guias de laboratorio 382

PRACTICO N° 1
INTRODUCCIÓN A LAS COLUMNAS CAPILARES
A. OBJETIVOS
1.
Familiarizarse con las columnas capilares y la instrumentación
requerida por ellas.
2.
Calcular el volumen muerto, velocidad lineal del gas portador( ),
flujo volumétrico y razones de divis ión.
3.
Estudiar el efecto de  en el tiempo de análisis y en la resolución.
B. PROCEDIMIENTO
1.
Discusión sobre la sílica fundida (estructura química, cómo se
dibuja), recubrimiento de poliimida y sobre como cortar y examinar
los extremos de las columnas ( uso de lentes de aumento o
microscopio ).
2.
Discusión del sistema cromatográfico: gas portador, sistema de
inyección (limpieza y reemplazo de inserto y septum), instalación de
columnas, elección de temperaturas y flujos de trabajo.
3.
Instalación de columnas capilares: medición de  con propano
(metano), ajuste de la presión en la cabeza de la columna (si es
necesario).
4.
Cálculo de la razón de división:



5.
Cálculo del volumen de la columna
Cálculo del flujo volumétrico
Cálculo del flujo “split” utilizando un me didor de flujo de burbuja.
Inyección de una muestra estándar a 4 flujos diferentes, (ej.: 40, 80,
120, 160 cm/s). Examinar el efecto de  sobre la resolución y el
tiempo de análisis.
TABLA DE DATOS
VALOR MEDIDO
VALOR NORMAL
Temperatura Columna
ºC
Largo (L)
m
Fase estacionaria
I.D.
mm
m
Espesor del film
Gas portador
Helio o Hidrógeno
Temperatura Detector
ºC
Gas combustible (FID)
Hidrógeno
mL/min
Aire
mL/min
Make-up Nitrógeno
mL/min
Temperatura Inyector
ºC
Tm
s

cm/s
Fc
mL/min
Flujo Split (Fs)
mL/min
Razón split
Ecuaciones:
L
= largo de la columna
tm
= tiempo de retención del metano

= velocidad lineal promedio del gas
Fc
= flujo volumétrico = (volumen de la columna/tm) =  r 2 L;
r = radio columna; L = largo columna
Razón de división (Split)
= L/tm (cm/s)
= Flujo split (Fs)/ Flujo columna (Fc)
ID=diámetro interno
C. BIBLIOGRAFÍ A:

Manual Supelco

Fotocopias, guía del profesor

Libros usuales de análisis Instrumental(Skog y W est, Skog y Leary,
W illard)

Internet, etc.
PRÁCTICO Nº 2
DETERMINACIÓN DE NITRITOS EN CECINAS SEGÚN MÉTODO
MODIFICADO DE GRAU -MIRNA
FUNDAMENTO : El método se basa en la diazociación del ácido sulfanílico con
el nitrito, y posterior copulación con el clorhidrato de naftilamina para formar un
compuesto azo coloreado, cuya absorción se lee en un espectrofotómetro a 520
nm.
MATERI ALES Y EQUIPOS:




Espectrofotómetro.
Balanza analítica.
Baño de vapor.
Juguera.
RE ACTIVOS:

Reactivos de Griess
Griess I : Pesar 0,5g de ácido sulfanílico, agregar 30mL de ácido acético glacial
y 120 mL de agua. Disolver en caliente y filtrar. Conservar en refrigeración.
Griess II : Pesar 0,1g de alfa -naftilamina y disolver en 120 mL de agua caliente,
enfriar y luego agr egar acético glacial y filtrar. Conservar en refrigeración.



Solución de sulfato de zinc 0,42M.
Solución de hidróxido de sodio al 2%.
Solución patrón de sodio.

Solución madre de nitrito de sodio : Pesar 0,5 g de nitrito de sodio de pureza
conocida y disol ver en 1L de agua (1mL = 0,5mg nitrito de sodio).

