.028
0.051
0.123
0.067
• Cromatografia en papel:
Se procedió a tomar un papel especial para este experimento, al cual, en suparte inferior, se le trazó una linea
horizontal a una altura de 1 cm. aproximadamente. Luego, sobre esta linea, se deposito equitativamente 8
2
gotas bien gruesas de los siguientes compuestos:
Lactosa, Galactosa Sacarosa, Arabinosa, Ribosa, Manosa, y la Muestra Problema.
El papel se colocó dentro de una camara con una solución de Butanol: Ac. Acetico: Eter Etílico: Agua, en una
proporción de 9:6:3:1.
Esta solución de solentes, debería ir subiendopor la superficie del papel, desplazando los depositos de
azucares proporcionalemente segun la afinidad, que tienen con la fase movil.
Luego que casi ha llegado arriba la solución, se sigue a sacar el papel de la camara, y esperar a que seque,
para luego rociarlo con una solución de Anisaldehido (0.5 ml.), Etanol (9 ml.), Acido sulfurico (0.5 ml) y
Acido Acetico (0.1 ml), para luego, secarlo en una estufa especial, a aproximadamente a 100°C. Luego se
procedió a medir el desplazamiento de las manchas, sobre el papel, y sacar el RF de cada azucar. El RF, se
calcula, con la razón entre la Distancia del azucar, por la Distancia total que avanzó el solvente por el papel.
El resultado total de las migraciones y de los RF, fueron los siguientes:
Azucar
Migración
Lactosa
Galactosa
Sacarosa
Arabinosa
Ribosa
Glucosa
Maltosa
Mstra prb.
1.6
3.2
2.6
3.3
3.9
3.7
2.4
3.1
Mig.
Solvente
7.7
7.7
7.7
7.7
7.7
7.7
7.7
7.7
RF
Color
Dif. c/n MP
0.21
0.42
0.34
0.43
0.51
0.48
0.31
0.4
Gris
Plomo
Gris
Invisible
Verde
Gris
Gris
Gris
0.19
0.02
0.06
0.03
0.11
0.08
0.09
Cuestionario
¿Qué es el poder reductor de un azucar?
Es aquel capaz de reducir su carbono Anomérico, formando enlaces glucosidicos con otras moleculas de
azúcares.
Explique porque la sacarosa y el almidon no son reductores.
La Sacarosa y el Almidón no son reductores ya que no poseen un carbono anomérico libre, y esto también no
les permite la oxidación.
¿Porque las muestras de distintos azucares migran en forma distinta en una cromatografia en papel?
La migración de los azucares se debe por la afinidad del azúcar reductor con el solvente.
Según las polaridades, si la fase estacionaria (papel) es apolar, y la fase móvil (azúcar) también es apolar,
habrá una mayor migración que si la fase móvil fuese polar.
Dibuje la estructura de un compuesto formado por dos glucosas con un enlace ð 14 y otro que contenga
un enlace ð 16.
3
Escriba la ecuaccion de la produccion de acidos aldonicos y aldaricos de la glucosa.
Nombre y explique (mediante ecuaciones) otros metodos para determinar la presencia de azucares
reductores.
¿Qué función cumple el blanco en la medición de absorbancia?
¿Qué contiene este blanco?
Para el espectrofotometro, el blanco es el tubo con en el que se calibra. Este tubo, contiene no contiene
glucosa, contiene Fenol 5% 1 mL, 1 mL de agua destilada y 5 mL de de ácido Sulfúrico concentrado.
¿Cómo se obtiene la concentración de la muestra de azúcar en este trabajo practico?
Por el método de Fenol Sulfúrico al pasar los tubos de la difusión por el espectrofotometro a una absorbancia
de 490 nm, el nos entrega la concentración del azúcar.
Conclusión:
Después de terminado el trabajo, la realización de este informe nos aclaro en su desarrollo, muchas facetas de
lo que son los Hidratos de Carbono, sus solventes y las reacciones que estos tiene frente a distintos solventes,
respecto a sus distintas concentraciones y cantidades moleculares.
Aprendimos a usar el Espectrofotometro, un aparato nuevo para nosotros y de gran utilidad, ya que
descubrimos su uso, y su utilidad para el trabajo practico.
Y en este aparato, tan practico para nosotros, sacamos como ultima conclusion, lo siguiente.
A > cantidad de moleculas > concentracion y
• absorvancia.
Tambien podemos decir, que la cromatografia en papel no es tan efectiva, como la silica gel, ya que
degradacion de colores en el papel no es tan buena.
La cromatografia en papel nos sirve para determinar con que tipo de azucar estamos trabajando ya que esta va
a determinar, si el azucar es un monosacarido o polisacaridos.
Bibliografía: −Tratado de Bioquímica de Lehninger.
−Guia de laboratorio de Bioquímica.
Segundo informe de laboratorio
Trabajo Practico nº2
Lipidos
Objetivos :
Objetivo general: Estudiar y conocer las caractieristicas generales de los lipidos.
