MAESTRÍA EN BIOLOGÍA EXPERIMENTAL

MAESTRÍA EN BIOLOGÍA EXPERIMENTAL
BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
GLUCOGENÓLISIS Y GLUCOGÉNESIS
1.1.1
GENERALIDADES
1
La degradación de la glucosa disponible metabólicamente (glc-6-P) requiere de la acción
combinada de tres enzimas diferentes:
1
1) Glucógeno fosforilasa
1
2) Enzima desramificante del glucógeno
1
3) Fosfoglucomutasa
1
1.1.2
REGULACIÓN DE LA DEGRADACIÓN Y SÍNTESIS DEL GLUCÓGENO
(SEGUNDOS MENSAJEROS, FOSFORILACIÓN-DEFOSFORILACIÓN DE
PROTEÍNAS).
2
Síntesis y degradación tienen una regulación contrapuesta
2
Regulación de la glucogenolisis
2
REGULACIÓN DE LA GLUCOGENOLISIS MUSCULAR
2
1) REGULACIÓN POR MODIFICACIÓN COVALENTE
2
ACTIVACIÓN POR FOSFORILACIÓN
2
INACTIVACIÓN POR DESFOSFORILACIÓN
3
2) REGULACIÓN POR INTERACCIONES ALOSTÉRICAS
REGULACIÓN DE LA GLUCOGENOLISIS HEPÁTICA
1) REGULACIÓN POR MODIFICACIÓN COVALENTE
3
3
3
ACTIVACIÓN POR FOSFORILACIÓN
3
INACTIVACIÓN POR DESFOSFORILACIÓN
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2) REGULACIÓN POR INTERACCIONES ALOSTÉRICAS
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REGULACIÓN DE LA GLUCOGENOGÉNESIS MUSCULAR
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1) REGULACIÓN POR MODIFICACIÓN COVALENTE
4
INACTIVACIÓN POR FOSFORILACIÓN
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ACTIVACIÓN POR DESFOSFORILACIÓN
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REGULACIÓN DE LA GLUCOGENGÉNESIS HEPÁTICA
5
METABOLISMO DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO Y CONTROL DE LA GLUCEMIA
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NOTAS ACERCA DE LA METODOLOGÍA
6
MUTAGÉNESIS SITIO-DIRIGIDA
6
Premio Nobel de Química 1993
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1.1.1 GENERALIDADES
DEGRADACIÓN DEL GLUCÓGENO
(GLUCOGENOLISIS)
La degradación de la glucosa disponible metabólicamente (glc-6-P) requiere
de la acción combinada de tres enzimas diferentes:
1) Glucógeno fosforilasa
2) Enzima desramificante del glucógeno
3) Fosfoglucomutasa
1) Glucógeno fosforilasa
Cataliza la denominada escisión fosforolítica, que consiste en la salida secuencial de
restos de glucosa desde el extremo no reductor, según la reacción:
(glucosa)n + Pi
(glucosa)n-1 + glucosa-1-P
Esta reacción es muy ventajosa para la célula, en comparación con una de hidrólisis.
La enzima posee PLP como coenzima, que interviene en el mecanismo de
catálisis.
2) Enzima desramificante del glucógeno
La glucógeno fosforilasa no puede escidir los enlaces O-glicosídicos en a(1-6). La
enzima desramificante del glucógeno posee dos actividades: a(1-4) glucosil
transferásica que TRANSFIERE cada unidad de trisacárido al extremo no reductor, y
a(1-6) glicosidásica que HIDROLIZA el resto de glucosa unido en a(1-6).
3) Fosfoglucomutasa
Se encarga de transformar la glucosa-1-P en glucosa-6-P. Esta reacción,
perfectamente reversible, transcurre mediante un mecanismo en el que se origina
glucosa-1,6-bis-fosfato.
glucosa-1-P
glucosa-6-P
En el hígado existe otra enzima muy importante, la glucosa-6-fosfatasa, necesaria
para que pueda cumplir su función de proveedor de glucosa a otros tejidos.
glucosa-6-P + H2O
glucosa + Pi
1
1.1.2 REGULACIÓN DE LA DEGRADACIÓN Y SÍNTESIS DEL GLUCÓGENO
(SEGUNDOS MENSAJEROS, FOSFORILACIÓN-DEFOSFORILACIÓN DE
PROTEÍNAS).
Síntesis y degradación tienen una regulación contrapuesta.
La regulación implica control alostérico, llevado a cabo por METABOLITOS y
también por modificaciones covalentes, realizada por ENZIMAS bajo CONTROL
HORMONAL.
Regulación de la glucogenolisis
El punto de regulación es la glucógeno fosforilasa, que existe en dos estados
conformacionales diferentes: fosforilasa B (muy poco activa) y fosforilasa A (muy
activa).
Debido al diferente papel del glucógeno muscular y el hepátco, la regulación es
diferente en estos órganos.
REGULACIÓN DE LA GLUCOGENOLISIS MUSCULAR
El glucógeno del músculo esquelético tiene como finalidad suministrar glucosa para
que sea degradada oxidativamente y se pueda obtener ATP para la actividad
muscular.
