FICOLL - inmunopracticas

FICOLL
A) Equipamiento.
-Tubos de plástico de centrífuga de 50 ml.
-Pipetas Pasteur de distintos tamaños.
-Centrífuga refrigerada.
-Micropipetas automáticas de distintos tamaños.
B) Reactivos.
-Ficoll-Histopaque de densidad 1.078.
-Ficoll-Histopaque de densidad 1.119.
-Medio completo (RPMI + 10% FBS).
-Suero Salino.
-Tampón fosfato PBS.
C) Realización de medios.
CFSE: Se toman 6 µL de solución madre + 54 µL RPMI-1640.
Medio Completo: RPMI + 10% FBS).
Dynabeades CD3/CD28 T Cell Expander (solución 1:20, 4 µL T Cell Expander
solución madre + 76 µL de medio completo).
D) Procedimiento.
En un tubo cónico de centrífuga, de 50 mililitros, se depositan los dos
gradientes de Ficoll-Histopaque de densidades diferentes, una que se coloca
primero de densidad 1.119 y otra que se coloca lentamente sobre la anterior,
de densidad 1.078. Sobre estos dos colchones de Ficoll-Histopaque de 10 ml
de volumen cada uno, se añaden muy suavemente otros 10 ml de sangre
diluida 1:1 en Suero Salino, que ha sido obtenida estérilmente por
venopunción en tubos que contienen heparina litio como anticoagulante. La
sangre diluida se deja resbalar por las paredes del tubo para que se deposite
sobre el gradiente de Ficoll de densidad 1.078.
Los tubos se centrifugan a 2.500 rpm durante 30-40 minutos a temperatura
ambiente.
PUNTO CRÍTICO!!! No poner el freno en la centrífuga!!!
Tras la centrifugación se observan dos halos opacos en la interfase: el
superior correspondiente a las células mononucleares y el inferior a las
polinucleares.
Ambos halos se recogen por separado y se lavan las células tres veces con
medio de PBS.
Se resuspenden en un medio completo (1 mL).
RECUENTO EN PLACA
Los botones celulares resultantes se resuspenden en 1 ml o más de medio
de cultivo completo cada uno, según el tamaño del botón, se cogen 20 µL de
cada muestra, con pipeta de precisión tipo Hamilton, y se extiende en
cámaras de Neubauer separadas para su contaje en microscópio.
Se ha de teñir con Azul de Tripan para colorear células muertas, en dilución
1:5. (20 µL muestra: 80 µL Azul de Tripan).
La cámara de Neubauer consiste en una placa gruesa de cristal en forma de
porta, cuya porción central está dividida en tres bandas perpendiculares al
eje longitudinal de la cámara. De ellas, las dos laterales se hallan
sobreelevadas 0´1 mm con respecto a la central, y en esta última hay
grabado un retículo cuadrangular. La banda central puede estar, a su vez,
subdividida en dos semibandas idénticas y separadas por un surco paralelo
al eje longitudinal de la banda. En cada una de estas dos semibandas hay
grabado un retículo idéntico.
Lectura y ajuste de concentración celular: Como se cuentan los linfocitos
presentes en 4 cuadrados grandes del retículo, hay que dividir por 4 la cifra
obtenida en el recuento, para calcular el número de leucocitos que hay en 1
cuadrado grande.
Como la longitud de cada uno de los lados de los cuadrados grandes es de 1
mm, y la longitud del espacio comprendido entre éstos y el cubre es de
0´1mm; hay que multiplicar por 10 el resultado anterior, para determinar el
número de linfocitos existentes, no en 0´1 mL, sino en 1 mL.
En definitiva, para su cálculo puede emplearse la siguiente fórmula:
RL= L/2 x 104 x D
RL= Recuento de linfocitos (número de linfocitos por mL de la suspensión
celular).
L = Linfocitos contados en 4 cuadrados grandes.
D= Factor de dilución (1/dilución).
CFSE
Protocolo
¾ de la muestra la marcaremos. El resto será un control sin marcaje.
1. CFSE a -20oC. Se diluye 1/10 con RPMI-1640.
2. Se preparan 15µL de CFSE con la muestra en una concentración de 5×106/
mL.
3. PUNTO CRÍTICO!!! Agitar con cuidado para no formar espuma!!!
4. Incubar a temperatura ambiente 30 minutos en oscuridad. Agitar cada
cierto tiempo.
5. Añadir FBS en dilución 1:1 para parar reacción porque tiene muchas
proteínas.
6. Lavar células a 37oC con medio completo y resuspender.
7. Repetir al menos una vez el paso número 5.
8. Se transfiere 100 µL a pocillos estériles.
T CELL EXPANDER
Para la expansión policlonal de linfocitos T se recomienda usar 3 bolas por
cada linfocito T.
1. Se transfieren 4 µL de Dynabeades CD3/CD28 T Cell Expander
(solución 1 :20) a cada pocillo.
2. Dejar en incubadora
3. Incubar hasta el cuarto día.
MARCAJE
Para la conjugación de los anticuerpos monoclonales ha de añadirse 5 µL. El
tiempo de incubación lo realizaremos de 20 minutos en frío.
Se realizará tres lavados para quitar el exceso de anticuerpo y obtener una
imagen lo más clara posible con FBS 1%.
Los anticuerpos utilizados serán:
FL1
FL2
FL3
FL4
PE
PERCP
APC
CFSE
CD8
CD4
CD3
CFSE
CD56
CD3
CD19
Tubos de ajuste del citómetro:
FL1
FL2
FL3
FL4
PE
PERCP
APC
CFSE
CFSE
CFSE
CFSE
CD8
CD8
CD8
CD4
CD4
FLUOROCROMOS
Detección de células T.
Detección de células T, B y NK.
FLUOROCROMOS
Células sin marcar
CD3
Tubos Controles
Controles Negativos:
1. muestra sin marcaje
2. muestra marcada sin proliferación (T CELL EXPANDER)
Distribución en placa con pocillos:
Leyenda:
Células + CFSE + T Cell Expander
Células + CFSE
Células + T Cell Expander
Células
Ajustes citómetro
PBS para evitar desecación.
Ejemplos de cálculos:
Si partimos de 20 mL de sangre tomaremos:
10 mL de ficoll + 10 mL de sangre + 10 mL de PBS. (por duplicado)
Contaje de células:
Suponiendo 20 millones de células:
15 millones de ellas para marcar y 5 para no marcar
Aplicando la fórmula CV= C’V’ en el caso de que tengamos 107 células/mL;
tomamos 1,5 mL para marcar y 0,5 mL para no marcar.
La muestra para marcar se diluye a 1:2 consiguiendo 5 x 106 células/mL.
Se añade 15 µL de CFSE.
Se añade a la muestra que se va a marcar 4 µL de T Cell Expander.
Se añade a la muestra que no se va a marcar 4,5 mL de T Cell Expander.
Pocillos:
Se añade de la muestra marcada 100 µL al pocillo + 100 µL de medio
completo.
Se añade de la muestra no marcada 100 µL al pocillo + 100 µL de medio
completo.