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Objetivos especificos:
• Extraer lipidos de pescado por un metodo rápido y no oxidativo.
• Determinar la humedad de una muestra de pescado.
• Determinar el grado de insaturaciones de los lipidos de distintas muestras.
¿Porque es importantes estudiarlo? :
Ya que son los componentes de las estructuras de las membranas celulares biologicas, y su cualidad
Anfipatica los hace aun mas interesantes en nuestro estudio de Bioquimica.
Procedimiento
Determinación de la humedad del pescado
Antes de comenzar a realizar el experimento pesamos una placa de Petri lo que nos dio 50.372 gr. la
placa de Petri mas el pescado nos da un peso de 56.707 gr. (peso pescado 6.335 gr). Luego comenzamos
calentado la placa con el pescado en una estufa durante 2 hrs. A una temperatura de 110ºC, hasta que
se produzca una sequedad total en ala muestra de pescado (deshidratación total de este). Dejamos
enfriar la placa con la muestra y lo volvemos a pesar, el peso tuvo una variación de 56.707gr. a
52.265gr.
RESULTADOS:
1º El peso del pescado húmedo
56.707gr − 50.372gr = 6.335gr.
2º El peso del pescado seco
52.265gr − 50.372gr = 1.893gr.
3º peso de agua
56.707gr − 52.265gr = 4.242gr.
% humedad del pescado =
H2Ogr * 100 / pescado húmedo.
% humedad de pescado = 4.242gr * 100 / 6.335gr
= 66.961%.
DISCUSION:
Luego de realizar este practico podemos decir que resulto todo un éxito, ya que, pudimos calcular la
humedad que contiene el pescado. El objetivo de este practico era este, el de calcular la humedad.
Nosotros esperábamos que cuando calentáramos el pescado ocurriera una perdida de agua de este
(deshidratación) y es lo que ocurrió, de un peso de 6.335gr bajo a un 1.893 gr de pescado esto significa
que perdio 4.442 gr de agua, por lo tanto, cumplimos el objetivo de calcular la humedad de pescado que
fue de un 66.961%.
5
DETERMINACION DE LOS LIPIDOS DEL PESCADO
Este paso práctico tiene mucha relación con el anterior para determinar los porcentajes de lípidos en
base húmeda y base seca.
Homogeneizamos una muestra de 20.009gr. de pescado en un baso de precipitado de 100 ml., lo
traspasamos a un baso de 250 ml. y agregamos 20 ml. de cloroformo y 40 de metanol. Homogeneizamos
por 5 minutos con una bagueta. Luego agregamos 20 ml. mas de cloroformo y volvimos a homogeneizar
por 1 minuto. Finalmente agregamos 20 ml. de cloroformo y homogeneizamos por 2 minutos más.
Agregamos agua destilada y agitamos por 20 minutos.
Filtramos la mezcla usando un embudo Büchner con un matraz kitazato y ayuda de vacío.
Transferimos a un embudo de decantación y esperamos que se separen las fases. El resultado fue 3 fases
una cloroformica, una de metanol y una de agua. La fase cloroformica, es la que contiene los lípidos
extraídos, pasamos esta fase a una probeta de 100 ml y el volumen obtenido es de 21 ml. Tomamos una
alícuota de 10 ml de la fase orgánica y la transferimos a una placa de petri que el peso total de la fase
con la placa es de 47.962gr. Calentamos la placa en la estufa a 50 ºC, hasta eliminar el solvente, el
residuo obtenido es el material lipídico extraído desde el pescado, el peso final (material lipídico) es de
47.679gr.
RESULTADOS:
Lípidos gr = 47.962gr − 47.679gr = 0.283gr.
Pescado húmedo = 6.335gr
Pescado seco = 1.893gr.
%lípidos en base de humedad = gr lípidos * 100
/ gr pescado húmedo.
%lípidos en base seca = gr lípido * 100
/ gr pescado seco.
%lípidos en base húmeda = 0.283gr. * 100
/ 6.335gr. = 4.467%.
%lípidos en base seca = 0.283 * 100
/ 1.983 = 14.949%
DISCUSION:
Al igual que en el paso anterior se cumplieron los objetivos, se pudo determinar la extracción de los
lípidos de pescado por un método rápido y no oxidativo, se pudo determinar él % de lípidos en una base
húmeda y una seca. La obtención de los resultados de este paso lo logramos gracias a un buen manejo
de los procedimientos y materiales.
Los resultados del % de lípidos en base húmeda, quieren decir, que de la extracción de lípidos tenemos
6
un 4.467% de lípidos pertenece a ésta base. Los resultados del % de lípidos en base seca, nos da a
conocer, que el 14.949% de lípidos pertenece a ésta base.
Determinacion del indice de yodo:
Aceite de pescado: luego de obtener la fase cloroformica por la actividad anterior, se extrae de esta
misma una alicuota de 10 ml para luego transferirlo a un matraz erlenmeyer con tapa.
