Resistencia a hongos fitopatógenos mediante ingeniería

Agrobiotecnología. Curso 2013
Clase 11: Resistencia a hongos y Oomycetes fitopatógenos
mediante ingeniería genética
Patógenos fúngicos de importancia agronómica
Transparencias 3-17
La transparencia 3 esquematiza la relación filogenética de hongos y eumicetes. Las
transparencia 4 y 5 resumen la información derivada de un review reciente respecto a
pérdidas ocasionadas por estos patógenos.
Las transparencias 6, 7, 8 y 9 ejemplifican patógenos necrotrófcios, biotróficos y
hemitróficos de importancia agrícola.
Muchas de las estrategias ensayadas hasta el presente para obtener resistencia
mediante ingeniería genética se basan en los crecientes conocimientos disponibles
sobre la interacción planta-hongo patógeno. Es importante reconocer que no todos los
hongos fitopatógenos actúan sobre sus hospedadores de la misma manera. Una
primera aproximación debe considerar la estrategia seguida por el patógeno durante el
desarrollo de la enfermedad. Según este criterio, los patógenos se pueden clasificar en
necrotróficos, biotróficos o hemibiotróficos. Los hongos necrotróficos (transparencia 6)
invaden las células vegetales de manera agresiva, matando las células vegetales
mediante toxinas o enzimas. Aunque por lo general el rango de especies afectadas es
amplio para este tipo de patógenos, las toxinas pueden estar dirigidas hacia moléculas
blanco específicas, actuando selectivamente sobre un rango acotado de especies
vegetales. Los casos de toxinas específicas de hospedador son más comunes en
especies de los géneros Alternaria y Cochliobolus. Los hongos necrotróficos son los
que producen los mayores daños a las frutas y vegetales almacenados.
En lugar de matar a las células durante el proceso de infección, los hongos biotróficos
(transparencia 7) establecen una relación de nutrición a largo plazo con su huésped.
Debido a la forma de alimentación adoptada por el patógeno, la planta infectada se ve
en desventaja respecto de otras, pero no muere o lo hace muy tardíamente. Estos
patógenos suelen crecer invadiendo sólo las células huéspedes con estructuras
especiales (denominadas haustorios), lo que les permite aumentar la superficie de
intercambio entre la célula fúngica y la planta. Es también frecuente la aparición de
“islotes verdes”, zonas en las que el tejido vegetal invadido permanece vivo mientras el
resto de la hoja ha comenzado ya el proceso de senescencia. Este tipo de parasitismo
se considera evolutivamente avanzado, ya que mantiene al huésped vivo como una
fuente de alimentos a largo plazo. Los grupos más importantes de hongos
fitopatógenos biotróficos son las royas (rusts), los oídios (powdery mildews) y los
mildius (mildews).
Los hongos hemibiotróficos (transparencia 8) se comportan como parásitos biotróficos
durante los primeros estadios de la infección, pero luego el matan al tejido de la planta
y continúan su ciclo como necrotróficos. Entre ellos, el género de mayor importancia
agronómica es Phytophthora y, en particular, Phytophthora infestans, causante del
tizón tardío en Solanum tuberosum y Lycopersicon esculentum. Es el patógeno más
importante que afecta al cultivo de la papa y el que produce mayores pérdidas
económicas en todo el mundo. Otros géneros que han causado importantes epidemias
son P. cinnamomi en plantas nativas de Australia y aguacate en California, P. syringae
en manzano y P. megasperma en lechuga, coliflor, coles de Bruselas, zanahoria,
alcachofa y soja.
Las transparencia 10 a 16 muestran daños ocasionados por distintos tipos de hongos
y oomicetes fitipatógenos. Se incluyen enfermedades representativas con alto impacto
económico y social.
.
La transparencia 17 esquematiza las vías de penetración de hongos en plantas y la
18, muestra las distintas etapas de colonización de un patógeno hemitrófico, pasando
por una etapa de biotrofia, en la cual se alimenta de células vivas del hospedante, al
comienzo de la infección y desarrollando luego estrategias de necrotrofia, gatillada por
factores del ambiente colonizado.
Las bacterias, los virus y algunos patógenos fúngicos oportunistas dependen a
menudo de aperturas naturales de la planta para iniciar el proceso de infección. En
contraste, muchos hongos fitopatógenos han desarrollado mecanismos para atravesar
de forma activa las barreras estructurales de la planta (cutícula y pared celular
epidérmica), invadir el tejido vegetal, optimizar el crecimiento dentro de la planta, y
propagarse dentro del mismo. Para lograr la entrada, los hongos secretan una
combinación de enzimas hidrolíticas, incluyendo cutinasas, pectinasas,
poligalacturonasas y proteasas. Alternativamente, o combinados con estas enzimas,
algunos hongos han desarrollado mecanismos más complejos de penetración. En
general, los hongos fitopatógenos forman estructuras de penetración especializadas
llamadas apresorios, en el extremo del tubo germinativo. Estos órganos se adhieren
firmemente a la superficie de la planta mediante adhesivos extracelulares. Al
desarrollarse, la porosidad de la pared del apresorio se reduce marcadamente a partir
de la acumulación de melanina, permitiendo que se acumulen presiones de turgencia
superiores a 8 MPa. Esta presión se concentra sobre un área pequeña en la base del
apresorio, el que se mantiene libre de material de pared y melanina. A partir de esa
zona se desarrolla la clavija de penetración, que atraviesa la cutícula y la pared
celular, asistida posiblemente por enzimas hidrolíticas. Una vez invadido el tejido,
muchos hongos, especialmente los biotróficos o hemibiotróficos, desarrollan
haustorios dentro de las células vegetales, invaginaciones de la membrana celular
vegetal que permiten aumentar la superficie de intercambio entre los dos organismos.
