Para utilizar este servicio consultar La “Guía del usuario”

GUIA DE USUARIOS DE GENOTIPADO (STRs, VNTRs,…)
El uso de marcadores moleculares para la identificación de genotipos de interés mediante
microsatélites es susceptible de ser analizadas a través de la instrumentación existente en la
Unidad de Secuenciación. El servicio se encarga de la etapa final de esta técnica la cual
consiste en la cuantificación del tamaño de los fragmentos de DNA proporcionados por el
usuario y generados en el desarrollo de la técnica mencionada. Dicha cuantificación se
realiza en relación a estándares internos que se añaden a las muestras cuando se analizan
mediante secuenciación en electroforesis capilar. Se pueden utilizar hasta 5 marcadores
fluorescentes simultáneamente (uno de ellos reservado para el marcador de tamaños
moleculares) y combinar diferentes tamaños alélicos en la misma muestra por lo que por
cada capilar en una misma electroforesis se pueden analizar multitud de fragmentos
1. ENTREGA DE MUESTRAS.
El envío de las muestras puede realizarse de alguna de las siguientes formas:

Servicio de mensajería con portes pagados a la dirección:
Unidad de Genómica. Universidad de Córdoba.
Campus de Rabanales. Edificio Ramón y Cajal. 3ª Planta.
14071. Córdoba.
Tel: 957-218587 e-mail: [email protected]

Entrega directa en la Unidad.
Para la solicitud del Servicio de Análisis de fragmentos el horario de recepción de
muestras será de 9 a 14 horas los días laborables. Las muestras deberán de ir
acompañadas del “formulario de solicitud” (ver apartado de Formularios y Manuales)
correspondiente debidamente cumplimentada.
2. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS.
El Servicio realiza la etapa final de este tipo de análisis la cual consiste en la
cuantificación del tamaño de fragmentos de DNA proporcionados por el usuario con
relación a estándares internos mediante secuenciadores automáticos de capilares AbiPrism
310 o 3130XL.
2.1.Requisitos de las muestras.
a. Las muestras deben ser presentadas en placas de 96 pocillos con al menos 8-10 l
de la/s reacción/es de PCR en la que se halla realizado el/los marcajes. Para el
secuenciador ABI 310, las muestras se deberán cargar en las placas por filas. Para
el secuenciador multicapilar ABI 3130XL, las muestras se deberán cargar en las
placas por columnas. En el Servicio se les proporcionará todas las indicaciones
necesarias al respecto.
b. Indicar el rango de tamaños esperado para cada marcador y la combinación de
fluorocromos utilizados (ver “formulario de solicitud”).
-1-
c. El servicio dispone de los siguientes marcadores de tamaño: 350 TAMRA; 400HD
ROX; GS 1000 ROX, LIZ 500 Y LIZ 120 y de las siguientes matrices de análisis:
Nombre
Matriz
Azul
Verde
Amarillo
Rojo
C1
6-FAMTM
TET
HEXTM
TAMRATM
D
6-FAMTM
HEXTM
NEDTM
ROXTM
D**
6-FAMTM
VIC®
NEDTM
ROXTM
F
5-FAMTM
JOETM
NEDTM
ROXTM
PowerPLex®
JOE
FL
TMR
CXR
G5
6FAMTM
VIC®
NEDTM
PET®
LIZ®
E5
dR110
dR6G
dTAMRATM
dROXTM
LIZ®
Naranja
Utilidad de la Matriz
Genotipaje y
microsatélites
Genotipaje y
microsatélites
Genotipaje y
microsatélites
Genotipaje (AFLP’s;
Forense...)
Genotipaje Forense
Genotipaje y
microsatélites
SNPs (ABI PRISM®
SNaPshot® kit)
1: Sólo disponible para el 310.
d. Si el usuario necesitase otro Standard o matriz distinto de los disponibles contactar
con la Unidad.
e. Todos los marcadores fluorescentes son compatibles con el equipamiento
disponible en la Unidad (ABI310 y ABI3130) a excepción de TET para el cual no
existe filtro en el instrumento ABI3130 que permita su lectura.
f. En algunos casos puede ser necesario un paso de purificación de los fragmentos
(precipitación con etanol o purificación con "kits" específicos) antes del proceso de
electroforesis. Los precursores fluorescentes no incorporados pueden afectar a la
detección del estándar interno y dar lugar a datos no informativos. No se aceptan
muestras cubiertas con aceite mineral. Si la PCR se hizo bajo una capa de aceite el
usuario deberá retirarlo y remitir las muestras en placas limpias.
g. La estimación precisa de un tamaño depende del tipo de instrumento y pueden
haber diferencias entre analizadores (ABI Prism 310, 3130…), polímeros (POP4,
POP6, POP7…). Por ello puede ser recomendable evitar cambiar de tipo de
instrumento y química durante el desarrollo de un mismo proyecto.
2.2. Propiedades de los fluoroforos.
Como hemos visto en el apartado anterior, una de las principales ventajas de la
electroforesis capilar es la detección multicolor. A continuación, se detallan algunos
aspectos de utilidad a la hora de elegir un fluocromo u otro para marcar las parejas de
primers de interés.
Detección multicolor. Intensidad relativa de los fluorocromos más utilizados.
Dyes
5-FAM™
6-FAM™
JOE™
VIC®
HEX™
NED™
TAMRA/TAMRA™
PET®
ROX™
LIZ®
Max A (nm)
494
494
528
538
535
546
560
558
587
638
Max E (nm) Intensidad Rel
530
522
554
554
553
575
582
595
607
655
100
100
100
100
50
40
25
25
12
50
+
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-
Propiedades óptimas de los fluorcromos
a. Deben tener Amax lo más diferente posible para:
- Facilitar la generación de las matrices/calibración espectral
b. Deben ser lo más brillante posible:
- Aumentará la sensibilidad del ensayo
- Regla general: Azul>Verde >Amarillo > Rojo
c. Deben ser lo más estable posible
- VIC es más estable que el HEX
d. Su síntesis debe ser lo más fácil posible
- JOE y 5-FAM son los más complicados para sintetizar
3. ENTEGA DE RESULTADOS.
Los resultados se pueden enviar en formato electrónico a través de e-mail o en disco.
En este último caso, el soporte informático deberá ser suministrado junto con las muestras
y podrá ser recogido en la Unidad o ser enviado a portes debidos a la dirección que se
indique. Las muestras de análisis de fragmentos serán conservadas durante un mes. En caso
de que el usuario quiera recuperar dichas muestras podrá hacerlo personándose en la
Unidad dentro del plazo.
Programas para visualizar los ficheros:

Si el usuario no dispone de los softwares de análisis específicos (GeneScan,
Genotyper o GeneMapper), existe en la Unidad un ordenador con dichos
programas y a disposición del usuario que lo solicite. Además, existen algunos
visores que permiten la lectura de los datos y que se puede descargar gratuitamente
en las siguientes direcciones:
- Peak ScannerTM Software v1.0: http://www.appliedbiosystems.com/support/
software_community/free_ab_software.cfm
- Genescan View http://bmr.cribi.unipd.it/
4. INFORMACIÓN ADICIONAL.
El Servicio pone a disposición de los usuarios la asesoria científica-técnica necesaria
para ser usuarios de este Servicio asi como para la optimización de cualquier técnica
compatible con la instrumentación científica disponible en la Unidad de Genómica. En
caso de duda, aclaratorias sobre cualquier punto, etc... puede ponerse en contacto con la
Unidad a través de nuestros teléfonos o e-mail.
957 21 85 87 o [email protected]
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