Mantequilla: se pesaron 0,1523 gr de mantequilla en un matraz erlenmeyer luego de esto se agregaron
10 ml de cloroformo para luego agitar hasta completar la disolucion de la mantequilla.
• A estas dos muestras de lipidos se agregaron 10 ml de reactivo de hanus para luego tapar los
matraces, luego de agregar el reactivo se dejaron estos reposar en la oscuridad por 60 minutos.
Mientras se realiza este proceso, es decir, desde la adicion del reactivo de hanus hasta dejar en
la oscuridad los matraces se introducen 10 ml de reactivo de hanus dentro de un matraz blanco
para tambien dejarlo en la oscuridad durante el mismo periodo de tiempo.
• Luego de los 60 minutos a los tres matraces se agregaron 20 ml de agua destilada y 4 ml de
yoduro de potasio al 15%, esto ultimo se hace para favorecer la formacion de yodo en la
solucion.
Aspecto de los matraces:
• Aceite de pescado: solucion heterogenea en la cual la primera fase es rosacea y la segunda fase
es de color rojo ladrillo.
• Mantequilla: solución heterogénea en loa cual la primera fase es anaranjada oscura y la
segunda es rojo ladrillo.
• Blanco: solución heterogénea en la cual la primera fase es rojo ladrillo y la segunda es rojo
oscura.
Luego de determinar los aspectos de los matraces se procede a titular con tiosulfato lentamente.
PROCEDIMIENTO:
En un soporte universal con pinzas se coloca una bureta hasta el tope de su capacidad con tiosulfato,
debajo de la bureta se coloca cada uno de los matraces (uno a la vez), para comenzar la titulación,
cuando la solución de los matraces se torne amarilla, se agregan 4 gotas de almidón y se continua la
titulación hasta el cambio de color.
RESULTADOS DE LA TITULACIÓN:
Luego del cambio de color, se mide el volumen utilizado en la titulación
• Mantequilla: 41 ml
• Aceite de pescado: 11.20 ml.
• Blanco: 51 ml.
Aspecto del contenido del contenido de los matraces:
• Aceite de pescado: solución heterogénea, primera fase amarilla, segunda fase fucsia.
• Mantequilla: solución heterogénea, primera fase blanco, segunda fase amarilla.
• Blanco: solución heterogénea, primera fase amarilla, segunda fase roja.
7
Determinacion del indice de yodo:
Cr2+12 O 7−12 2Cr6+
6+ 3+
Cr2O7 2Cr3+ + 6e
Determinacion de PE:
294,2/6 = 49,03
Determinacion de nºeqg:
O,24/49.03 = 4.89*10−3
Determinacion de N tiosulfato:
4.89*10−3/40.2 = 12.21*10−4
ACEITE DE PESCADO:
Ind de I = (51 ml − 11,20 ml) * 12,21*10−4*12,69/0,17 = 3,6275 100 = 0.17 = 21.33 gr.de
X 3.6275 Yodo en 100
Gr. De aceite
MANTEQUILLA:
Ind de I = 51 ml − 41 ml) * 12,21*10−4*12,69/0,17 = 0,9114 100= 3.17 = 28.75 gr.de
X 0.9114 Yodo en 100
gr. de grasa.
Mientras más índice de I, más grado de insaturación presenta el lípido en cuestión, por lo tanto el aceite
de pescado es el que posee mayor grado de insaturaciones en su estructura, ya que el indice de I de
aceite de pescado es: 21,33 gr. De Yodo en 100 gr. de Aceite, y el de la mantequilla es de 28.75 gr. De
Yodo en 100 gr de grasa.
Cuestionario
1.−
• ¿Qué es una grasa y un aceite?
Las Grasas y aceites son un grupo de compuestos orgánicos existentes en la naturaleza que consisten en
ésteres formados por tres moléculas de ácidos grasos y una molécula del alcohol glicerina. Son
sustancias aceitosas, grasientas o cerosas, que en estado puro son normalmente incoloras, inodoras e
insípidas. Las grasas y aceites son más ligeros que el agua e insolubles en ella; son poco solubles en
alcohol y se disuelven fácilmente en éter y otros disolventes orgánicos. Las grasas son blandas y
8
untuosas a temperaturas ordinarias, mientras que los aceites fijos (para distinguirlos de los aceites
esenciales y el petróleo) son líquidos.
• Que es un Jabón?
El Jabón, es la sal de sodio o potasio de un ácido graso que se forma por la reacción de grasas y aceites
con álcali. Sus ingredientes son compuestos de glicerina y un ácido graso, como el ácido palmítico o el
esteárico. Cuando estos compuestos se tratan con una solución acuosa de un álcali, como el hidróxido de
sodio, en un proceso denominado saponificación, se descomponen formando la glicerina y la sal de sodio
de los ácidos grasos.
• Que es el colesterol?
