Guía del Usuario de SNP - Universidad de Córdoba

GUIA DE USUARIOS DE GENOTIPADO (SNPs)
El análisis de polimorfismos de una sóla base (SNPs) se puede realizar mediante
diversas técnicas. Según los equipos existentes en la Unidad, las posibilidades son las
siguientes:
1) Análisis de SNPs mediante los kits SNaPshot (SBE/Minisecuenciación) y SNPlex
de Applied Biosystems (analizadores genéticos multicapilares).
2) Discriminación alélica mediante Sondas Taqman (Real-Time PCR 7500Fast de
AB).
3) Screening a gran escala mediante D-HPLC (Varian) que permite detectar
cualquier variación en la secuencia de DNA (SNPs, deleciones, inserciones,
etc…).
Las dos primeras son factibles de utilizar siempre que el SNP sea conocido. Por el
contrario, la principal ventaja de la técnica de D-HPLC es que no requiere conocimiento
previo de la región a estudiar.
Para detectar los tres genotipos se puede emplear las dos primeras, la tercera solo
permite detectar homocigoto/heterocigoto.
1. Primer Extension Analysis: SNaPshot kits, ddNTP* = Minisecuenciación = Single
Base Extensión (SBE).
 Se basa en el uso de cebadores específicos (sin marcar) adyacentes a la base a
determinar.
SNP
Primer
Figura 1. Diseño de Primer para
SNaPshot.
Molde
 Se realiza una reacción de PCR sólo con los 4 didesoxinucleótidos marcados cada
uno con un fluoróforo diferente sobre el molde de DNA previamente amplificado y
purificado (pueden ser uno o varios los moldes a analizar en una sola reacción de
SNaPshot)
Terminadores (dideoxi), cada uno
marcado con un fluorocromo
diferente (más la polimerasa,
buffer, etc…)
Molde DNAamplificadopurificado
Primer
AmpliTaq FS
Figura 2. Reacción de Primer Extensión (Kit SNaPshot).
-1-
 La detección de la base incorporada revela la presencia/ausencia de polimorfismo y el
genotipo.
Color=Genotipo
Figura 3. Electroforesis y Análisis de Reacción de SNaPshot.
1.1. Diseño del ensayo.

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
El primer debe ser diseñado para que termine justo en el 5´ del SNP, es decir,
justo antes de la base a determinar.
Tm > 50ºC (la reacción es más eficiente).
Puede ser diseñado tanto en la cadena foward (directa) como en la reverse
(reversa). Se recomienda chequear la secuencia en la web
http://bioinfo.math.rpi.edu/mfold/dna/forml.cgi para ver en que dirección es
más accesible el primer al SNP.
Se debe chequear el primer para evitar la formación de dimeros, hairpins, etc…
La longitud debe estar entre 20-30 nucleótidos y ser purificados mediante
HPLC (sobre todo aquellos > 30 nt).
PCR y Análisis: ¿Simple o Múltiple?
Tm
PCR
RUN
POSICIONES
A
Distinta
Simple
Simple
1
B
Distinta
Simple
Múltiple
2-10*
C
Igual
Múltiple
Múltiple
2-10*
* Primers de diferente longitud


Hay dos tipos de multiplex
o En base al tamaño del primer
o En base al color del polimorfismo (solo cuando no sean coincidentes
los genotipos a distinguir)
Para realizar multiplex con primers que tengan igual Tm, estos se diseñan con el
mismo nº de nt y la diferencia de longitud se consigue mediante la adicción de
colas inespecíficas poliAT en 5´. Se recomienda que los primers difieran entre si
4’6 nt (Fig. 4).
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D
nnnnnnnnnnnnnNnnnnnnnnnNNnnnnnnnnnnnnNnnnnnnnnnn
A
(AT)4
(AT)8
B
C
20nt
A
24nts
(AT)12
20nt
B
28nts
(AT)16
C
32nts
20nt
D
36nts
Cola inespecífica
Electroforesis
No afecta:
Hibridación
Condiciones de PCR
Afecta:
Movilidad
33
25
20nt
29
37
Tamaño
Locus?
Color
Alelo?
Figura 4. Ejemplo de búsqueda de 4 SNPs en una mismo producto de PCR
•
Para los fragmentos muy pequeños (primers menores de 36 nt) es complicado
predecir la mobilidad por lo que es recomendable probarlos previamente por
separado antes de correrlos juntos. Existe para ello el SNaPshot Primer Focus
kit de Applied Biosystem. Lo que se hace es añadir las 4 posibles bases a los
primers a evaluar, lanzar una carrera con ellos y ver si se solapan entre ellos
1.2. Requisitos de las muestras.



El usuario puede entregar las reacciones de SNPs ya preparadas para la
electroforesis capilar o los productos de PCR previamente purificados (SAP y
ExoI) (indicar en el formulario de solicitud).
El producto de PCR, siempre que sea posible, debe tener una longitud mínima
de 300 pb. Cuantificar los productos de PCR en un gel de agarosa y entregar
un volumen minimo de 10 l (más de5 ng/l).
Como se detallaba en el diseño del experimento, los cebadores deben haber
sido purificados mediante HPLC, de longitud comprendida entre 20 y 30 nt y a
una concentración de 2 µM.
1.3. Entrega de muestras.
El envío de las muestras puede realizarse de alguna de las siguientes formas:

Servicio
de
mensajería
con
portes
pagados
a
Unidad
de
Genómica.
Universidad
de
Campus de Rabanales. Edificio Ramón y Cajal.
14071.Córdoba.Tel: 957-218587 e-mail: [email protected]
la
dirección:
Córdoba.
3ª Planta.
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
Entrega directa en la Unidad.
Para la solicitud del Servicio de Análisis de SNPs el horario de recepción de
muestras será de 9 a 14 horas los días laborables. Las muestras deberán de ir
acompañadas del “formulario de solicitud” (ver apartado de Formularios y
Manuales) correspondiente debidamente cumplimentada y el cual debe ser remitido
a la Unidad vía e-mail ([email protected]).
1.4. Entrega de resultados.
Los resultados se pueden enviar en formato electrónico a través de e-mail o en
disco. En este último caso, el soporte informático deberá ser suministrado junto
con las muestras y podrá ser recogido en la Unidad o ser enviado a portes debidos a
la dirección que se indique. Las muestras de análisis de fragmentos serán
conservadas durante un mes. En caso de que el usuario quiera recuperar dichas
muestras podrá hacerlo personándose en la Unidad dentro del plazo.
Programas para visualizar los ficheros:
Si el usuario no dispone de los softwares de análisis específicos (GeneScan,
Genotyper o GeneMapper), existe en la Unidad un ordenador con dichos
programas y a disposición del usuario que lo solicite.
4.INFORMACIÓNADICIONAL.
El Servicio pone a disposición de los usuarios la asesoria científica-técnica necesaria
para ser usuarios de este Servicio asi como para la optimización de cualquier técnica
compatible con la instrumentación científica disponible en la Unidad de Genómica. En
caso de duda, aclaratorias sobre cualquier punto, etc... puede ponerse en contacto con la
Unidad a través de nuestros teléfonos o e-mail.
957 21 85 87 o [email protected]
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