1) REGULACIÓN POR MODIFICACIÓN COVALENTE
Consiste en modificar la actividad de la glucógeno fosforilasa mediante
fosforilación: la fosforilasa B (poco activa) no está fosforilada, mientras que la
fosforilasa A (muy activa) se encuentra FOSFORILADA. Esta regulación está
sometida a control hormonal.
ACTIVACIÓN POR FOSFORILACIÓN
Cuando se precisa realizar trabajo muscular, el SNC estimula la médula adrenal, que
segrega ADRENALINA.
El segundo mensajero (celular) de la acción hormonal es el AMP CÍCLICO (cAMP),
que es sintetizado por la adenilato ciclasa.
La activación (=fosforilación) de la glucógeno fosforilasa se lleva a cabo mediante
una serie de reacciones en cascada, que son:
Unión adrenalina-receptor.
2
Activación de la adenilato ciclasa.
Activación de la proteína cinasa.
Activación de la fosforilasa quinasa.
Activación de la glucógeno fosforilasa.
INACTIVACIÓN POR DESFOSFORILACIÓN
La desfosforilación de las enzimas fosforiladas provoca su inactivación.
En el músculo la fosfoproteína fosfatasa-I (PP1) desfosforila las enzimas
fosforiladas de la cascada metabólica y, por tanto, detiene la glucogenolisis. La PP1
tiene, además, un inhibidor específico, el cual se une a la enzima, y la inhibe, cuando
está fosforilado.
La PP1 actúa únicamente cuando se encuentra unida al glucógeno, a través de su
subunidad G. Cuando la cascada metabólica cAMP-dependiente se encuentra
activada, dicha subunidad se encuentra fosforilada y no posee afinidad por la PP1.
Con ello, la PP1 es inactiva.
Cuando cesan el impulso del SNC y la acción hormonal, disminuye la actividad
fosforilasa quinásica y el balance quinasas/fosfatasas comienza a decantarse
hacia éstas últimas, y el sistema se desfosforila y se detiene la glucogenolisis.
2) REGULACIÓN POR INTERACCIONES ALOSTÉRICAS
La glucógeno fosforilasa posee, además, un sistema de regulación alostérica que
responde inmediatamente a las condiciones celulares en las que existe una baja
carga energética, y que es independiente de la respuesta hormonal. El control
alostérico se explica según el modelo alostérico concertado MWC.
REGULACIÓN DE LA GLUCOGENOLISIS HEPÁTICA
El glucógeno hepático sirve como fuente de glucosa para los tejidos extrahepáticos,
incluído el músculo esquelético, ante un descenso de la glucemia.
1) REGULACIÓN POR MODIFICACIÓN COVALENTE
También consiste en la modificar la actividad de la glucógeno fosforilasa mediante
fosforilación: la fosforilasa B (poco activa) no está fosforilada, mientras que la
fosforilasa A (muy activa) se encuentra FOSFORILADA.
ACTIVACIÓN POR FOSFORILACIÓN
La cascada metabólica que dispara las fosforilaciones está activada por el glucagón,
aunque también la cascada es sensible a la adrenalina. Los mecanismos en ambos
casos son diferentes.
El glucagón (sintetizado por la células a de los islotes de Langherans del páncreas,
en respuesta a un descenso en la glucemia) impulsa una cascada de fosforilaciones
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utilizando el cAMP como segundo mensajero y la adrenalina tiene dos receptores
diferentes: a- y b-adrenérgicos. Según se una a uno u otro el mecanismo será
diferente, ya que usan segundos mensajeros diferentes.
El receptor a-adrenérgico tiene al cAMP como segundo mensajero desencadenante
de la cascada metabólica de fosforilaciones.
El receptor b-adrenérgico tiene al Ca2+ como desencadenante de la cascada
metabólica de fosforilaciones. Pero el Ca2+ necesita, a su vez, al inosotol 1,4,5-trisfosfato (IP3) como segundo mensajero para poder ser liberado al citoplasma.
INACTIVACIÓN POR DESFOSFORILACIÓN
La actividad de la PP1 está regulada por su unión a la glucógeno fosforilasa-A en
forma R. Esta forma tiene escondidos los fosfatos de la Ser, pero cuando pasa a la T
los expone y la PP1 los elimina, pasando la enzima a la forma B, inactiva.
2) REGULACIÓN POR INTERACCIONES ALOSTÉRICAS
En el hígado la regulación alostérica es algo diferente:
El
AMP
no
activa
la
glucógeno
fosforilasa-B.
La glucosa inhibe la glucógeno fosforilasa-A, desplazando su equilibrio
alostérico hacia el estado tenso (T).
REGULACIÓN DE LA GLUCOGENOGÉNESIS MUSCULAR
El punto de regulación es la glucógeno sintasa, que existe en dos estados
conformacionales diferentes: sintasa B (muy poco activa) y sintasa A (muy activa).