El Colesterol es un alcohol complejo que forma parte de todas las grasas y aceites animales. Se puede
activar para formar la vitamina D. El colesterol pertenece a un grupo de compuestos conocidos como
esteroides, y está relacionado con las hormonas sexuales producidas en las gónadas y las hormonas de la
corteza suprarrenal.
2.− ¿Qué caracteristicas poseen los lipidos provenientes del pescado?
Las células vivas contienen grasas simples, como las descritas anteriormente, y otros materiales
similares a las grasas. Entre estos últimos, que son sustancias más complejas, se encuentran los lípidos y
los esteroles.
3.− ¿Que diferencias existen entre los fosfolipidos y los trigliceridos?
Los trigliceridos son por ejemplo las grasas y aceites nombrados anteriormente( ésteres formados por
tres moléculas de ácidos grasos y una molécula del alcohol glicerina), en cambio los fosfolipidos son
derivados de ácidos grasos, glicerina, ácido fosfórico y bases que contienen nitrógeno.
4.− ¿Qué son las ceras?
Las Ceras son los ésteres naturales de ácidos grasos y alcoholes monohidroxílicos, pero que actualmente
se aplica a los productos naturales y fabricados semejantes a esos ésteres. Las ceras tienen un brillo
opaco y una textura jabonosa o grasienta. Se ablandan gradualmente con el calor, pasando por un
estado blando y maleable hasta llegar al estado líquido. Los aceites y las grasas parecen ésteres cerosos,
pero difieren de estos en que están formados por glicerina, un alcohol trihidroxílico (o triol).
5.− ¿Cuál es el significado del indice de Yodo en el analisis de un aceite?
El significado del indice de yodo muestra el grado de insaturación del aceite, que se define como, el peso
en gr de I2 que reacciona (por adición de doble enlaces) con 100gr de lípidos.
6.− ¿Por qué se debe agregar almidon como indicador en la titulacion con tiosulfato de sodio?
Se debe agregar almidón como indicador en la titulación con tiosulfato de sodio porque, el almidon es
un polisacarido que reacciona con el tiosulfato de sodio por la presencia de OH, cuando este reacciona
se pone de un color negro, y cuando ya no existe la precencia de tiosulfato de sodio este no reacciona y
deja de mostrar el color negro.
7.− ¿Por qué para la extraccion de lipidos se utiliza Cloroformo?
9
El cloroformo necesita menor cantidad de calorías por gramo para su evaporación, en comparación con
el agua, que necesita 540 cal/g, mientras que el cloroformo necesita solo 59 cal/gramo a 1 atm, por lo
tanto, para la extracción de lípidos mediante el uso de cloroformo es menor la cantidad de calorías que
se debe aplicar a la grasa para su extracción.
8.− ¿Qué efecto tiene una base (por ejemplo: NaOH) sobre un triglicerido?
Tratando las grasa con bases o álcalis se logra su hidrólisis, esto es, la separación de sus componentes,
ácidos grasos y glicerol, por introducción de una molécula de agua en cada enlace, en este caso, el
procedimiento se llama saponificación, con lo que se forman jabones, que son las sales alcalinas de los
acidos grasos. Los jabones de sodio y potasio son solubles en agua, pero pierden su solubilidad en
presencia de un exceso de iones alcalinos. La presencia de de sales de calcio o de magnesio hace que se
formen jabones alcalino insolubles.
Conclusión
Concluido el trabajo, hemos encontrado formas de determinacion del grado de instauracion de diversas
materias grasas. Por ejemplo, el metodo de Hanus, o a traves del indice de Yodo.
Hemos observado las formas en que se pueden almacenar los lipidos y grasa en el organismo, mas bien,
en este tipo de experimento, en el pescado.
Hemos trabajado con un metodo suave y rapido para evitar la descomposicion oxidativa de los acidos
grasos principalmente los insaturados, esto con los metodos anteriormente nombrados.
Tambien las cantidad de grasas, almacenadas en otras muestras de lipidos, como mantecas o aceites.
Informe de Bioquimica laboratorio nº 3
" Proteinas"
Objetivos:
−Estudiar y conocer las caracteristicas generales de las proteinas.
Objetivos especificos:
− Realizar una curva de calibración utilizando una medida estandar.
− Purificar caseina a partir de leche, por su punto isoelectrico.
− Estudiar las caracteristicas acido−base de las proteinas.
SEPARACION DE LA CASEINA
Tomamos 20 ml. de la leche descremada y la diluimos en 100ml de agua destilada, le agregamos lentamente
0.5ml de HCl al 2%, hasta lograr un PH de 4.26 (comprobamos con un PHmetro), donde observamos la
precipitación de la caseína. Esto se produce cuando hay una alteración de la estructura de la proteína
(químicas y físicas) que las hace que pierdan sus propiedades funcionales, físicas y químicas que las
caracterizan. Agitamos durante 5 min. Luego dejamos reposar por 15 min. Luego de los 15 min. observamos
un precipitado.