Los patógenos fúngicos han afectado a la agricultura desde sus principios. Hoy en día,
las pérdidas económicas debidas al ataque de los hongos fitopatógenos superan los
U$S 200.000 millones anuales, y se invierten anualmente cerca de U$S 6.000 millones
en protección de cultivos contra enfermedades fúngicas.
Las transparencias 19 a 21 muestran practicas usuales de manejo así como el
consumo promedio de fungicidas en diversos países durante el período 1990-1998.
Este consumo es un buen indicador de la problemática en cada país. Como ejemplo
de patógenos fúngicos, mencionaremos a Phytophthora infestans, agente del tizón
tardío de la papa, y Pyricularia oryzae en arroz. El tizón tardío de la papa producido
por el oomycete Phytophthora infestans es una de las enfermedades más importantes
a nivel mundial. Esta plaga está distribuida globalmente y resulta especialmente grave
en los países en desarrollo, en donde las temperaturas cálidas, la alta humedad y la
pobreza limitan la capacidad de respuesta de los agricultores. Los estudios sobre el
uso de fungicidas dan una idea de la problemática. Por ejemplo, un estudio reciente en
Ecuador reportó un gasto promedio de U$S 120 por ha, lo que representa un 10 % de
los costos de producción. Se han reportado cifras similares en África del Este y
Central. En Tanzania y Etiopía, las pérdidas debidas a Phytophthora pueden alcanzar
al 98% de la producción, con un gasto en funguicidas de U$S 150-195 por ha. La
quemazón producida por Pyricularia oryzae es una de las enfermedades más
destructivas del arroz debido a su virulencia y distribución. En Japón, la enfermedad
infecta unas 865.000 ha cultivadas. En las Filipinas, las pérdidas debidas a este
patógeno llegan al 50%.
Las prácticas tradicionales para la prevención de enfermedades de origen fúngico
incluyen el uso de variedades resistentes, la rotación de cultivos, el manejo de los
rastrojos y el acondicionamiento de los depósitos para almacenaje post-cosecha
(transparencia 19). El uso intensivo de fungicidas contribuye a disminuir el impacto de
los fitopatógenos fúngicos, pero trae aparejados costos adicionales de producción y
riesgos para el medio ambiente y los operarios agrícolas. El uso intensivo de un mismo
fungicida puede ejercer una gran presión de selección sobre la población del
patógeno, llevando así a la aparición de poblaciones resistentes.
Con la aparición de las técnicas de ingeniería genética, cultivo de tejidos y
transformación, se abren numerosas posibilidades para el mejoramiento de variedades
vegetales de interés. Las estrategias enumeradas en la transparencia 19 (que se
detallarán más adelante) incluyen la expresión de proteínas con actividad antifúngica,
la obtención de variedades que expresan genes de resistencia (acelerando el proceso
de mejoramiento “tradicional”), la sobrexpresión de los genes involucrados en la
modulación de las respuestas de defensa innatas, o la interferencia en el proceso de
infección por mecanismos específicos de una determinada interacción plantapatógeno. Todas estas estrategias se encuentran en fase de investigación, por lo que
no hay aún en el mercado plantas transgénicas resistentes a patógenos fúngicos.
Las transparencias 22 a 32 resumen modelos de interacción hospedante–patógeno,
así como la inducción de defensas de la planta y resistencia sistémica adquirida,
descriptas en la teórica de resistencia a bacterias fitopatógenas.
Estrategias para obtener resistencia.
Transparencia 33-
Expresión de proteínas de defensa de origen vegetal
Transparencias 35-48
El enfoque que ha sido más ampliamente utilizado a los fines de obtener resistencia a
patógenos ha sido la sobreexpresión de proteínas que presentan actividad microbiana
per se. Una gran mayoría de estas proteínas proviene de plantas. Durante la
Respuesta Hipersensible y en la respuesta local inmediatamente posterior, aumenta la
síntesis de varias familias de proteínas denominadas genéricamente como proteínas
PR (por Pathogenesis Related). La gran mayoría de estas proteínas presenta actividad
antifúngica. Se incluyen en este grupo las glucanasas y quitinasas, que degradan la
pared fúngica; las defensinas y tioninas, que desestabilizan las membranas o forman
poros en las mismas, y otras cuyo modo de acción no está aún determinado
(transparencias 36 y 37). Muchas de estas proteínas se sintetizan no sólo durante las
respuestas locales, si no también como parte de la resistencia sistémica adquirida
(SAR).