Solución de trabajo : Diluir 1mL de la solución madre en 100mL de agua (1mL
= 0,005mg de nitrito de sodio).
Curva de calibración : Agregar 1 -2-5-7-9mL de la solución de trabajo en matraces
volumétricos de 50mL. Agregar luego 1mL de la solución de Griess I y 1mL de la
solución de Griess II, agitar y aforar. Leer a los 20 minutos a 520 nm. Graficar
Absorbancia v/s mg de nitrito de sodio.
PROCEDIMIENTO
1. Pesar 5 g de muestra previamente homogeneizada.
2. Transferir a juguera, agregar 40mL de agua a 80ºC y mezclar perfectamente,
cuidando de que no queden grumos.
3. Transferir a un vaso precipitado o a un matraz Erlenmeyer.
4. Colocar a baño María por 2 horas. Agitar enérgicamente, ocasionalmente.
5. Agregar 10mL de solu ción de sulfato de zinc y 12mL de solución de hidróxido
de sodio, agitar por 10 minutos más.
6. Enfriar y transferir por medio de filtración por algodón a un matráz aforado de
250mL, aforar con agua destilada.
7. Tomar alícuotas del filtrado, de acuerdo al pro bable contenido de nitritos, y
agregar 1mL de solución de Griess I y II, agitar y aforar a 50mL. Leer a los 20
minutos a 520nm.
CÁLCULOS
De acuerdo a la interpolación realizada en la gráfica, y a las diluciones
realizadas, calcule las partes por millón (mg/L) de nitrito en la muestra.
OBSERV ACIONES

Las soluciones altamente coloreadas que den lecturas bajo 20% T, se deben
repetir necesariamente tomando una alícuota menor, así como las lecturas de
más de 90% se tomará una alícuota mayor.

En lo posible se debe leer a los 20 minutos, ya que aumenta la intensidad del
color con el tiempo, especialmente en sets de muestras con más de 10 ppm,
se debe agregar las soluciones Griess I y II en intervalos de 10 minutos.
BIBLIOGRAFÍ A




“Tóxicos Químicos en Alim entos” , Schmidt-Hebbel.
“Determinación de Nitritos en Cecinas” , Oscar Perez.
Libros de Química de los Alimentos.
Ver Reglamentación.,etc.
PRÁCTICO Nº3
DETERMINACIÓN DE FURFURAL POR METODO ESPECTRROFOTOMÉTRICO.
Fundamento Teórico: El fulfural presenta la propiedad de combinarse con la anilina en
medio acético un compuesto de color rojo anaranjado. La intensidad del color es
proporcional a la concentración del furfural pudiendose comparar con soluciones patrón
para su determinación cuantitativa.
En la reacción, es muy sensible el grupo carbonilo, se puede condensar con las
aminas aromáticas para dar origen a los compuestos coloreados conocidos como bases
de schiff. Es conveniente emplear anilina pura y recien destilada.
Procedimeinto:
Destilación simple
-Medir exactamente 100mL del licor a un matraz de aforo y tomar la temperatura del
licor.
-Verter el licor en un balón de destilación y enjuagar tres veces el matraz con una
pequeña cantidad de agua destilada.
-Neutralizar el licor con aproximadamente 2mL de hidróxido de sodio 5N.
-Agregar perlas de ebullición, a fin de obtener una destilación uniforme.
-Por otra parte, agregar 10 mL de agua destilada a un matraz de 100mL y sumergir el
tubo del refrigerante en el agua.
-Cuando toda la instalación balón-matraz ha terminado, dar el agua al refrigerante y
encender la manta calefactora.
-Regular la temperatura a fin de obtener una ebullición adecuada.
-Recibir aproximadamente, el 75% del destilado en el matraz colector(matraz de 100mL).
-Detener el proceso de destialción.
-Aforar el matraz con agua destilada y homogenizar, para que de esta manera, el
destilado quede listo para su análisis.
-Conservar el destilado tapado y refrigerado, para evitar la volatilización de los
componetes.
***El destilado debe servir para 2 prácticos, por lo cual debe ser traspasado a una botella
desechable y de cierre hermético***
Reactivos y soluciones
Preparación de soluciones
-Preparación de alcohol exento de aldehídos.
1.-Hervir suavemente y bajo reflujo 1 litro de etanol durante 2 0 3 horas, habiendose
agregado previamente unas 10 lentejas de hidróxido de sodio y alguanas bolitas de
vidrio.
2.-Al cabo de este tiempo, destilar la solución gota a gota.
3.-Verificar que el alcohol obtenido sea exento de aldehídos agregando 4mL del reactivo
de schiff en 10mL de destilado llevado en 50 G.L.
*Este procedimiento, permite polimerizar y precipitar los aldehídos, es un método
automático que no disminuye la graduación alcohólica, pero de muy lento y de bajo
rendimiento, por lo que, el proceso debe repetirse varias veces.
Preparación de las soluciones patrón de furfural
-Preparar una solución madre de 1g/100mL. Luego, diluir ésta solución 100 veces con
alcohol de 50G.L, a partir de la cual se toman alícuotas de 0,25; 0,50; 0,78; 1,00; 1,25 y
1,50mL a partir de la solución de trabajo y se lleva a matraz de 25mL, aforados con
alcoholde 50 G.L.
Destilación de anilina
-La anilina comercial es coloreada debido a la presencia de compuestos oxidados como
consecuencia de la exposición a la luz y al aire, por lo que es necesario destilarla.
-En un balón de destilación introducir 200mL de anilina y agregar 1 a 2g de zinc en
polvo.
-Desechar las primeras porciones de destilado y cuando este comienza a salir limpio e
incoloro, recibir en un matraz limpio y seco, eliminando las últimas porciones dee
destilado.
Preparación de la muestra
-Para la determinación de furfural se requiere que el alcohol obtenido después de haber
destilado el líquido original sea llevado a la graduación de 50G.L. Para proceder a esta
operación efectuar la cruz de las mezclas o los cuadrados de Pearson, determinando las
diferencias entre el grado deseado y el que se tiene.
Análisis por espectrofotometría
-Medir la intensidad del color en un Spectronic 20.
-Tomar 10mL del destilado llevado a 50º en un tubo de ensayo.
-Agregar 10 gotas de anilina incolora y 1mL de ácido acético glacial.
-Agitar y dejar en reposo durante 10 minutos.
-Efectuar la misma operación con las soluciones de la curva de calibración.
-Considerar un blanco.
-Al término de este tiempo, medir la intensidad del color a una longitud de onda de
520nm.
- Si la muestra es muy concentrada, efectuar una dilución con alcohol de 50º.
INFORME: Calcular las ppm de furfural en licor de 100º.
BIBLIOGRAFÍA :
-Análisis de metanol, alcoholes superiores y furfural en bebidas alcohólicas por
cromatografía de gases. Autores: Natalia Garay y Paula Parra.
- Manual A.O.C.
Práctico Nº4
DETERMINACIÓN DE METANOL Y ALCOHOLES SUPERIORES POR CROMATOGRAFÍA
DE GASES.
A. FUNDAMENTO TEÓRICO
La muestra de licor es analizada por cromatografía de gases. Para ello se
introduce una cantidad de muestra destilada en la cámara de inyección del cromatógrafo,
usando una microjeringa. La muestra se vaporiza y es arrastrada por el gas portador hacia la
columna cromatográfica capilar de diámetro ancho, donde los componentes de la mezcla son
separados en función de sus características fisico-químicas. Los componentes separados
llegan al detector de ionización por llama generándose aquí una señal eléctrica proporcional a
la concentración de cada componente. La señal es amplificada y transmitida a un registrador –
integrador. La cuantificación se realiza por el método del estándar interno.
B. REACTIVOS Y SOLUCIONES