10
Centrifugamos la dilución durante 10 min. , Se observa un sobrenadante (se elimina) y el residuo restante lo
lavamos con agua destilada 2 veces. Lavamos finalmente dos veces con etanol y luego con agua destilada
hasta que desaparezca el olor a etanol.
Al residuo totalmente limpio, se le agrego 0.5ml de NaOH 0.01 N y luego agregamos 0,01 ml de NaOH 0.1 N
intentando de disolver la mayor parte del residuo, la solución que nos da es diluida en: 1 ml de solución mas 9
ml de agua destilada.
La solución que nos da con la disolución anterior es nuevamente diluida, tomando:
Solución Agua Biuret
Tubo 1 0.1mg/ml 0.9ml 4ml
Tubo 2 0.5mg/ml 0.5ml 4ml
Tubo 3 1.0mg/ml 0.0ml 4ml
Al agregar el reactivo Biuret los tubos toma un color púrpura, es aparentemente causado por el complejo de
coordinación formado el átomo de Cu y cuatro átomos de N del enlace peptídico.
Mezclamos suavemente por agitación. Calentamos a 50 ºC por 10 min. en un baño termorregulado, enfriamos
por 5 min. y luego liemos los resultados al espectrofotómetro (spectronis 20) a 540 nm empleando como
blanco el mismo tubo que se utilizo para la determinación de proteínas por el método Biuret.
Los resultados de la absorbancia fueron:
Tubo absorbancia (nm)
• 0.014
• 0.086
• 0.289
Concentración mg/ml
0,1
0,5
1,0
Absorvancia
0,014
0,086
0,289
DISCUSION
Luego de terminar esta experiencia podríamos concluir y discutir que la caseína es una proteína capas de
reaccionar con el sulfato de cobre alcalino, ya que cuando agregamos el reactivo Biuret reacciono formando
un color púrpura. Que se formo aparentemente por el complejo de coordinación formado entre el átomo de Cu
y cuatro átomos de N, dos de cada enlace peptídico. El resultado de la curva de calibración de la caseína
puede determinar que a mayor concentración de caseína la absorvancia es mayor. La curva de calibración
debería observarce un pto. de saturación en una absorvancia de
El método Biuret tiene varias ventajas incluyendo velocidad, similar color con distintas proteínas, y existen
pocas sustancias interferentes. Aunque no es demasiada, una desventaja es la sensibilidad.
Determinación de Proteina por metodo de Biuret
11
Tubos
1
2
3
4
5
6
7
8
Ml. De sol. Estándar
0
0,5
1
1,5
2
3
4
5
Ml. De Agua
5
4,5
4
3,5
3
2
1
0
Luego de preparar según la tabla los 8 tubos ensayo con la solucion estandar de Albumina y agua, a cada tubo
se le agrego 4 ml. De reactivo de Biuret; cuidadosamente se agito y luego calento a 50º C por 10 minutos en
un baño termoregulado, luego de esto se espero a que enfrien los tubos y se procedio a medir la absorbancia,
la cual arrojo los siguientes resultados, dejando el tubo nº 1 como blanco.
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
Concentracion albumina
0
0,5
1
1,5
2
3
4
5
Absorbancia
tubo blanco
0,012
0,019
0,038
0,045
0,03
0,046
0,078
Caracteristicas acido−base de las proteinas
De una muestra de proteina disuelta en NaOH de 0.1 M, esta proteina es caseina, de esta solucion se extraen
10 ml. De la caseina disuelta en NaOH, luego de esto se mide el PH inicial de la muestra, despues se procede
a titular la caseina agregando determinados volumenes de HCl 0.1 M, cada vez que se agrega HCl, se mide el
PH hasta alcanzar 1.83.
Ml de HCl
1
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
1
Ph
7,45
6,01
4,52
3,52
3,15
2,48
2,71
2,65
2,53
2,49
2,44
2,36
12
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2,3
2,24
2,2
2,17
2,13
2,11
2,09
2,07
2,05
2,03
2,02
2,01
2
1,99
1,99
1,98
1,96
1,95
1,95
1,94
1,93
1,92
1,92
1,91
1,91
1,91
1,9
1,9
1,89
1,89
1,88
1,88
1,88
1,87
1,87
1,87
1,86
1,86
1,86
1,85
1,85
1,84
1,84
13
2
1,84
1,83
Cuestionario
1.− ¿Que es el enlace peptidico?
El enlace peptidico es el puente de unión entre aminoacidos para así, poder formar estructuras proteinicas,
como por ejemplo la estructura primaria de una proteína, la cual es su secuencia de aminoácidos, formada
cuando un enlace peptídico une el grupo carboxilo un átomo de carbono (C), dos átomos de oxígeno (O), y un
átomo de hidrógeno (H) de un aminoácido al grupo amino un átomo de nitrógeno (N) y dos átomos de
hidrógeno (H) de otro. Así se forma una cadena larga de varios aminoácidos, desprendiéndose una molécula
de agua en la formación de cada enlace peptídico.
