Practica_4

LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR
PRÁCTICA 4.
CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS
OBJETIVOS.
1. Distinguir entre aminoácidos no polares, polares sin carga y polares con carga en
base a sus propiedades de solubilidad.
2. Describir el proceso de cromatografía y cómo éste puede ser utilizado para separar
diferentes tipos de moléculas.
INTRODUCCIÓN.
Los aminoácidos pueden ser clasificados como moléculas no polares, polares sin
carga y polares con carga (ácidos o básicos) en base a la estructura de sus grupos R.
Dependiendo de la naturaleza de estos grupos R los diferentes aminoácidos serán más o
menos solubles en diferentes tipos de solventes. Por ejemplo, los aminoácidos no polares
serán más solubles en solventes no polares tales como cloroformo, mientras que los
aminoácidos polares serán más solubles en solventes polares tales como el agua. Estas
diferencias en solubilidad permiten que mezclas de aminoácidos puedan ser separadas
por cromatografía.
La cromatografía, un método para separar e identificar moléculas biológicas, hace
uso de la tendencia de las moléculas a mostrar atracción selectiva a varias sustancias,
dependiendo de su polaridad. Puesto que las moléculas muestran diferencias
características de atracción, estas diferencias pueden ser usadas para identificar
moléculas desconocidas y para separar e identificar mezclas de moléculas en solución.
Hay muchas técnicas cromatográficas, pero la mayoría utilizan el mismo método básico.
La mezcla a ser examinada es aplicada a una matriz sólida estacionaria (llamada “fase
estacionaria”) la cual absorbe selectivamente la mezcla molecular. Ésta es luego expuesta
a una sustancia móvil (la “fase móvil”). La matriz pueden ser finos granos empacados en
una columna vertical (columna de cromatografía) o extendidos en una capa delgada sobre
una laminilla de vidrio (cromatografía en capa fina). El papel filtro de alta calidad también
puede ser utilizado como matriz sólida (cromatografía en papel). La fase móvil puede ser
un líquido (o una combinación de diferentes líquidos) o un gas. Como la fase móvil se
mueve a través de la fase estacionaria, las diferentes moléculas dentro de la mezcla son
separadas o “particionadas” de acuerdo a sus atracciones relativas por cada una de la
dos fases. La tendencia de los diferentes tipos de moléculas en la mezcla para unirse a la
fase estacionaria o a disolverse en la fase móvil será determinada como la distancia que
son transportadas por la fase móvil.
En una columna, cambios en el pH o el tipo de solvente (polar vs. no polar)
ocasiona que las diferentes moléculas se muevan a diferente velocidad hasta salir de la
columna, donde pueden ser colectadas en tubos. En la cromatografía en papel o en la de
capa fina, después de que la fase móvil se ha movido a través de la fase estacionaria,
cada tipo de molécula separada aparece como una mancha distintiva sobre la fase
estacionaria (la laminilla o el papel). La fase estacionaria sobre la cual las moléculas se
han particionado se denomina cromatograma.
La cromatografía en papel puede ser llevada a cabo de manera ascendente o
descendente. En la cromatografía ascendente un extremo de la matriz de papel es
colocado en el fondo de una cámara que contiene un solvente. Conforme el solvente se
mueve hacia arriba en el papel su progreso puede ser notado observando el “frente del
solvente”. En la cromatografía descendente el solvente está contenido en un reservorio en
la parte superior de la cámara.
Es posible identificar compuestos separados utilizando el radio de la distancia
recorrida por un compuesto en un solvente particular con respecto a la distancia recorrida
por el solvente. Este radio es conocido como el valor Rf del compuesto.
Rf = (distancia de la mancha desde el origen)/(distancia del solvente desde el origen)
Para el análisis preciso, es mejor correr una cromatografía de los compuestos
desconocidos junto con compuestos conocidos y luego comparar las distancias
recorridas.
La localización de sustancias en los cromatogramas puede ser realizada de varias
maneras: usando fluorescencia u otros colorantes (usualmente aplicados al
cromatograma en forma de spray) o por autorradiografía (visualización de manchas que
contengan radioactividad).
MATERIALES.