Las quitinasas y glucanasas están entre las proteínas que han sido más ampliamente
utilizados para obtener resistencia a patógenos (transparencias 38 y 39). Al igual que
otras proteínas PR, su mecanismo de acción es directo y pueden actuar sobre un
amplio rango de microorganismos. En este caso que se muestra en la transparencia
39, la sobrexpresión en Oryza sativa de una glucanasa proveniente del mismo resultó
en el aumento de la resistencia frente al hongo Magnaporthe grisea, pero también
motivó la aparición de lesiones espontáneas. Cabe aclarar que este fenómeno no es
común en los casos de sobreexpresión de PRs. Los genes que codifican proteínas de
este tipo han sido también expresados en forma conjunta o en combinación con otros
genes antimicrobianos, en cuyo caso se han podido observar efectos aditivos y
senérgicos.
Existen otras proteínas de origen vegetal que no se incluyen en el grupo de las PRs.
Entre ellas, se pueden mencionar las proteínas inactivadoras de ribosomas (RIPs),
que actúan depurinando el ARNr de 28S. Existen dos tipos (I y II). Las del tipo I suelen
ser las menos tóxicas, y son las que más se han utilizado en ensayos de transgénesis.
Las fitoalexinas son compuestos de bajo peso molecular (no proteicos) con actividad
antibacteriana y/o antifúngica. Se sintetizan rápidamente en respuesta a la infección
con patógenos o el tratamiento con elicitores. Si bien constituyen una alternativa
interesante en la defensa contra patógenos fúngicos, su síntesis depende a menudo
de complejos caminos metabólicos, por lo que la obtención de plantas transgénicas
que sobrexpresen fitoalexinas constituye un objetivo complejo. Las figuras de la
transparencia 40 ilustran la fórmula química de dos fitoalexinas: letucinina, aislada de
Lactuca sativa, y kievitona, de Phaseolus vulgaris.
Si bien ha sido ampliamente probada como estrategia, la expresión de proteínas PR
resulta en niveles moderados de resistencia. Estos resultados no son sorprendentes si
se tiene en cuenta que cada proteína PR es sólo una parte de una respuesta
coordinada que involucra diversos modos de acción contra el patógeno. Se han
reportado varios trabajos en que se co-expresaron diversas proteínas antifúngicas con
el objeto de obtener mayores niveles de resistencia. La transparencia 41 muestra
cómo la expresión conjunta en Nicotiana tabacum de una quitinasa y una RIP
provenientes de cebada resulta en una resistencia incrementada frente al hongo
Rhizoctonia solani. La transparencia 42 muestra resultados del trabajo comentado
anteriormente. Jach et al. obtuvieron diversas líneas transgénicas expresando distintos
niveles de tres proteínas de cebada (Hordeum vulgare): una quitinasa de clase II
(CHI), una -glucanasa de clase dos (GLU) y una proteína inactivadora de ribosomas
tipo I (RIP). Para cada línea, se midieron tanto los niveles de expresión de la proteína
como la resistencia obtenida, expresada como reducción de un índice de enfermedad
(DI) obtenido a partir de la observación de los síntomas. Dado que el tipo de proteínas
utilizadas actúa directamente sobre el microorganismo, era de esperar, y así se
corroboró, que el grado de resistencia fuera proporcional al nivel de expresión. A partir
de las curvas de regresión obtenidas con las líneas que expresan una sola proteína,
fue posible calcular la reducción esperada en el índice de enfermedad, así como
estimar el DI esperado a través de la suma de ambas actividades. Sin embargo, el
grado de resistencia alcanzado fue siempre mayor que el esperable a partir de la
simple suma de efectos. Estos resultados muestran que, al igual que ocurre en las
respuestas de defensa naturales, la combinación de actividades antimicrobianas tiene
un efecto sinérgico.
Otras proteínas clasificadas como PRs son las defensinas, péptidos pequeños (de
alrededor de 5 kDa), ricos en cisteína que presentan actividad antifúngica y que son
usualmente secretados fuera de la célula. Su actividad estaría dada por la formación
de poros en las membranas o por la alteración de la distribución de cargas en las
mismas. Otras defensinas son capaces de inhibir -amilasas, sugiriendo un rol en la
defensa frente a insectos. Este tipo de péptidos se sintetiza no sólo en las plantas si
no también en los insectos, los moluscos y los mamíferos. Su espectro de acción suele
ser amplio, afectando a varios hongos fitopatógenos (transparencias 43-48).
La transparencia 46 muestra el efecto de la expresión de una defensina de Brassica
oleracea en Oryza sativa, luego de inocular la planta con Pyricularia grisea. También
se ha expresado la defensina alfAFP de Medicago sativa en Solanum tuberosum bajo
el promotor 35S del Figworth mosaic virus. Las líneas de Solanum transgénicas
exhiben un alto grado de resistencia frente al patógeno Verticillium dahliae tanto en
pruebas en ambiente controlado como a campo. En este último caso, se observó que
el grado de resistencia obtenido es equivalente al logrado mediante el tratamiento con
funguicidas sobre el cultivar no transgénico.