2.− ¿Cómo afecta el acido clorhidrico (Hcl) a la proteina ?
El acido Clorhidrico, por su capacidad acida, desnaturaliza a la proteina, osea, rompe sus enlaces pepetidicos,
y cambiando las propiedad estructurales y fisiologicas de la proteina.
3.− ¿Cómo podria obtener lactoalbumina en una muestra de leche?
Si a la muestra de leche le aplicamos un acido fuerte, lograremos que la lactoalbumina decante, en un
precipitado, distinto al de la caseina.
Cabe señalar, que los puntos isoelectricos entre la caseina y la lactoalbumina son diferentes, ya que tienen un
precipitado distinto entre ellos. Todo esto es señal, de que la lactoalbumina y la caseina decantan a un distinto
PH.
4.− ¿Se podría utilizar otra proteína para construir la curva de calibración con el método de Biuret y el
método de Bradford?.
Si se podría, ya que, si un compuesto o proteína tiene dos o más enlaces peptídicos pueden reaccionar con
sulfato de cobre alcalino en el método de Biuret. En el método de Bradford la unión de Azul brillante de
coomasie a una solución ácida de proteína.
En este practico utilizamos como proteína la caseína.
5.−¿En qué consiste una curva de calibración de proteína y para que sirve?.
14
Método de análisis basado en las relaciones lineales entre la propiedad medida y la variable a determinar. Este
método permite determinarla concentración (de proteína)que se desconoce, a partir de la absorvancia y que se
encuentra dentro del limite de la recta.
6.− ¿A que corresponden la estructura primaria, secundaria y terciaria de una proteína?.
La estructura primaria de la proteina es la formada por aminoacidos enlazados por enlaces peptidicos; la
estructura secundaria son los enlaces entre estructuras ya formadas de aminoacidos, y una estructura terciaria
son las estructuras globulares de preteinas, o fibrilares, con caracteristicas fisiologicas propias de cada
estrucura terciaria.
7.− ¿Qué es la capacidad Tamponante?
Cuando existe variacion de PH en un sistema determinado por agregacion de H o OH, el par conjugado
acido−base actua como tampon, que posee una capacidad tamponante especifica, es decir, la capacidad
tamponante es un sistema que tiende a impedir el cambio de PH cuando se añaden iones H o OH.
8.− ¿Por qué las proteinas presentan esta capacidad tamponante?
El comportamiento tamponante de los peptidos esta determinados por los grupos alfa amino libres de los
restos NH2 terminales, por los alfa−carbonilos, libres de los restos de COOH terminales y por los grupos R
que son capaces de ionisarse. Puesto que los grupos alfa amino libres y alfa carbonilo libres estan muy
separados entre si, sus interacciones electroestaticas entre ellos estan disminuidas, lo que lo hace estable en
forma de tampon, ademas que ninguno de los grupos alfa amino o alfa carbonilo estan combinados en forma
de enlace peptidicos, por lo tanto pueden ionisarse en la zona de PH entre 0 y 14, y esto determina la
capacidad tamponante.
9.− ¿Qué otras caracteristicas de las proteinas se pueden utilizar para purificarlas?
Otras caracteristicas, por las cuales las proteinas pueden purificarse, es a traves de la electroforesis el cual
utiliza la ionizacion del grupo funcional R de la proteina.
Este grupo funcional, junto con los grupos alfa amino, y alfa carbonilo, al ser ionizado, puden ser reconocidos,
por electroforesis, por lo tanto, luego de esto, las proteinas pueden ser identificadas en su condicion de
tamponante, y por lo tanto, pueden ser purificadas, conociendo estas caracteristicas.
Bibliografia:
Lenhinger, capitulo proteinas, edicion 1996
Mathews, capitulo proteinas edicion1994
Enciclopedia encarta 1997 microsoft.
Guia laboratorio Bioquimica, laboratorio de proteinas.
Objetivos.
• Estudiar el efecto de varios factores sobre la actividad de la fosfatasa ácida.
Objetivos específicos.
15
• Medir actividad enzimatica de la fosfatasa ácida.
• Determinar el pH optimo de la fosfatasa ácida.
• Determinar la temperatura optima de trabajo de la fosfatasa ácida.
• Estudiar el efecto del sustrato sobre la actividad enzimatica de la fosfatasa ácida.
Materiales.
• Aorta de bovino.
• Buffer citrato 0.10M de pH 3.0; 4.0: 4.8; 5.2; 5.7; 6.2; 7.0; 8.0.
• p−nitrofenilfosfato disodio 0.025M pH (4.8).
• p−nitofenilfosfato disodio 25 mM pH (4.8).
• p−nitrofenol 60uM, en NaOH 0.02M.
• NaOH 0.02M.
• NaOH 0.1M.
• MgCl2 25mM.
Procedimiento.
Preparación de extracto de crudo de la enzima.
Esta preparación la realizaron los profesores de laboratorio y el crudo se dejo en un vaso precipitado rodeado
de hielo para mantener al crudo a baja temperatura.