1) REGULACIÓN POR MODIFICACIÓN COVALENTE
Consiste en modificar la actividad de la glucógeno sintasa mediante fosforilacióndesfosforilación: la sintasa B (poco activa) está fosforilada, mientras que la sintasa
A (muy activa) se encuentra DESFOSFORILADA. Esta regulación está sometida a
control hormonal.
INACTIVACIÓN POR FOSFORILACIÓN
La enzima fosforilasa quinasa (aquí llamada GSK2) activa la glucógeno
fosforilasa por fosforilación y, al mismo tiempo, INACTIVA la glucógeno sintasa.
Otras quinasas que fosforilan la glucógeno sintasa son la cAPK (aquí llamada
GSK1) y otra quinasa específica de la sintasa, llamada GSK3.
La glucógeno sintasa (es un homotratrámero) tiene hasta nueve sitios de
fosforilación. Cuanto más fosforilada está, menos activa es.
ACTIVACIÓN POR DESFOSFORILACIÓN
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Cuando cesa la cascada metabólica cAMP dependiente, activada por por la
adrenalina, las fosfatasas desfosforilan todas las quinasas, la glucógeno
fosforilasa y ... también la glucógeno sintasa, la cual pasa de la forma B
(fosforilada e inactiva) a la A, desfosforilada y activa.
Además de esa respuesta glucogenogénica a la falta de estimulación adrenal, la
glucógeno sintasa es activada por la presencia de insulina hormona secretada por
el páncreas ante el aumento de la glucemia.
La insulina activa una proteína quinasa, que fosforila el sitio 1 de la subunidad G
de la PP1, activando su actividad fosfatásica, la cual desfosforila la glucógeno
sintasa, activándola.
La adrenalina y la insulina son pues antagonistas en las células musculares.
REGULACIÓN DE LA GLUCOGENGÉNESIS HEPÁTICA
La fosforilación de la glucógeno sintasa la realiza la cAPK, tras la estimulación
hormonal del glucagón, lo que provoca su inactivación (forma B, o GS-B).
Por otro lado, la PP1, encargada de desfosforilar el sistema, se une fuertemente a la
glucógeno fosforilasa-A, no estando disponible, en primer término, para actuar
sobre la sintasa.
Sólo cuando la glucógeno fosforilasa-A ha sido desfosforilada por la PP1, ésta se
libera y podrá actuar sobre la glucógeno sintasa, desfosforilándola y, activándola.
Cuando sobra glucosa este compuesto, se une al estado T de la glucógeno
fosforilasa-A, estabilizándolo, y favoreciendo entonces su desfosforilación.
METABOLISMO DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO Y CONTROL DE LA GLUCEMIA
Cuando se suministra glucosa, la actividad de la glucógeno fosforilasa-A hepática
disminuye rápidamente y, después de un tiempo (o tiempo de latencia) aumenta
rápidamente la actividad glucógeno sintásica.
El sistema de sensibilidad a la glucemia depende de tres cosas:
1. La comunicación, en la glucógeno fosforilasa-A entre el centro alostérico para la
glucosa y el resto de fosfato de la serina.
2. La utilización de la PP1 para inactivar la glucógeno fosforilasa-A y activar la
glucógeno sintasa-B.
3. la unión de la PP1 a la glucógeno fosforilasa-A, a fin de evitar la actuación
prematura de la glucógeno sintasa-A.
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NOTAS ACERCA DE LA METODOLOGÍA
MUTAGÉNESIS SITIO-DIRIGIDA
Usando la técnica de mutagénesis sitio-dirigida la información en el material genético
puede ser cambiada. Un fragmento sintético de ADN se utiliza como herramienta
para cambiar una palabra del código, en un sitio particular de la molécula de ADN.
Esta molécula reprogramada de ADN puede dirigir la síntesis de una proteína con un
aminoácido intercambiado. El método de Michael Smith se ha convertido en una de
las técnicas más importantes de la biotecnología
Ilustración de los pasos básicos del método a mutagénesis sitio-dirigido.
(1) Reproducir el ADN de interés en un plásmido vector
(2) El ADN del plasmido se desnaturaliza para producir una sola cadena
(3) Un oligonucleotido sintético con la mutación deseada (mutación puntual,
deleción, o inserción) se une a la región blanco. En esta figura, se usa como
ejemplo, una mutación puntual de T por G.
(4) Amplificar el oligonucleótido usando una cadena de ADN de un plásmido,
como plantilla.
(5) El heteroduplex es propagado por transformación en E. coli.
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Después de la propagación, en teoría, cerca del 50% de los heteroduplex
producidos serán mutantes y el otro 50% serán del "tipo salvaje" (sin mutación).
En ensayos comerciales de mutagénesis, algunos métodos de selección y de
enriquecimiento se han utilizado para favorecer la producción de mutantes.
Premio Nobel de Química 1993
La Real Académia Sueca de Ciencias otorgo el premio Novel de Química en el año
de 1993 a:
Michael Smith
(Canada), por
sus contribuciones al
establecimiento y desarrollo de la técnica de mutagénesis sitiodirigida y de su desarrollo para el estudio de las proteínas.
Kary B. Mullis (Estados Unidos). Por su invención de la técnica
de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
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Bibliografía.
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