Las tioninas son proteínas con actividad antimicrobiana que se encuentran en el
endospermo, tallos, raíces y en las hojas etioladas o estresadas de muchas especies
vegetales. Son tóxicas para las bacterias gram-positivas o gram-negativas, hongos,
levaduras y varios tipos de células de mamíferos. El efecto tóxico de las tioninas
requiere la interacción con fosfolípidos de membrana cargados negativamente,
seguida por la formación de poros, o de la interacción con dominios específicos de la
membrana. Es posible que la interacción con ciertos fosfolípidos involucrados en la
transducción de señales produzca alteraciones del metabolismo en células de
mamíferos. Algunas proteínas inicialmente identificadas como tioninas, como las thioninas, se clasificaron dentro de las defensinas al obtenerse detalles sobre su
estructura (47).
Entre los péptidos no clasificables como PRs se encuentran los péptidos similares a la
heveína. La heveína es un pequeño péptido de 48 aminoácidos con capacidad de
unirse a quitina, que fue aislado originalmente del látex del árbol de la goma. Se han
aislado péptidos similares a heveína de Amaranthus caudatus, hojas de Beta vulgaris
y frutos de Sambucus nigra. Estos péptidos exhiben diversos grados de actividad
antimicrobiana, aunque dicha actividad en la heveína en sí es relativamente débil. Se
expresó en tabaco un péptido similar a heveína proveniente de Pharbitis nil
(campanilla japonesa), obteniéndose un importante grado de resistencia a
Peronospora parasitica (transparencia 33). Este hongo no presenta quitina en su pared
lo cual sugiere que la actividad de unión a quitina es independiente de la actividad
antifúngica.
Expresión de proteínas antifúngicas de otros organismos
Transparencias 49-59
Se transfirió un gen del hongo micoparasítico Trichoderma harzianum que codifica una
quitinasa de potente actividad antifúngica a plantas de Nicotiana tabacum y Solanum
tuberosum, obteniéndose resistencia al patógeno Rhizoctonia solani. Las líneas,
seleccionadas por su alta expresión, eran altamente tolerantes o completamente
resistentes a los patógenos foliares Alternaria alternata, A. solani, y Botrytis cinerea.
En las fotografías de la transparencia 35 se observan los resultados de dos ensayos
de infección con Rhizoctonia solani. En el primero (panel A), se transplantaron
plántulas de tabaco de 1 mes de edad a placas de agar-agua conteniendo una
suspensión de micelio. En el segundo (panel B), se transplantaron plantas de tabaco
de 2 meses de edad, cultivadas en invernadero, a bandejas con sustrato estéril, y se
regaron con una suspensión de micelio en agua. Las transparencias 50 a 53
reproducen otros resultados de este mismo trabajo.
En los últimos años, se ha caracterizado un gran número de péptidos pequeños (15-50
aminoácidos) con actividad antimicrobiana. Una gran parte de los mismos presentan
estructuras de -hélice, con un sector hidrofóbico y otro hidrofílico y altamente
catiónico. Su actividad antimicrobiana estaría dada por la interacción con las
membranas de los microorganismos. Dado que dicha interacción estaría mediada por
la interacción entre cargas, la composición de las membranas lipídicas sería la
responsable de la especificidad de estos péptidos. Una vez en contacto con la
membrana, tras alcanzar una concentración mínima el efecto antimicrobiano se daría
por la apertura de poros en la membrana, con la consiguiente pérdida de osmolitos, o
por la desestabilización de la membrana al variar su composición durante el pasaje de
los péptidos de un lado a otro de la misma. La figura de la izquierda de la
transparencia 54 muestra un esquema de la conformación espacial de la magainina. El
esquema de la derecha ilustra un modelo de acción que explicaría la actividad de este
péptido.
La transparencia 55 muestra los resultados de un trabajo en que se expresó un gen
sintético que codifica un péptido análogo al de magainina (producido por el anfibio
Xenopus laevis). El gen fue introducido en el genoma de cloroplastos mediante
técnicas de biobalística y se logró su expresión sin afectar la función de las organelas,
presumiblemente debido a las diferencias en la composición de las membranas de la
misma respecto de las membranas bacterianas típicas. En la fotografías se muestran
resultados de un ensayo de infección con el hongo Colletotrichum destructivum. Se
inocularon las hojas con 8 gotas de 10 L de una suspensión de esporas de
aproximadamente 1x106 esporas/mL. Se observa un menor desarrollo de las lesiones
cloróticas en las plantas transformadas.