Acetato de etilo, p.a.
1-Butanol, p.a.
1-Propanol, p.a.
Metanol, p.a.
2-metil-1-propanol, p.a.
1-pentanol, p.a.
3-metil-1-butanol, p.a.
Etanol, p.a.
2-metil-2-Butanol, p.a. (estándar interno)
Preparación de Soluciones
- Preparación de solución stock:
Pesar, con precisión al 0,1 mg en balanza analítica; 0,90 g de metanol; 0,20 g de
1-propanol; 0,15 g de acetato de etilo; 0,5 g de 2-metil-1-propanol; 0,10 g de 1-butanol; 0,50 g
de 3-metil-1-butanol y 0.15 g de 1-pentanol, en un matraz de aforo, completando el volumen a
100 mL con una solución hidroalcoholica al 40%v/v.
- Preparación de patrón interno:
Pesar; 2,5 g de 2-metil-2-butanol, en una balanza de precisión 0,1 mg y enrasar a
1 L con una solución hidroalcohólica al 40%v/v.
- Preparación de la solución de calibración:
Con una pipeta aforada tomar 5 mL de la solución stock de alcoholes y ésteres, y
5 mL de patrón interno, trasladar a un matraz aforado de 50 mL, completando el volumen con
solución hidroalcohólica al 40% v/v. Conservar en refrigeración para evitar evaporación.
C. PROCEDIMIENTO
Análisis cromatográfico
1. Instalar una columna capilar RTX-20 utilizando férulas de grafito para asegurar conexiones
herméticas.
2. Encender el cromatógrafo de gases, abrir la válvula del gas portador (N) y regular
cuidadosamente su flujo.
3. Ajustar las condiciones cromatográficas.
4. Abrir las válvulas de los otros gases, primero el aire y luego el hidrógeno.
5. Con una solución de jabón o detergente, verificar fugas de gases en todas las conexiones.
6. Encender el detector y obtener una línea de base estable.
Condiciones Cromatográficas
-Tº inicial del horno
= 35ºC.
-Tº final del horno
= 90ºC.
-Tiempo inicial
= 5min.
-Tiempo final
= 5min.
-Velocidad de calentamiento
= 10 ºC/min.(RATE =rampa)
-Tº inyector
= 180ºC.
-Tº detector
= 180ºC.
-Flujo del gas portador
= entre 5 y 6,2 mL/min.
Condiciones de integración
-Atenuación
-Nivel de ruido
-Chart speed
-Pk wd
=0
= 0.
= 1cm/min.
= 0,16.
Luego de establecidas las condiciones cromatográficas, se procede a la determinación de los
parámetros en estudio.
Preparación de la muestra:
1. Tomar 5 mL de la solución stock de patrón interno con una pipeta aforada y trasladar a un
matraz, aforar a 50 mL con la muestra de licor destilado (del práctico anterior),
homogeneizar la solución resultante.
2. Limpiar la microjeringa con etanol absoluto.
3. Ambientar la microjeringa con la muestra, tomar 0,5 uL e inyectar.
4. Inyectar la solución de calibración bajo las mismas condiciones.
INFORME : Determinación de los analitos en la muestra de licor destilado en g/L. Comparar
método con A.O.A.C. Comparar resultados con Ley de alcoholes. Discutir el por qué del orden
de elución incluyendo todos los factores y considerando el tipo de columna utilizada. Buscar
formulas estructurales y propiedades físico-químicas de los alcoholes analizados.
ORDEN DE ELUCIÓN: etanol, acetato de etilo, isobutanol, 2-metil-2-butanol, butanol,
isoamílico y amílico.
D. BIBLIOGRAFÍA