Curva de calibración con p−nitrofenol.
Se prepara una serie de 6 tubos según la presente tabla.
Se mezclan bien los tubos y luego se transfieren a tubos de espectrofotómetro y se lee a 405 nm usando el
tubo Nº1 como blanco, para poder ajustar el espectrofotometro.
Efecto del pH en la reacción enzimatica.
Para determinar el efecto del pH en la actividad de realizan reacciones en buffer de citrato de valores de pH
distintos según como indica la siguiente tabla.
B: Blanco (no contiene sustrato).
C: Control (no contiene enzima y mide la hidrólisis química del sustrato).
MgCl2: La enzima es dependiente del magnesio para su actividad.
Nota: el extracto de crudo debe agregarse en ultimo lugar, cada tubo se debe dejar encubar por 30 min. Y a
37ºC.
Luego de esto se realiza.
Transferir inmediatamente una alícuota de 1 ml del medio de incubación a un tubo que contenga 5 ml de
NaOH 0.1M. A pH básico el producto tiene un máximo de absorción a 405nm y utilizando el tubo blanco para
poder calibrar el espectrofotómetro.
También se utiliza el NaOH para poder detener la reacción ezimatica debido que queremos ver cuanto
producto se forma en un tiempo determinado.
16
Efecto de la temperatura en la reacción enzimática.
Se estudiara la reacción a las temperaturas de : 0ºC, 20ºC, 37ºC, 60ºC, 100ºC.
Se deberán para esto los siguientes tubos, los cuales deberán ser repetidos 5 veces cada uno a excepción del
tubo B (blanco).
Compuesto
p−nitofenilfosfato (ml)
MgCl2
buffer citrato pH 5,6
agua (ml)
extracto crudo (ml)
B
C
1,0
0,5
2,5
2,0
0,5
2,5
2,0
1,0
T
1,0
0,5
2,5
2,0
1,0
B: Blanco (no contiene sustrato)
C: Control (no contiene enzima y mide la hidrólisis química del sustrato).
El pH debe ser constante.
Cada tubo debe ser encubado durante 30 min y a sus respectivas temperaturas.
Antes se debe tener listo los tubos que contienen NaOH como en la experiencia anterior.
Efecto de la concentración de sustrato en la reacción enzimática.
Se debe seguir la siguiente tabla.
Compuesto
p−nitofenilfosfato (ml)
MgCl2
buffer citrato pH 5,6
agua (ml)
extracto crudo (ml)
B
0,5
2,5
2,0
1,0
1
0,5
0,5
2,5
1,5
1,0
2
1,0
0,5
2,5
1,0
1,0
3
1,5
0,5
2,5
0,5
1,0
4
2,0
0,5
2,5
0,0
1,0
B: Blanco (no contiene sustrato).
La concentración de la enzima al igual que el pH deben ser constantes.
En esta experiencia también se deben frenar las reacciones con NaOH como en las experiencias anteriores.
Cuestionario.
¿ Qué significa que una enzima posea temperatura y un pH optimo?
La temperatura optima quiere decir que cada enzima necesita una determinada temperatura para que esta
funcione a su máxima capacidad en una ración, si la temperatura es mas baja la enzima pierde capacidad de
acelerar la ración y si esta es mas alta la enzima al ser una proteína esta se desnaturaliza y no realiza la
reacción.
17
Las enzimas tienen un pH optimo o un intervalo de pH en que su actividad es máxima. A valores superiores o
inferiores de pH la actividad disminuye dado que algunas cadenas laterales de amino ácidos pueden actuar
como ácidos o bases débiles que desarrollan funciones critica en el sitio activo del enzima. El cambio en el
estado de ionización es un estado frecuente en el cambio de actividad.
¿Qué significado tiene Km Vmax? ¿Cómo se determina experimentalmente?
Km es la concentración de sustrato a la que la velocidad inicial es la mitad de la velocidad máxima.
Vmax es la variación del sustrato sobre la velocidad inicial cuando se mantiene constante la concentración de
enzima. A concentración de sustrato relativamente bajas la velocidad inicial aumenta casi linealmente al
incremento del sustrato. A mayores concentraciones de sustrato la velocidad inicial aumenta a incrementos
cada vez menores en respuesta a incremento de concentración de sustrato. Finalmente se alcanza un punto
mas allá del cual se dan incrementos pequeñísimos de la velocidad inicial con el incremento de la
concentración de sustrato. A esto se le llama Vmax.
La velocidad máxima se determina cuando todo el enzima este virtualmente como complejo enzima sustrato y
la concentración de enzima sean extremadamente pequeñas.
¿Cual es el objetivo de hacer controles durante el ensayo enzimático. Cuales son los más usados?.
Siempre hay que realizar controles para conocer la posible contaminación del medio de ensayos con
productos. Los controles típicos son: tiempo cero de la reaccion enzimatica y control no enzimatico.
¿Que función cumple el blanco en este experimento?