Las transparencias 55-59 ilustran otros trabajos en que se utilizaron péptidos líticos
para obtener resistencia a hongos
Expresión de genes relacionados con la regulación de la respuesta frente a
patógenos
Transparencias 60-63
La sobrexpresión de genes cuyos productos participan de la transducción de señales
en los mecanismos de defensa resulta una estrategia particularmente interesante. A
diferencia de los genes R o de los elicitores, muchos de estos componentes
intervienen en la regulación de diversos tipos de respuesta, posibilitando la activación
de una batería más compleja de genes. Como ejemplo citaremos al gen NPR1 de
Arabidopsis thaliana, que interviene en la transducción de señales de varios genes R,
en la Respuesta Sistémica Adquirida y en la activación de señales promovidas por
etileno o ácido jasmónico. La transparencia 61 muestra un esquema de la ubicación
del gen NPR1 en la ruta de transducción.
Estudios recientes demostraron que la sobrexpresión del gen NPR1 en Arabidopsis
parasitica y arroz aumenta la resistencia a patógenos. Significativamente, esta
resistencia se logró sin pérdidas substanciales de rendimiento. Esto se debe
probablemente a que las plantas transgénicas para NPR1 no expresan sus defensas
constitutivamente, sino que parecen estar “preparadas” para responder a patógenos
que normalmente superarían las defensas en las plantas no transgénicas. Como
ejemplo, la transparencia 62 muestra el efecto de la sobrexpresión del gen NPR1 en
Arabidopsis thaliana sobre la infección con el oomycete Peronospora parasitica. Como
se puede apreciar, el hongo no logra desarrollarse en las plantas transgénicas y no
llega a formar conidioforos. En estas mismas plantas se observó resistencia
incrementada a Pseudomonas syringae.
La transparencia 63 muestra otro ejemplo de obtención de plantas transgénicas con
resistencia incrementada a hongos fitopatógenos. En este caso, se transformaron
plantas de Oryza sativa con el gen de la proteína quinasa 1 activada por mitógenos
(MK1) de Capsicum annum. El gen MK1 se encuentra muy conservado en plantas y la
secuencia de la proteína codificada posee un 92% de identidad a la proteína quinasa
inducida por daños (WIPK) de tabaco. El gen MK1 fue introducido en arroz utilizando
la transformación mediada por Agrobacterium, y la proteína fue detectada en las
variedades transformadas pero no en la silvestre. La expresión de PR1a, un gen que
se induce por daño mecánico, y de otros como PR1b y PR10, se midió a las 0, 6, 12,
24, 48, 76 y 96 h, tanto en las cepas transformadas como en la cepa silvestre
utilizando la técnica de Northern blot. Las plantas fueron inoculadas con el hongo
Magnaporthe grisea responsable del blast del arroz. Como se observa en figura
superior, la expresión de PR1a, PR1b y PR10 se encuentra incrementada en las
plantas transgénicas (M2, M18 y M19) respecto de las plantas no transformadas. La
expresión aumentada de genes de defensa se correlaciona con un incremento de la
resistencia a M. grisea (figura inferior).
Estrategias para obtener resistencia. Activación general de las defensas de la
planta
Transparencias 64-67
Una alternativa para desencadenar en las plantas las respuestas de defensa,
especialmente la Respuesta Hipersensible, es la expresión de elicitores (transparencia
65-66). Reciben este nombre aquellos compuestos que pueden iniciar en la planta una
Respuesta Hipersensible localizada similar a la que provocaría el patógeno del que
proviene. En muchos casos los elicitores o las proteínas que los producen se
corresponden con el gen de avirulencia de un par R-avr. En otros casos, puede
tratarse de compuestos de degradación de la pared vegetal o de la pared del hongo.
Algunos elicitores pueden incluso generar respuestas de defensa en especies que no
son atacadas por el patógeno correspondiente. Una planta que exprese un elicitor
frente a la presencia del patógeno, o incluso antes de su llegada, podría iniciar una
respuesta más rápida y eficaz que la planta sin transformar. Por supuesto, para que
esta estrategia resulte efectiva la especie modificada debe ser capaz de reconocer al
elicitor. En principio sería conveniente también el uso de un promotor inducible por el
patógeno, ya que la expresión constitutiva de un elicitor podría dar lugar a un fenotipo
lession mimic. Sin embargo, Tepfer et al. lograron resistencia a Phytophthora en
tabaco mediante la expresión constitutiva del elicitor -criptogeína, sin observar
efectos adversos.
Keller et al. expresaron el elicitor criptogeína en tabaco, bajo el promotor inducible por
patógenos hsr203J. La criptogeína proviene del patógeno Phytophthora criptogea y es
capaz de inducir una Respuesta Hipersensible en tabaco (figura inferior de la
transparencia 67, panel izquierdo, punto c). Al ser expresada bajo el promotor
inducible, es capaz de conferir resistencia frente a Phytophthora parasitica var
nicotianae, que es virulento en la planta sin transformar. Obsérvese la figura superior y
compárense los puntos (a) en la figura inferior. La aparición de una zona clorótica
debida a la Respuesta Hipersensible restringe el desarrollo del patógeno en la planta
transgénica. Estas mismas plantas mostraron resistencia a Thielaviopsis basicola,
Erysiphe cichoracearum y Botrytis cinerea.