Análisis de metanol, alcoholoes superiores y furfural en bebidas alcohólicas por
cromatografía de gases. Autores: Natalia Garay y Paula Parra.
Manual Supelco
Manual A.O.A.C.
Guía de Cromatografía
Libros de Análisis Instrumental
Libros de Química Orgánica (estructuras y propiedades de los alcoholes)
Práctico nº5
DETERMINACIÓN DE ANTIOXIDANTES POR CROMATOGRAFÍA EN PLACA FINA Y
CROMATOGRAFÍA DE GASES
A.- FUNDAMENTO TEÓRICO:
El método sirve para la detección de antioxidantes en grasa y aceites animales y vegetales. El
aceite es disuelto en éter de petróleo o hexano y la solución es extraída con acetonitrilo.
Después de la evaporación del solvente, el extracto se pone sobre la placa de sílice. Las
placas son desarrolladas y las gotas son visibles usando un indicador adecuado. Los
antioxidantes son detectados comparando las manchas obtenidas (valor Rf) entre la muestra y
un estándar.
B.- REACTIVOS:

-Metanol p.a.

-Etanol.

-Éter de petróleo.

-Acetonitrilo p.a.

-(2,6-dicloro-4-benzoquinona clorhimida).

-Sulfato de sodio anhidro p.a.

-Benceno p.a.

-Ácido acético glacial p.a.

-Yodo p.a..
C.- MATERIALES:

-Container de vidrio con tapa de vidrio en el cual se puedan acomodar las placas de
5x10cm.

-Cromatoplacas de sílica gel para cromatografía en placa fina de 5x10cm.

-Rotavapor.

-Embudos de decantación.