Por equipo:
- 2 vasos de precipitado de 500 mL
- 2 vidrios de reloj
- Lápiz (indispensable)
- 2 pipetas Pasteur
- 2 rectángulos de papel filtro de 12 x 20 cm
- 4 clips de plástico
- 2 toallas de papel
- 1 regla
Por grupo:
- 200 mL de solvente para cromatografía que se prepara con alcohol n-butílico, ácido
acético glacial y agua destilada en proporciones de 6:1:2.
- Solución de ninhidrina.
PROCEDIMIENTO.
1. Coloque una toalla limpia de papel sobre la mesa limpia. Corte un pedazo de filtro
Wathman en un rectángulo de 12 x 20 cm y colóquelo sobre la toalla de papel (esto
ayuda a mantener el filtro limpio).
2. Oriente el papel filtro sobre la mesa de manera que el lado de 20 cm quede de frente a
Usted.
3. Usando un lápiz y una regla, dibuje una línea delgada a 1.5 cm del borde inferior del
filtro y que lo cruce a lo ancho. Comenzando a 3.3 cm del extremo izquierdo de la
línea, marque cinco pequeñas cruces cada 3.3 cm.
4. Su instructor le proporcionará una muestra desconocida que contiene una mezcla de
tres aminoácidos. Usted recibirá también tres aminoácidos conocidos. Registre los
nombres de las muestras conocidas.
5. Usando una pipeta Pasteur aplique una pequeña gota de la solución desconocida (2
mm de diámetro) en el papel filtro sobre la línea en una de las marcas localizadas al
centro del papel. Permita que la gota seque (puede utilizar una secadora de pelo).
Repita este procedimiento en la misma marca dos veces adicionales. Por separado,
dibuje en una hoja de papel el cromatograma para marcar el sitio de colocación de
cada muestra.
6. Sobre tres de las otras marcas, aplique gotas de los aminoácidos conocidos (un
aminoácido por marca). Aplique cada aminoácido tres veces, permitiendo que las
gotas se sequen entre cada aplicación. Sobre el dibujo del cromatograma asegúrese
de indicar cuál aminoácido se colocó en cada marca.
7. En la última marca aplique una gota de agua destilada y repita el procedimiento 3
veces.
8. Enrolle el papel de cromatografía formando un cilindro y manténgalo junto en las
partes superior e inferior con clips de plástico.
9. Cubra la parte inferior de un vaso de precipitado con solvente para cromatografía (1
cm de profundidad).
10. Coloque el cilindro de papel de cromatografía dentro del frasco, tápelo con el vidrio de
reloj y permita que corra por al menos 2 horas, preferiblemente 3 ó 4. Al término de
este tiempo se removerán los cromatogramas y se marcará el frente del solvente. Los
cromatogramas serán luego dejados secar al aire.
11. Día siguiente: Asperje su cromatograma con ninhidrina o, alternativamente, sumerja
el cromatograma en una solución de ninhidrina. Precaución: Use guantes; si usted
asperja la ninhidrina, hágalo dentro de una campana. Caliente el cromatograma de
acuerdo a las indicaciones de su instructor. Los aminoácidos se volverán púrpura en
presencia de ninhidrina (excepto si uno de ellos es prolina).
12. Encierre en un círculo las manchas y registre los colores en la Tabla 1. Determine los
valores de Rf para cada mancha de la mezcla desconocida en su cromatograma,
luego determine los valores de Rf para cada mancha de aminoácidos conocidos. Para
encontrar los valores de Rf estime el centro de cada mancha de aminoácidos, mida la
distancia que ha viajado desde el origen (marca) y luego mida la distancia que el
frente del solvente ha viajado desde el origen. Encuentre el radio de esta distancia y
registre la información en la Tabla 1.
Muestra
desconocida
Mancha 1
Mancha 2
Mancha 3
Color
Rf
Muestras
conocidas
Color
Rf
Aminoácido 1
Aminoácido 2
Aminoácido 3
NOTA: Al manipular el papel filtro a lo largo de la práctica tenga la precaución de utilizar
guantes para evitar contaminaciones de la fase estacionaria.
ACTIVIDADES.
1. Compare los valores de Rf para las soluciones desconocidas y conocidas. Identifique y
registre los aminoácidos en su mezcla.
2. Cada mancha de la solución desconocida debe coincidir con una de las manchas de
los aminoácidos conocidos. ¿Obtuvo este resultado? De no ser así, ¿cómo explica la
discrepancia?