La función de este es para poder calibrar el espectrofotómetro debido a que este no contiene sustrato.
Defina actividad enzimatica y actividad especifica, como determinaría cada una de ellas.
La actividad enzimática: los grupos funcionales cataliticos de los enzimas puede interaccionar de manera
transitoria con un sustrato activándolo para la reaccion. En muchos casos, estos grupos disminuyen la energía
de activación (acelerando de este modo la reacción) al proporcionar una ruta de reacción de menor energía.
La actividad especifica: la interacción entre enzima y sustrato es canalizada por las mismas fuerzas que
estabilizan la estructura proteica, a saber, puentes de hidrogeno e interacciones iónicas, hidrofobicas y
de van der waals.
¿Por que se realiza una curva de calibración con p−nitrofenol en la reacción enzimatica medida?
Por que es un indicador para la reacción.
En la siguiente actividad practica ¿cómo se evalúa la actividad enzimatica?
Mediante la cantidad de producto que se forma en un tiempo determinado y luego con el espectrofotómetro se
ve la absorbancia.
¿Por que se utiliza un tampón o buffer para medir la actividad enzimatica?
Se utiliza un tampón para poder detener la formación de producto debido a que este frena la actividad de la
enzima, debido a que se necesita calcular la formación de producto en un tiempo determinado.
18
Laboratorio de Bioquímica
Informe N 4
Extracción
Y caracterización de la fosfatasa ácida
Bibliografía.
Guía de laboratorio de bioquímica plan común, semestre de otoño 2000. Laboratorio Nº 4.
Lehninger, Principios de bioquímica 2ª edición, editorial omega. Pag. 205, 213, 215, 222.
Encarta, Enciclopedia multimedia.
Curva de calibración con P−Nitrofenol:
El experimento de la curva de calibración con P−Nitrofenol, dio como resultado que el tubo 2 posee
menos absorbancia, y esta aumenta con el numero de tubos hasta llegar al numero 6, que es la que
posee la mayor absorbancia, debido a la concentración existente en los tubos de p−Nitrofenol, que en
solución alcalina, como esta (NaOH), se transforma en P−Nitrofenolato, que absorbe fuertemente la luz
a 405 nm. Por lo tanto a mayor concentración de P−Nitrofenol, mayor absorbancia y viceversa.
Tubo
1
2
3
4
5
6
Absorbancia
0,19
0,349
0,532
0,694
0,83
Concentración
0
1
2
3
4
5
Efecto del pH en la reacción enzimática
Este experimento dio como resultado que a mayor pH existirá mayor absorbancia, y por lo tanto será más
lenta la reacción enzimática, ya que el sustrato, P−Nitrofenilfosfato, disociará más lento hasta P−Nitrofenol,
que luego dará P−Nitrofenolato, y por lo tanto, existirá menor absorbancia.
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
Absorbancia
−0,089
0,09
0,192
0,152
0,098
0,062
−0,034
−0,074
Efecto de la temperatura en la reacción enzimática.
19
En los tubos T, que poseen el extracto crudo, dio como resultado general, que la enzima no actúa bien ni a
altas ni a bajas temperaturas, por lo que tiene un punto optimo de acción a los 37ºC, en cambio en los tubos C
que no poseen extracto crudo, la reacción aumenta paulatinamente con la temperatura, por lo que a mayor
temperatura mayor hidrólisis química del sustrato. En cambio en los tubos T a mayor temperatura la reacción
enzimática, comienza a decaer ya menor temperatura, la reacción enzimatica, comienza a ascender, llegando
hasta su punto optimo, para luego descender.
tubo del 1 al 5
Temperatura
0
20
37
60
100
Absorbancia
1,27
0,104
0,269
0,102
0,226
tubo del 1 al 5
Temperatura
0
20
37
60
100
Absorbancia
0,01
0,009
0,008
0,009
0,124
Efecto de la concentración de sustrato en la reacción enzimatica.
El experimento dio como resultado que a mayor concentración de P−nitrofenilfosfato, existe una mayor
reacción enzimatica, no llegando así hasta su punto de saturación, y por ende a mayor concentración de
sustrato no es reacción enzimatica.
Tubo
1
2
3
4
Absorbancia
0,026
0,071
0,091
0,132
Conclusión.
Cada enzima tiene un pH optimo así como una especifidad característica para los sustratos donde
actúa.
También la temperatura tiene que ser la adecuada para el funcionamiento de cada enzima en particular, para
que esta pueda desminuir con mayor eficiencia la energía de activación y así poder acelerar la formación de
producto. También pudimos determinar que la concentración de sustrato afecta en la capacidad catalítica de
un enzima debido a que esta se satura a determinada concentración y la actividad se mantiene constante, por
otro lado a poca cantidad de sustrato esta no logra su máxima capacidad catalítica..
Por lo tanto un enzima debe estar en las condiciones adecuadas para que su funcionamiento sea el mejor y
para poder esperar los resultados que se están buscando.
20
39
21
22