-Material usual de laboratorio.
D.- SOLUCIONES
Preparación de soluciones:
-Acetonitrilo saturado con éter de petróleo:
Transferir 900 mL de acetonitrilo en 100 mL de éter de petróleo en un embudo de
decantación de 2 L. Agregar algo de sulfato de sodio anhidro. Agitar el contenido por 5 min.
vigorosamente. Dejar decantar toda la noche. Usar la fase inferior.
-Éter de petróleo saturado con acetonitrilo:
Transferir 900 mL de éter de petróleo en 100 mL de acetonitrilo en un embudo de
decantación de 2 L. Agregar un poco de sulfato de sodio anhidro. Agitar el contenido por 5
min. y dejar decantar toda la noche. Usar la fase superior.
-Solvente revelador:
Preparar 200 mL de solvente revelador, mezclando éter de petróleo, benceno y
ácido acético glacial en la proporción 40/40/20 (v/v). Preparado fresco antes de usar.
-Solución estándar de antioxidantes:
Disolver en un matraz de aforo de 100 mL, 100 mg de cada antioxidante en
metanol, enrasar y mezclar.(BHT; BHA, TBHQ).
E.- PROCEDIMIENTO:
*Extracción de antioxidantes:
1) Disolver 7,5-10 g de muestra en un vaso de 250 mL en 100 mL de éter de petróleo. Si fuese
necesario calentar ligeramente en plancha. Transferir la solución en un embudo de decantación
de 250mL.
2) Enjuagar el vaso con un poco de éter de petróleo y agregar el líquido al embudo de
decantación. Asegúrese que ninguna partícula insoluble esté presente en el éter de petróleo
que se agrega al embudo de decantación.
3) Agregar 50 mL de acetonitrilo saturado con éter de petróleo agitar por 1 min. Extraer la fase
de acetonitrilo (fase inferior) y transferirla a otro embudo de decantación. Repetir una vez más.
4) Lavar los extractos combinados (en el segundo embudo de decantación) de acetonitrilo, 2
veces con 50 mL de éter de petróleo saturado con acetonitrilo.
5) Transferir la fase acetonitrilo (fase inferior del embudo de decantación) a un matraz de fondo
plano con boca esmerilada de 250 mL. Enjuagar el embudo de decantación una vez con 25 mL
de acetonitrilo y agregarlo al matraz. Evaporar el solvente con vacío en el rotavapor a la menor
temperatura posible (no sobrepasar los 40ºC).
6) Disolver el residuo obtenido en 2mL de metanol y transferir la solución a un tubo pequeño de
vidrio y taparlo. Si el residuo no se disuelve completamente, filtrar la solución a través de una
pipeta pasteur con filtro de lana de vidrio (libre de grasa).
Detección:
1) Verter la mezcla de solvente revelador en el Container hasta la altura de 1 cm. Tapar y dejar
en la sombra durante 2 hrs. para estabilizar la atmósfera del container.
2) Agregar 10 uL (con una microjeringa o micropipeta) del extracto de antioxidantes (solución
obtenida anteriormente) a 2 cm del costado vertical lateral de la placa de sílice. Agregar otros
20 uL del extracto de antioxidante a 2 cm de la gota anterior (en una línea horizontal). Se debe
tener precaución que ambas gotas queden en línea horizontal perfecta., lo que constituye la
línea de partida.
3) Enseguida poner alicuotas de 2, 4, 6 uL de la solución estándar a una distancia de 2 cm
entre gota y gota, en la línea de partida.
4)Trazar una línea paralela a 15 cm por encima de la línea de partida. Poner la placa en el
container y dejarla a la sombra hasta que el solvente alcance la línea marcada.
5) Sacar la placa del container y dejarla secar al aire.
Revelado:
1) Para visualizar los antioxidantes se puede proceder de dos formas:
a.-Atomizar con el solvente revelador sobre la placa a una distancia de 20cm y
poner la placa a 105ºC por 10-15minutos.
b.-Con vapores de yodo; colocar las placas en un recipiente de vidrio tapado que
contiene una atmósfera saturada de yodo, dejar por 5-10minutos hasta la aparición de
manchas amarillas.
*En ambos casos demarcar las manchas con un lápiz de grafito, comparar el Rf de la muestra
con el estándar y la intensidad de color de las manchas.
Notas:
*Si se forma una emulsión, cerrar cuidadosamente el embudo de decantación y calentarlo a
baño maria a 50ºC hasta que se obtenga una fase clara. Otra alternativa es agregar una punta
de espátula de cloruro de sodio p.a.
*Si el contenido de antioxidantes esperado es menor a 100 ppm, se recomienda disolver el
contenido en 1 mL de metanol.
*Si se pone la placa de sílice verticalmente y si se observa de arriba hacia abajo, se detecta en
esa dirección BHT, BHA y TBHQ. La intensidad de la mancha indica el mayor o menor
contenido de antioxidantes.
Cromatografía de gases:
-El principio de extracción es el mismo que para cromatografía en placa fina, se extrae de la
misma forma y se analiza posteriormente por cromatografía de gases.
-Las condiciones cromatográficas se darán en el laboratorio.
F.- BIBLIOGRAFÍA:
Esta distancia se mide desde el punto de origen hasta su
-Manual de A.O.A.C
posición final (centro de la mancha)
-Análisis de Alimentos, Pearson.
-Memoria de Carolina Fuentes.
FORMULAS
Rf = Dm
Ds
Distancia recorrida por la muestra
Distancia recorrida por el disolvente