Estrategias para obtener resistencia. Transformación con genes de resistencia
Transparencias 68-72
Las plantas pueden activar un efectivo arsenal de defensas inducidas contra los
patógenos. Estas defensas incluyen la muerte celular programada de las células
infectadas (la llamada Respuesta Hipersensible; HR), el refuerzo de tejidos por
endurecimiento de las paredes celulares, y la producción de compuestos antifúngicos
en el sitio de infección. A su vez, estas respuestas inician una respuesta sistémica de
más larga duración (Resistencia Sistémica Adquirida o SAR) que previene a la planta
contra ataques subsecuentes del mismo u otros patógenos. Dado que estas
respuestas requieren una sustancial inversión de componentes celulares, todas las
defensas se mantienen bajo un ajustado control genético y sólo se activan frente a la
presencia del patógeno. La activación es posible gracias a la expresión de un amplio
rango de genes R (genes de resistencia) que interaccionan con los productos de los
genes Avr (genes de avirulencia) presentes en el patógeno. Los genes R codifican
posibles receptores de los productos resultantes de los genes Avr del patógeno. En
muchos casos, un solo gen R, al ser transferido a una variedad susceptible, puede
conferir resistencia a una o más cepas del mismo patógeno. Debido a esto, los genes
R se han utilizado en el mejoramiento tradicional durante décadas. Las transparencias
muestran un modelo simplificado para explicar el desarrollo de respuestas defensivas
a partir de la interacción entre los productos de los genes R y Avr y un esquema de los
principales niveles y rutas de señalización comprendidos en este tipo de respuesta.
22-32).
La resistencia mediada por genes R presenta varias características atractivas para el
control de enfermedades. Cuando es inducida en el momento y por el período preciso,
las respuestas iniciadas pueden detener eficientemente el proceso de infección con un
daño mínimo para la planta. Sin embargo, debe remarcarse que su uso como genes
para conferir resistencia se limita a aquellas especies o variedades relacionadas con la
original portadora del gen, puesto que se requiere la presencia en la planta de toda la
cadena de transducción de señales acoplada al producto del gen R.
Desafortunadamente, el monocultivo de variedades portadoras de un gen R
determinado puede llevar rápidamente a la aparición de cepas de patógenos
resistentes. Muchos productos de los genes R sólo confieren resistencia a un número
limitado de cepas y, por lo tanto, su espectro de acción es parcial. En la historia de la
agricultura moderna, esto ha derivado en la ocurrencia de “ciclos” durante los cuales
un gen R introducido en una variedad determinada pierde efectividad al aumentar el
área cultivada con el mismo y al aumentar consecuencia la presión de selección sobre
la población de patógenos. Estos ciclos tienen una duración aproximada de 8 a 12
años. En este contexto, la introgresión de genes R por métodos tradicionales resulta
un proceso lento que dura aproximadamente lo mismo que estos ciclos. La
transparencia 69 esquematiza los mecanismos operantes en los ciclos comentados.
Dada la situación descripta, no es aconsejable el monocultivo de variedades portando
un solo gen de resistencia. Dentro de las prácticas agrícolas tradicionales, una
alternativa es la siembra conjunta de más de una variedad, cada una portando
distintos genes de resistencia, lo que permite disminuir la presión de selección sobre la
población de patógenos. El inconveniente de este enfoque es que también se aumenta
la heterogeneidad de caracteres de interés agronómico (tiempos de desarrollo,
rendimiento, etc.), por lo que baja la rentabilidad del cultivo. El uso de plantas
transgénicas propone alternativas viables frente a estos problemas. El breve lapso
requerido para introducir un determinado gen R mediante transgénesis hace posible la
aparición de “variedades” que resultan isogénicas excepto en el gen introducido. De
esta manera, se puede proceder al cultivo de múltiples variedades sin que haya
variaciones en otras características de la planta. Otra opción, que insumiría más
tiempo, es la introducción de múltiples genes R en una misma variedad. Esta
estrategia, conocida como “apilamiento” (pyramiding o stacking) de genes R, es
también aplicable, como veremos, a otro tipo de genes. La transparencia 70
esquematiza métodos alternativos de manejo agrícola que podrían utilizarse para
impedir o atenuar la aparición de resistencia.
La característica de los genes R de conferir resistencia a variedades susceptibles
puede utilizarse para identificarlos y clonarlos utilizando técnicas de ingeniería
genética. En el ejemplo que se muestra en la transparencia 71 se identificó la
presencia de un gen de resistencia proveniente de una especie (Solanum
bulbocastanum) resistente a Phytophthora infestans, dentro de un cromosoma artificial
(BAC). A partir del mismo, se amplificaron por PCR varias zonas del genoma original y
los productos resultantes se utilizaron para transformar plantas de Solanum
tuberosum, la especie comercial susceptible. Debido a que ambas especies están
emparentadas, la expresión del gen a partir de su promotor original pudo lograrse sin
dificultad en las plantas transgénicas. Las plantas que recibieron el gen RB
desarrollaron resistencia al patógeno, lo que permitió aislarlo y clonarlo rápidamente.
El mapeo no hubiera sido posible mediante los métodos de la genética clásica, ya que
no es posible obtener híbridos entre ambas especies. El gen así obtenido puede luego
modificarse o su promotor puede ser cambiado para optimizar su expresión en la
nueva especie. La transparencia muestra un esquema de la estrategia seguida para
clonar el gen RB.
El hecho de que los genes R puedan cumplir su acción en especies o variedades
relacionadas con la original permite acelerar el proceso de mejoramiento con respecto
a los métodos de cruzamiento tradicionales. En este ejemplo, el gen Rpg1 de una
variedad resistente de cebada (Morex) se introdujo en una variedad susceptible
(Golden Promise). Una vez introducido el gen, este se hereda de manera normal
siguiendo patrones mendelianos. De ser necesario, puede utilizarse la variedad
modificada en programas de mejoramiento tradicional. La transparencia 72 muestra un
ensayo de infección con Puccinia graminis en variedades susceptibles y
medianamente susceptibles de cebada.
Estrategias para obtener resistencia. Modulación de la respuesta oxidativa
Transparencias 73-76
El peróxido de hidrógeno (H2O2) cumple varias funciones en los procesos de defensa
de la planta. Una vez detectada la presencia de un posible patógeno, los niveles de
H2O2 aumentan drásticamente en el sitio de infección debido a la acción de una
NADPH oxidasa aún no caracterizada. El peróxido presenta en sí mismo un efecto
tóxico sobre los microorganismos, y es capaz de participar en reacciones de crosslinking entre las proteínas de la pared celular. Este compuesto está también
involucrado en la activación de ciertas enzimas como las peroxidasas, que participan
en el proceso de lignificación de la pared, o la ácido benzoico dihidrogenasa, que
aumenta los niveles de ácido salicílico y también en la activación de las respuestas de
tipo sistémico en la planta (transparencia 74-75). Por otra parte, el H2O2 es uno de los
factores que lleva al proceso de muerte celular local que forma parte de la Respuesta
Hipersensible.
A partir de la dilucidación del rol del H2O2 en las respuestas defensivas de las plantas,
varios laboratorios han procurado obtener niveles elevados del mismo a fin de
aumentar la resistencia a patógenos. Este incremento podría lograrse introduciendo
genes que generen H2O2 o disminuyendo los niveles de las enzimas detoxificadoras,
tales como catalasa o ascorbato peroxidasa. Sin embargo, es preciso tener en cuenta
que la concentración de H2O2 debe mantenerse dentro de un rango que no sea tóxico
para las células vegetales. De las diversas estrategias empleadas, la más exitosa
hasta el momento parece haber sido la expresión de genes de glucosa-oxidasa. Se ha
observado también un aumento de la expresión de proteínas de defensa a nivel
sistémico en plantas transgénicas deficientes en catalasa.
La sobrexpresión de glucosa oxidasa como estrategia para obtener resistencia a
patógenos ha sido desarrollada principalmente en el laboratorio del Dr. D. Shah
(transparencia 76). Expresando un gen de glucosa oxidasa aislado del hongo
Aspergillus niger en plantas de Solanum tuberosum, se observó un notable incremento
de resistencia a los hongos Phytophthora infestans, Verticillium dahliae y a la bacteria
Erwinia carotovora. Esta resistencia no se debería a un efecto directo del H2O2 sobre
los patógenos, sino a una activación de las respuestas de defensa sistémicas. En
estos estudios, el gen se expresó bajo el promotor 35S del Figworth mosaic virus y las
plantas transgénicas no presentaban diferencias fenotípicas con las no transformadas.
Contrastando con estos resultados, la expresión de una glucosa oxidasa proveniente
del hongo Talaromyces flavus en tabaco, dirigida por un promotor de peroxidasa
inducible por patógenos, resultó en la aparición de lesiones necróticas en las hojas
maduras. Este tipo de fenotipo, conocido como lession mimic, puede darse cuando la
regulación de la Respuesta Hipersensible ha sido alterada.
Estrategias para obtener resistencia. Interferencia con la patogénesis
Transparencias 77-84
Si se conoce lo suficiente de la relación entre un patógeno y su planta hospedadora y
sobre los mecanismos por los cuales dicho patógeno invade la planta, es posible
desarrollar resistencia interfiriendo con el proceso de la patogénesis sin modificar los
componentes de defensa de la misma. Entre las enzimas secretadas por los hongos
para penetrar la pared celular del tejido blanco están las endo- y exopolygalacturonasas (PGs), las pectato liasas y glucanasas. Se ha propuesto que las
proteínas capaces de inhibir estas actividades enzimáticas forman parte de las
defensas de la planta, impidiendo la penetración del hongo. El rol que cumplen las
proteínas inhibidoras de poligalacturonasas (PGIPs) es doble: a) reducen la
degradación de la pared celular vegetal, retrasando o impidiendo la penetración de los
patógenos; b) producen, en lugar de los monómeros de ácido galacturónico que
generan las PGs, una degradación incompleta con liberación de oligogalacturónidos.
Estos compuestos sirven de elicitores y activan las respuestas defensivas
(transparencia 78).
La transparencia 79 muestra los resultados de un trabajo en que se expresó un gen
que codifica una proteína inhibidora de polugalaturonasa (PGIP) de peral en plantas
de tomate, bajo el control del promotor 35S de Cauliflower mosaic virus y del enhancer
traduccional de Tobacco mosaic virus U1 W. La reducción de la maceración de tejidos
en ensayos como el que se muestra en la figura se redujo en un 25%, mientras que la
proporción de tejido dañado en fruto se redujo en aproximadamente un 15%.
La producción de ácido oxálico se ha asociado con la patogenicidad de varias cepas
de Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia rolfsii y Sclerotinia ceptivorum (transparencia
80). El papel exacto de esta molécula durante la infección no está bien estudiado.
Durante los primeros estadios de la infección, y en las zonas marginales de la lesión,
el oxalato podría interactuar en sinergismo con enzimas pectolìticas o celulolíticas.
Dado que el oxalato es un potente quelante, podría quelar el calcio del pectato de
calcio en la pared celular del huesped, causando la maceración del tejido vegetal. La
importancia del ácido oxálico en la patogénesis ha sido demostrada en mutantes de S.
Sclerotium incapaces de producir ácido oxálico. Estas mutantes no resultaron
patogénicas en ensayos con Phaseolus vulgaris y Arabidopsis thaliana.
La transparencia 81 muestra resultados de un trabajo en que se clonó un gen de
oxalato decarboxylasa del hongo Collybia velutipes y se lo expresó en plantas de
tabaco y tomate. Las plantas desarrollaron un fenotipo normal y resistencia al
patógeno Sclerotinia sclerotiorum. En las fotografías se muestran los resultados de un
ensayo de infección con plantas sin transformar y con dos líneas transgénicas. El
ensayo se realizó sobre hojas separadas de la planta, infectadas con un disco de
micelio de 3 mm de diámetro. Se mantuvieron las hojas en contacto con el micelio bajo
un fotoperíodo de 16 h y en condiciones de 100% de humedad.
La regulación de la muerte celular es a menudo crucial en el desarrollo de las
interacciones planta-patógeno, ya sean compatibles o incompatibles. La naturaleza
puntual de estos procesos, los que pueden darse aún en una única célula, implican la
existencia de señales específicas y procesos bioquímicos autónomos en cada célula.
En animales, la muerte celular programada (PCD) o su equivalente morfológico, la
apoptósis, son casos de suicidio celular programado. Aunque la Rrespuesta
Hipersensible se asemeja a la PCD, el grado de similitud entre ambos procesos a nivel
bioquímico y regulatorio no ha sido completamente aclarado. En Uromyces vignae la
Respuesta Hipersensible ocurre acompañada de la degradación del ADN del
hospedador, un evento común durante la PCD. Para investigar las similitudes entre
ambos procesos, se observaron los efectos de genes inhibidores de apoptosis, entre
ellos, Bcl-2 y Bcl-xl humanos, CED-9 de nematodos, Op-IAP y p35 de baculovirus La
interferencia observada en la Respuesta Hipersensible tiene como consecuencia un
aumento de la resistencia a hongos necrotróficos, los que posiblemente utilizan los
propios procesos de muerte celular de la planta durante el proceso de infección.
Las transparencias 81-84 muestran resultados de un trabajo en el que se introdujo
resistencia antifúngica apoyándose en los conceptos expuestos en la transparencia
anterior. Se expresó el gen antiapoptótico p35 de baculovirus en plantas de tomate en
forma constitutiva. El producto de este gen inhibe específicamente una clase de
cisteín-proteasas denominadas caspasas, las que están involucradas en el clivaje de
varios sustratos importantes para la homeostasis celular. El mecanismos último por el
cual el gen p35 inhibe el proceso apoptótico es motivo de activa investigación. La
expresión del gen aumentó la resistencia de las plantas frente a los patógenos
necrotróficos Alternaria alternata, Colletotrichum coccodes, y Pseudomonas syringae
pv. tomato. En el caso de A. alternata, se conoce que la patogenicidad es determinada
principalmente por la toxina AAL, la que inhibe a la enzima ceramida sintetasas y, por
mecanismos aún no dilucidados, promueve la muerte celular. Se observó resistencia a
niveles de esta toxina en las raíces de las plantas transformadas unas 30 veces
superiores a las los tolerados por las plantas control.
Estrategias para obtener resistencia. Detoxificación de toxinas fúngicas
Las transparencias 85-87 muestran un ejemplo de detoxificaicioón de uetopina, toxina
producida por el hongo Eutypa lata que produce una seria enfermedad en vid,
mediante la sobreexpresión de un que codifica para una enzima capaz de reducir la
toxina a una forma no tóxica .
Estrategias para obtener resistencia. Silenciamiento postranscripcional
Las transparencias 88 y 89 esquematizan los primeros reportes de silenciamiento
génico de roya en plantas de trigo que sobre expresan genes de patogenicidad.